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私たちは、胚ラットの脳組織を提供してくださったスティーブン・モス博士の研究室に感謝します。M.D.T.はオリジナルのプロトコルを設計しました。この研究は、国立衛生研究所(NIH)のP41組織工学リソースセンターの助成金EB002520によって資金提供されました。K.C.は、ドイツ研究財団(DFG)からのポスドクフェローシップ(CH 1400/2-1)の支援を受けました。

脳組織の分離プロトコルは、タフツ大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、実験動物の管理と使用に関する健康ガイド（施設内動物管理使用委員会B2011-45）の国立研究所に準拠していました。 1.シルク足場の準備<ol><li> カイコの繭からシルク溶液の調製以前に19,20説明したように。 <ol><li>はさみを使用して8等分に各繭をカットします。断片化された繭の5グラム約11繭を使用してください。 （15分） </li><li> 0.02 MのNa 2 CO 3溶液の2リットルを用意し、ホットプレートを用いて沸騰するためにそれを持って来ます。 （15分） </li><li>断片化された繭を5g秤量し、30分間のNa 2 CO 3溶液でそれらを沸騰。スパチュラで沸騰絹を数分おきにかき混ぜます。また、脱ガム引きと呼ばれるこのステップは、親水性タンパク質、セリシンから絹フィブロインを浄化します。 （30分） </li><li&gt;は、手でフィブロインを強く絞りと、残りのセリシンや化学物質を洗い流すために、蒸留水で少なくとも3回、それをすすいでください。 （5分） </li><li>シャーレに湿ったフィブロインを置き、流フードO / Nでフィブロインの抽出物を乾燥させます。 </li><li>次の日は、乾燥フィブロイン量を計量し、ガラスビーカー中フィブロインを配置します。 （15分） </li><li> 9.3 MのLiBr溶液にフィブロインを溶解させるために、4で乾燥したフィブロインの質量を乗じてのLiBr（ml単位）必要な量を計算ゆっくり絹フィブロインを超える臭化リチウム水溶液を注ぎ、スパチュラを使用して、すべてのフィブロイン繊維を浸します。蒸発を防止し、繊維を溶解させるために4時間60°Cでそれを配置するビーカーを覆います。 （15分） </li><li>シリンジを用いて、ビーカーからフィブロイン溶液を収集し、MWCO 3500透析カセットにロードします。 48時間蒸留水に対して透析を行ってください。水に数時間おきに変更します。 </li><li>シリンジを使用して、よりフィブロイン溶液を集めます20分間4℃で9,000 rpmで（〜12,700 XG）の2倍で50ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にカセット。各遠心分離工程の後に新しいチューブに上清を注ぎ、ペレットを捨てます。 （40分） </li><li>乾燥重量を推定することによりフィブロインの濃度を測定します。計量ボートに絹溶液1mlを注ぎます。 2時間60℃のオーブン中でサンプルを乾燥させます。乾燥した絹フィブロインを秤量し、シルク溶液の予想濃度が6-9％（w / v）のある100により得られた重みを乗算して絹フィブロイン溶液の濃度を計算します。 </li><li>蒸留水で希釈することにより（w / v）の6％絹濃度を調整します。 停止ポイント液体絹フィブロインは、密閉容器内で最大1ヶ月間、4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>シルク溶液から多孔質足場の調製。 <ol><li>顆粒を分離するために、粒状のNaClをふるいは、後のステップで使用される500-600μmで、大きさ。顆粒を破棄Sは500ミクロン以下および600ミクロンを超えるサイズに。 （15分） </li><li>ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）型（ 図1）への6％絹溶液30mlを注ぎます。静かに絹の上にふるいにかけられ、NaClの60グラムを散乱。塩の均一な層を得るために、コンテナをタップします。絹の重合に室温で48時間インキュベートします。 </li><li>重合を完了し、残りの液体を蒸発させるために1時間60℃のオーブンで足場を有するPTFE製の金型を置きます。 </li><li>塩を浸出するために48時間蒸留水2リットルを含むビーカー中のPTFE金型のコンテンツを配置します。水1日あたり2〜3回に変更します。塩が完全に溶出されたときに、金型からのスポンジ足場を削除ポイントの停止 ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。 </li><li>準備ができたら、直径5mmの生検パンチで足場を切り出します。高さが約2mmに到達するために足場をプレカット。 Puの直径2mmの生検パンチ（ 図2A）で足場の中心をNCH。 （1時間） </li><li> 。 ポイントの停止 （湿潤サイクル、121℃、20分）して滅菌水に浸漬した足場をオートクレーブ：スポンジ脱水から足場を防ぐために密閉容器中で4℃の水に浸漬し保存することができます。 </li><li>計画された細胞播種の前に、滅菌した0.1 mg / mlのポリ-D-リジン（PDL）溶液中で足場を浸します。 37℃で1時間インキュベートします。 </li><li>足場は非結合PDLを除去するためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 （30分） </li></ol></li></ol>ラット皮質ニューロンの2の単離<ol><li>承認された動物プロトコルが得られた後、以前にPacificiとペルッツィ27で説明したように日胚から18（E18）Sprague-Dawleyラットを皮質を解剖。 （2時間） </li><li> 3で20分間（ウシ膵臓から）、0.3％のDNアーゼIを有する0.25％トリプシン5mlの10皮質をインキュベート7°C。 </li><li> 1mg / mlの大豆タンパク質の等容積を添加することによってトリプシンを不活性化します。 </li><li>単一細胞懸濁液が生成されるまでピペットで10 mlのパスツールピペットを用いて皮質ダウン20回粉砕します。穏やかであると気泡の形成を避けます。 （10分） </li><li> 5分間127×gで細胞懸濁液を遠心。 </li><li>再懸濁培地10ml中の細胞ペレット（Neurobasal培地、1×B27サプリメント、1×グルタマックス、1％ペニシリン/ストレプトマイシン）。細胞を数えます。予想される細胞濃度が約2×10 7 / mlです。 （20分） </li></ol> 3.アセンブリと文化を構築<ol><li>細胞と足場播種。 <ol><li>無菌の足場と細胞培養フード内のすべての必要な調理器具を移動します。滅菌ピンセットを使用して、ウェルごとに足場を割り当てる、96ウェル細胞培養プレート中で足場を置きます。 （10分） </li><li>前の細胞種にそれらを平衡化するために、細胞培養培地中での足場を浸しる。 37℃で1時間インキュベートします。 （10分） </li><li>足場からのメディアの過剰を吸引します。 </li><li>細胞懸濁液/足場の100μLを適用します。 （10分） </li><li>足場への細胞接着を可能にするために37°のCO / Nで細胞をインキュベートします。 </li><li>翌朝は、非付着細胞を吸引し、200μl/ウェルの新鮮な培養培地を適用します。 （10分） </li></ol></li><li>コラーゲンマトリックスに埋め込む足場。 （2時間） <ol><li>私は氷の上にコラーゲン10倍PBS、水、1NのNaOHおよびラットの尾を置きます。製造者の指示に従って、コラーゲンのワーキング溶液を調製します。細胞を播種した構築物は、（1時間まで）準備ができるまで、氷上に維持します。 </li><li>インキュベーターから細胞を播種した絹の構造を削除し、メディアの過剰を吸引。 </li><li>滅菌ピンセットを使用すると、ウェルプレートの空のウェルに足場を転送し、3 mg / mlのコラーゲン溶液の100μlの各足場を浸します。バック組織培養プレートを置きコラーゲンの重合を可能にするために30分間インキュベーターインチ</li><li>ウェル/予熱した細胞培養培地100μlを適用します。文化一週間構築物は、培地の半分だけボリュームを交換することにより、毎日培地を交換すること。 </li></ol></li></ol> 4.顕微鏡分析<ol><li>生/死染色（1時間） <ol><li>ヨウ化プロピジウム（PI）を蒸留水に1mg / mlの（1.5ミリモル）のストック溶液を調製します。 </li><li>アセトン中のフルオレセインジアセテート（FDA）の2mg / mlのストック溶液を調製します。 </li><li> PBSで希釈した10μMのPIおよび0.15μM、FDAを含むワーキング溶液を調製します。水浴中で37℃に溶液を予め温めます。 </li><li>血清エステラーゼを除去するために、予め温めておいたPBSで細胞を洗浄。 PBSを吸引除去します。 </li><li> 2分間細胞に予め温めておいた作業溶液を適用し、PBSで洗ってください。 </li><li> FDAの元λ= 490 nは、画像への落射蛍光顕微鏡を使用する細胞（PIの元λ= 490 nmのは、EMλは570nmでの=mは、全角λ）は514nmのを=。染色は、40分かけて安定しています。長時間の染色は、細胞と細胞内でのPI / FDAの共局在によってPI取り込みに起因する非特異的な染色をもたらす可能性があります。 </li></ol></li><li>免疫染色<ol><li>培養物の所望の時点で、RTで30分間、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で細胞を固定します。 PFAの毒性に定着工程は、化学ヒュームフード内で行われるべきであるヒューム。 </li><li> 。 ポイントの停止 3倍PBSで足場を洗う：PFA-固定構築物は、さらなるステップに進む前に数日間4℃でPBS中に保存することができます。 </li><li> 4℃で一次抗体のO / Nを含有するPBS中の0.2％トリトン、0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）中で足場をインキュベートします。 </li><li>次の日は、染色溶液を廃棄し、結合していない一次抗体を除去するためにPBSで足場を3×3​​0分を洗います。 </li><li> 0.2％トリトン中に希釈した二次抗体とサンプル、PBS中の0.25％BSAで2インキュベートRTで時間。 </li><li>染色溶液を除去し、未結合の二次抗体を除去し、PBSで足場を3×3​​0分を洗います。 </li><li>画像1μmのステップとサンプルの100μmのZ-セクションを取ることによって20Xの目的とした共焦点顕微鏡を用いて足場。細い神経突起を可視化するために画像の解像度は、最小1,024×1024ピクセルでなければなりません。 </li></ol></li><li> RNA、DNAおよびタンパク質の単離 注：RNA、DNAおよびタンパク質の分離は、製造業者の説明書に従って商業AllPrep DNA / RNA /タンパク質ミニキットを用いて行われます。 <ol><li>滅菌ピンセットを使用すると、2ミリリットル滅菌チューブに培養プレートの外に足場を転送します。チューブあたり1足場を置きます。 </li><li>各チューブにRLT緩衝液200μlを追加します。 </li><li>滅菌microscissorsでそれを断片化することによって構造物を破砕。 </li><li>破壊された組織を均質化するために、スピンカラムにチューブの内容を転送します。微量でフルスピードで2分間スピン。これは、スピンカラムを通過する際に溶解物を均質化します。 </li><li>フロースルーを収集し、製造業者のプロトコルに従ってRNA、DNAおよびタンパク質を単離するために、すぐにそれを使用しています。 </li><li>核酸の収量互換性のある他の方法（例えば、光度計）を定量化します。 </li><li>製造業者の指示に従ってBCAタンパク質アッセイを使用して、タンパク質収量を定量化。波長562nmでマイクロプレートリーダーを用いたアッセイの結果を測定します。 注：細胞密度に関連して構築あたりの核酸およびタンパク質の予想収量は、 図4に示されています。 </li></ol></li></ol>

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このビデオ記事の出版は、コーニングが主催しています。

ここでは、区画化された3D脳様組織モデルを組み立てるためのガイドラインを説明しました。このモデルは、ニューロンの高密度に分極した培養によって特徴付けられ、その結果、形態学的に異なる2つのコンパートメントが発達します:1つは密に詰め込まれた細胞体を含み、もう1つは純粋な軸索ネットワークを含みます。全体として、足場の構造と成長パターンは、6つの層層と白質路を含む脳皮質組織を模倣しています21。
ドーナツ型のシルクタンパク質ベースの組織モデルにより、機械的特性、多彩な構造形態、ハイドロゲル充填剤、細胞成分の変更と調整が可能になります。したがって、この組織モデルは、幅広い研究のためのベースプラットフォームを確立します。シルクは、その生体適合性、水性ベースの処理、および堅牢な機械的および分解特性により、生体材料プラットフォームの好ましい候補です22。シルクマトリックスは、培養中の時間の経過に伴うコラーゲンゲルの収縮を軽減するための安定したアンカーとしても機能します。このモデルで使用される足場の絹濃度および多孔性などの特性は、最適な細胞増殖および機械的特性を達成するために以前に調整されており、その結果、脳のような組織弾力性が生じる18,23,24。実験の成功と再現性を確保するために、これらのパラメータを一定に保つことをお勧めします。
3Dニューロンネットワークの形成は、機械的特性の異なる2種類の生体材料、つまりニューロンの固定を提供する硬い足場と、3Dでの軸索の浸透と接続を可能にするより柔らかいゲルマトリックスを組み合わせることによって達成されました。シルク足場とソフトハイドロゲルの選択的な材料の好みは、軸索接続からニューロンを区画化するための基本的な原理を提供します。シルク足場の不活性な性質により、ニューロンの付着にはポリ-D-リジンによる官能基化が必要です。ただし、RGD25 またはフィブロネクチン26などの他の細胞接着促進因子を適用できます。3Dネットワーク形成を実現するには、ニューロンが足場に付着するとすぐに、シルク足場を適時にヒドロゲルで満たす必要があります。同様に、コラーゲンマトリックスフィラーは他のヒドロゲルに置き換えることができるため、軸索ネットワーク形成に対する3D細胞外環境の影響の研究が可能になり、ニューロン適合性の観点から新しいヒドロゲルを評価するためのプラットフォームとして機能します。さらに、ラットの皮質ニューロンとは別に、海馬ニューロンや人工多能性細胞(iPSc)由来のニューロンなどの他のニューロン源を利用することができます。さらに、この組織モデルは、グリア細胞をニューロンと一緒に含めることで異細胞相互作用を研究し、より複雑な脳様組織を構築するために使用できます。
前述のように、私たちのモデルは、細胞生存率、遺伝子発現、LC-MS/MS、電気生理学などのさまざまなアッセイを使用して、3D微小環境におけるニューロンの機能を評価するために利用でき、モデルの生理学的関連性を実証できます18。免疫染色や顕微鏡検査8、9、11 など、3D組織工学的構築物を評価するために頻繁に利用される他の方法も、細胞分布および軸索ネットワーク形成の程度を評価するために使用することができる。ただし、コラーゲンマトリックスの密度が高いため、抗体の浸透とイメージングの深さは数百マイクロメートルに制限されていることに注意する必要があります。さらに、信号対雑音比は、非特異的なバックグラウンド蛍光の影響を受ける可能性があります。これは、親油性細胞トレーサーと遺伝的に発現した蛍光タンパク質を使用することで克服でき、免疫染色の必要性が減ります11。あるいは、通常の単光子技術の代わりに2光子顕微鏡でイメージングを行うこともでき、これにより信号損失、光退色が軽減され、数百マイクロメートルの深さまで拡張できます。
要約すると、シルクとコラーゲンベースの脳様組織は、ニューロンネットワークを3Dで研究するための堅牢なプラットフォームを提供し、将来の神経障害のより高度なモデルの開発の出発点となります。評価モードとは無関係に、この組織モデルの相対的な単純さは、その有用性、成功、再現性を裏付けています。

中枢神経系（CNS）は、血管構造、機能性、感染性または変性を伴う種々の障害の影響を受けることができます。推定680万の人々が世界中で成長している社会経済的負担1を表し、神経学的障害の結果として毎年死にます。しかし、障害のほんの数は、利用可能な治療法があります。したがって、神経障害に罹患している患者のための革新的な治療戦略のための重要な必要性が存在します。残念ながら、多くのCNS標的治療による生理学的に関連する機能の読み出しと急性および慢性影響の評価を可能にしない不十分な前臨床研究モデルの利用、一部には、臨床試験中に失敗。 過去数十年にわたる重要な研究努力にもかかわらず、CNSの構造と機能についての未知の膨大な量があります。より多くの知識を得るために、動物モデルは、頻繁に私達でありますEDは、特に前臨床試験において、例えば、外傷性脳損傷（TBI）、または認知症のような病理学的状態をモデル化します。しかし、動物は、遺伝子発現および代謝2-4、CNSの解剖学だけでなく、機能の両方で人間とは大きく異なります。一方、2D インビトロ培養は、細胞生物学を研究するための一般的な方法であり、日常的に薬物発見のために使用されます。しかし、二次元細胞培養物は、人間の脳5-7と比較して複雑さおよび生理学的関連性を欠いています。動物モデルにより提供される2次元細胞培養研究や複雑さの低コストと単純に代わるはありませんが、3D組織工学は 、in vitroおよびin vivoのアプローチで 、2Dの間に存在するギャップを埋めるために改良された研究のモデルを生成することができます。 3D組織工学は、生体材料足場が提供する3D細胞 - 細胞相互作用および細胞外の合図によって達成より生理学的に関連する実験条件を提供します。 Desp3D培養物の値の背後にある重要な証拠をITEは、このような幹細胞由来オルガノイド文化8-10としてわずか数3D CNS組織モデルは、現在ありますが、11を neurospheroidsヒドロゲル培養12,13を分散させました。多層リソグラフィー14、および3D印刷15を含む高度な技術の方法は、肺、肝臓、及び腎臓の組織を研究するために利用されています。しかし、そのような皮質アーキテクチャと生物学を模倣するように区画ニューロンの成長を可能にする3D CNSモデルの欠如があります。神経細胞体から神経突起の分離された成長は、以前に軸索道のトレース、カルシウム流入、ネットワークアーキテクチャや活動の研究を可能にする微細加工16,17を使用することにより、2D培養で実証されています。この考えは、細胞体と軸索路は、脳18の階層化アーキテクチャを模倣異なる区画に配置されている3D偏神経組織を開発するために私たちに影響を与えました</sup&gt;。我々のアプローチは、限られた容量で高密度の細胞を収容し、コラーゲンゲルに密な軸索ネットワークの伸長を可能にするユニークなシルク足場の設計の使用に基づいています。ここでは、足場の製造および神経文化などの脳のような組織の完全な組み立て手順を示しています。

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500透析カセット&nbsp;</td><td>サーモフィッシャー</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>加熱プレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>アイソテンプ</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5804 R</td><td>エッペンドルフ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ふるい</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td><td>No. 270, No. 35, No. 30</td></tr><tr><td>自社製 PTFE 金型</td><td></td><td></td><td>(Figure 1) 直径 10 cm、高さ 2 cm</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ5&#160;mm</td><td>ワールド精密機器</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>生検パンチ2&#160;mm</td><td>ワールド精密機器</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>最終濃度10&#160;&#956;g/ml、水PBSに溶かした</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ロシュ</td><td>10104159001</td><td>最終濃度 0.3%</td></tr><tr><td>大豆タンパク質</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>最終濃度 1&#160;mg / ml</td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>37&#160までウォームアップします。&deg;C使用前の</td></tr><tr><td>B27サプリメント50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリンストレプトマイシン</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲンI、ラットテール、100&#160;mg</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td>最終濃度 3&#160;mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>腐食性</td></tr>ヨ<tr><td>ウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>毒性</td></tr>フル<tr><td>オレセインジアセテート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>オリンパス MVX10</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>毒性、最終濃度 4%</td></tr> <tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>抗β;IIIチューブリン抗体&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>ウサギ 1:500</td></tr><tr><td>抗ウサギ Alexa-546</td><td>分子プローブ</td><td>A11010</td><td>ヤギ 1:250</td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>ライカ SP2 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td>対物レンズ 20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール ピュア</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>E7023&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 UV-Vis 分光光度計</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイ</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー Spectramax M2</td><td>分子デバイス</td><td></td><td>吸光度 562 nm</td></tr><tr><td>マイクロハサミ エコノミー バンナス型</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

偏神経組織のエンジニア3dシルクコラーゲンベースモデル

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

脳の解剖学、組成、機能を解読するための多大な努力にもかかわらず、それは人体の最も理解されていない器官のままです。神経系をより深く理解するために、科学者は、組織工学的アプローチを使用して、基本的なビルディングブロックからin vitroで組織を組み立てることにより、組織を単純化して再構築することを目指しています。私たちのグループは、皮質の白質と灰白質に似た、シルクとコラーゲンをベースとした組織工学による脳の3D型モデルを開発しました。このモデルは、ラットの脳由来ニューロンをあらかじめ播種した絹の多孔質スポンジを、柔らかいコラーゲンマトリックスに浸したものです。分極したニューロンの成長とネットワーク形成は、軸索と細胞体の別々の局在化で観察されます。このコンパートメント構造により、天然の神経組織を模倣したニッチのユニークな開発が可能になり、ニューロンネットワークの組み立て、軸索の誘導、細胞間および細胞-マトリックスの相互作用、および電気的機能に関する研究が可能になります。

ドーナツ状にソリッドシルクスポンジのプレカットは、神経組織（ 図2A）に似た区画化アーキテクチャを実現するために、ユニークでシンプルなアイデアを表しています。小容積内の高細胞密度のシーディング及び成長を可能にする非常に高い表面積（2×10 7 / mlで）（ 図2B）で約500μmの結果の細孔径を有する足場の高度に多孔性の構造。さらに、足場の高気孔率は、延長時間枠を超える高密度の細胞培養物の優れた生存性が得られ栄養素や老廃物の無制限の拡散を可能にします。神経細胞を播種時に迅速かつ均一に足場孔の表面に付着します。 細胞接着が完了し、細胞が絹基板上に平衡化された後、スポンジ足場は、軸索ネットワーク形成（ 図3では 、3D環境を提供するために、柔らかいコラーゲンマトリックスが充填されています</strong&gt;）。ニューロンが唯一の2次元面（ 図3B）で見られるような混合ネットワークでは、得られた細孔の表面に拡張を成長するにつれてコラーゲンマトリックスが存在しない場合には、軸索および細胞体の区画化することはできません。これとは対照的に、コラーゲンゲルは、神経細胞体はシルク足場（ 図3C）に付着したままながら、3Dで大規模な軸索 ​​伸長をサポートしている網目構造を提供します。この成長パターンは、細胞体および純粋な軸索 ​​ネットワーク、脳内の皮質の灰白質と白質に似ている（ 図3D）の区画につながります。 顕微鏡から離れて、構築物は、実験の背後にある問題に応じて、他の方法18の様々な評価することができます。例えば、構築物からのDNA、RNAおよびタンパク質の単離を容易に市販のキット（ 図4）を用いて行うことができます。核酸およびタンパク質PEの収率R構築物は、最初は絹の足場に播種した細胞の数によって異なります。より多くの細胞を播種したDNA、RNAおよびタンパク質の収率が高いです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> シルクスポンジ足場調製のために使用される図1のPTFE金型寸法：直径10cm、2cmの高さ<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> 図2. 3D脳のような組織モデル。（A）は、多孔質シルクスポンジ足場。前コラーゲン（緑生細胞、赤死細胞）を埋め込 ​​むシルク足場に播種時の1日目でのニューロンの（B）生/死染色。右側のパネルは、MAを表示赤いフレームでキャプチャエリアのgnification。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> 図3.神経3D脳のような組織モデルで区画さ伸長（A）足場コンパートメント：赤細胞体コンパートメント、青軸索コンパートメント。 （B）コラーゲン埋め込 ​​み前に播種時の1日目に神経成長パターン。 （C）。細胞体コンパートメントに播種時の7日目の神経突起伸長。 （D）軸索の区画に播種時の7日目の神経突起伸長。 βIIITubulin -グリーン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">これの拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください</a>図。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> （A）RNAおよびDNA、および足場ごとに播種された細胞の量に関連した構造物あたり（B）は、タンパク質の図4の期待利回り（±SD、n = 5）であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

脳の複雑な行動についての洞察には、高度な研究ツールが必要です。ここでは、脳のような構造に似た神経組織の新しいシルクコラーゲンベースの3Dエンジニアリングモデルを示します。このモデルは、ニューロンネットワークの組み立て、軸索誘導、細胞間相互作用、および電気的活動の研究に使用できます。

偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

この手順の全体的な目的は、脳模倣3D組織のエンジニアリングプロセスを実証することです。まず、ソルトリーチング法を用いて絹溶液から多孔質スキャフォールドを作製します。次に、スキャフォールドをドーナツ形状にプレカットし、滅菌およびポリリシン（PDL）によるコーティングを行うことで、細胞培養に向けた準備を整えます。次に、調製したスキャフォールドに、新鮮に単離したラット一次皮質ニューロンを播種します。最後のステップは、スキャフォールドをコラーゲンで包埋し、培養プレートに移すことです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、神経の成長と神経ネットワークの発達を確認します。この技術の意義は、パーキンソン病やアルツハイマー病の新しい研究モデルを開発するための基礎として利用できるため、脳疾患の治療や診断へと広がります。開始前に、テキストプロトコルに従って6%シルク溶液を調製し、4°Cで保存してください。多孔質スキャフォールドを調製するには、まず粒状の塩化ナトリウムを篩い、直径500から600 µmの粒子を回収します。30 millilitersのシルク溶液をポリテトラフルオロエチレン（PTFE）製モールドに注ぎ、その上に60 gramsの篩い分けした塩化ナトリウムを均等に散布します。シルクを重合させるため、室温で48時間インキュベートします。シルクの架橋を完了させ、残った液体を蒸発させるため、型に入ったスキャフォールドを60°Cに設定したオーブンで1時間放置します。次に、型とスキャフォールドの組み合わせを2Lの蒸留水が入ったビーカーに48時間浸漬させます。塩を溶出させるため、1日に2〜3回水を交換してください。型からスキャフォールドを取り出し、小さく裁断します。まず、直径5 mmのバイオプシーパンチを用いて切り出します。次に、スキャフォールドの高さを2 mmに切り揃え、各ピースの中心部を直径2 mmのバイオプシーパンチで除去します。スキャフォールドをウェットサイクルで20分間オートクレーブ滅菌します。細胞培養フード内で、滅菌済みのピンセット、細胞培養培地、およびオートクレーブ済みのスキャフォールドを準備します。96ウェルプレートを包装から取り出し、スキャフォールドを播種するために内部に配置します。まず、各ウェルに滅菌済みスキャフォールドを1つずつ配置します。96ウェルプレートに細胞培養液を加えてスキャフォールドを浸し、組織培養インキュベーター内で37 °Cで少なくとも30分間インキュベートして平衡化させます。インキュベート後、スキャフォールドから余分な培地を吸引除去します。次に、スキャフォールドあたり100 µLのNeurobasal mediumに含まれる2×10⁶個のラット皮質ニューロン細胞を添加します。プレートをインキュベーターに戻し、細胞がスキャフォールドに接着するように一晩静置します。翌朝に。非接着細胞を慎重に吸引し、200 µLの新鮮な細胞培養培地と交換します。37 °Cで短時間インキュベートします。次に、滅菌ピンセットを用いてウェルから培地を吸引します。細胞を含むスキャフォールドを96ウェルプレートの空のウェルに移し、各スキャフォールドに、新しく希釈した氷冷 3 mg/mL ラットテイルコラーゲン溶液を 100 µL ずつ加えます。細胞を37 °C のインキュベーターに戻し、30分間コラーゲンを重合させます。プレートをインキュベーターから取り出し、1ウェルあたり100 µLの予熱した細胞培養培地を添加します。プレートをインキュベーターに戻し、目的の細胞増殖期間まで培養します。その間、最大1週間まで、毎日各ウェルの培地の半分を新鮮な培地と交換してください。これらの高多孔性スキャフォールドでは、図に示すように神経細胞を高密度で培養することが可能です。以下に細胞生存率の結果を示します。播種から1日後、フルオレセインジアセテートで標識された生存細胞が緑色に、プロピジウムヨードで標識された細胞がシルクスキャフォールド内で確認されます。赤色で示されているのは、低倍率で観察される生存細胞の高い割合です。この図は、ドーナツ型のスキャフォールド内で神経細胞体と軸索突起が区画化されている様子を示しています。細胞播種から1日後、神経細胞体はシルクスキャフォールドに付着したままであり、β3-tubulinの免疫染色により緑色に観察されます。予想通り、培養7日目までに細胞が足場内に高密度に定着しています。対照的に、足場中央の中空部にあるコラーゲンマトリックスは、広範な軸索伸長を支持しています。ここに示されているのが、軸索のネットワークです。播種から7日後。この動画では、β3-tubulin染色により標識された神経ネットワーク細胞を含む、スキャフォールド中央のコラーゲンウィンドウの共焦点Zスキャンを示しています。このビデオを視聴することで、3次元の脳様組織構築物の作製方法について十分に理解できるはずです。

engineered-3d-silk-collagen-based-model-of-polarized-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、シルクコラーゲンの足場を利用した3次元分極神経組織モデルの作成を紹介しています。多孔質の絹の足場に神経細胞を播種し、細胞接着のためのインキュベーションを行い、足場にコラーゲンを埋め込むプロセスを詳しく説明し、3D分極神経組織モデルの形成における支持コラーゲンマトリックスの重要性を強調しています。...

絹コラーゲンを用いた分極神経組織の人工3Dモデルの開発

出典: Struzyna, L. A. et al., 神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスピレーションを得た 3 次元微小組織工学ニューラル ネットワーク。J. Vis.

ハイドロゲルベースのマイクロカラムを用いたマイクロ組織工学ニューラルネットワークの開発

この研究では、3Dニューロン培養物が平面微小電極アレイ(MEA)に結合される新しい実験モデルpresented.

微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的な<em&gt;インビトロ</em&gt;実験モデル

この原稿では、微細組織工学ニューラルネットワークの作成について詳しく述べる。三次元のミクロンサイズの構造物は、管状ヒドロゲルに包まれた凝集ニューロン集団にまたがる長い整列した軸索路からなる。これらの生存足場は、神経回路を再構成または調節するための機能的中継として、または灰白色物質の神経解剖学を模倣するバイオフィリックテストベッドとして役立ち得る。...

神経系の再構築、変調、モデリングのための解剖学的にインスパイアされた3次元マイクロ組織工学ニューラルネットワーク

縦一直線に並べられたアストロ...

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。...

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

本論文では、電界(EF)に曝露された繊維状導電材料の有限元素モデルを構築するための戦略を示す。モデルは、そのような材料に播種された細胞が受け取る電気入力を推定し、足場の構成材料特性、構造または向きを変更した場合の影響を評価するために使用することができる。...

細胞電微小環境の有限元素モデリング

この論文では、神経芽腫細胞株を以前に説明した3次元コラーゲンベースの足場に播種し、所定の時間枠で細胞増殖を維持し、さまざまな実験目的を満たすために適応可能な、いくつかの細胞増殖および細胞挙動分析およびダウンストリームアプリケーション用の足場を回収するために必要な手順をリストしています。...

コラーゲンベースの足場を用いた神経芽細胞腫の3次元 in vitro 生体模倣モデル

この研究では、自己修復アニーリング可能な粒子-細胞外マトリックス複合材料内の神経幹細胞の自由形状埋め込み3D印刷のプロトコルについて説明します。このプロトコルは、相互接続されたヒト神経組織構築物のプログラム可能なパターニングを高い忠実度で可能にします。...

ヒト神経構築物の埋め込み3D印刷のためのミクロゲル-細胞外マトリックス複合サポート

ここでは、iPS細胞由来のニューロンとアストロサイトの3Dバイオプリント共培養を行うためのプロトコルを紹介します。この共培養モデルは、96ウェルまたは384ウェルフォーマットのハイドロゲル足場内で生成され、7日以内に高いポストプリント生存率と神経突起伸長を示し、両方の細胞タイプの成熟マーカーの発現を示します。...

スクリーニング応用のためのヒトiPS細胞由来神経細胞-アストロサイト共培養の3次元バイオプリンティング

学ぼう、シルクコラーゲンを用いた3D神経組織エンジニアリング手法。塩浸出法で作製した多孔質スキャフォールドにラット大脳皮質ニューロンを播種し、コラーゲン包埋で軸索誘導と神経ネットワーク形成を可視化する。この技術はパーキンソン病やアルツハイマー病の研究モデル開発に応用可能です。

偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

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