偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

この手順の全体的な目標は、3D脳様組織の工学プロセスを実証することです。これは、最初に塩浸出技術を使用して絹溶液から多孔質の足場を準備することによって達成されます。2番目のステップは、足場をドーナツ型に事前にカットし、滅菌してポリデリシンまたはPDLでコーティングすることにより、細胞培養の準備

次に、調製した足場に、新たに単離された初代ラット皮質ニューロンを播種する。最後のステップは、足場にコラーゲンを埋め込み、培養プレートに移すことです。最終的に、免疫蛍光顕微鏡法は、神経ネットワークの神経成長と発達を示すために使用されます。

この技術の意味は、パーキンソン病やアルツハイマー病の新しい研究モデルを開発するための基礎として使用できるため、脳に影響を与える疾患の治療または診断にまで及びます。始める前に、テキストプロトコルで説明されているように6%silk溶液を準備し、摂氏4度で保存します。多孔質の足場を準備するには、まず粒状の塩化ナトリウムをふるいにかけ、直径500〜600マイクロメートルの顆粒を収集します。

30ミリリットルの絹溶液をポリテトラフルオロエチレンまたはPTFE型に注ぎ、次に60グラムの塩化ナトリウムを均等にふるいにかけます。解決策。室温で48時間インキュベートして、シルクを重合します。

カビの入った足場を60°Cに設定されたオーブンに1時間置いて、シルクの架橋を完了し、残っている液体を蒸発させます。次に、型と足場の組み合わせを2リットルの蒸留水ビーカーに48時間浸します。塩分を浸出させるには、1日に2〜3回水を交換します。

足場を型から取り外し、細かく切ります。まず、直径5mmの生検パンチで。次に、足場を高さ2ミリメートルにカットし、2ミリメートルの生検パンチで各ピースから中心を取り外します。

足場を湿式サイクルで20分間オートクレーブします。細胞培養フードの内側に、滅菌した鉗子、細胞培養培地、およびオートクレーブの足場を置きます。96ウェルプレートをラッピングから取り出し、中に入れて足場を播種します。

まず、井戸ごとに1つの滅菌足場を配置します。96ウェルプレートに細胞培養液を加えて足場を浸漬し、組織培養インキュベーターで摂氏37度でインキュベートして、少なくとも30分間平衡化します。インキュベーション後、足場から余分な培地を吸引します。

次に、足場ごとに100マイクロリットルの神経基礎培地中の6つのラット皮質ニューロン細胞に10の2倍を加えます。プレートをインキュベーターに戻し、細胞が足場に付着するまで一晩放置します。翌朝に。

付着していない細胞を慎重に吸引し、200マイクロリットルの新鮮な細胞培養物と交換します。中程度。摂氏37度で短時間インキュベートします。次に、滅菌鉗子を使用してウェルから培地を吸引します。

細胞を含む足場を96の空のウェルに移します。その後、新たに希釈した氷冷の100マイクロリットルで各足場にウェルプレート、ミリリットルあたり3ミリグラムのラットテールコラーゲン溶液。細胞を摂氏37度のインキュベーターに戻し、コラーゲンの重合を30分間可能にします。

インキュベーターからプレートを取り出し、100マイクロリットルの予熱細胞培養液を加えます。井戸リターンあたりの中程度。プレートをインキュベーターに回し、細胞増殖の希望の期間、各ウェルの培地の半分を最大1週間毎日新鮮な培地に交換します。

これらの多孔質の足場では、ニューロン細胞を高密度に培養することができます。これが細胞生存率の結果です。播種から1日後、蛍光ジアセテートで標識された生細胞が緑色およびヨウ化プロピジウムおよび絹の足場に現れます。

赤で示すのは、低倍率で観察される生細胞の割合が高いことに注目してください。この図は、ドーナツ型の足場内のニューロン細胞体と軸索突起のコンパートメント化を示しています。ここで見られるように、ニューロンの細胞体は、播種細胞がβ-3チューブリンの免疫染色され、緑色に見える1日後に見られるように、絹の足場に付着したままです。

予想通り、細胞は培養の7日目までに足場に密集しています。対照的に、足場の中央のくぼみにあるコラーゲンマトリックスは、広範な軸索の成長をサポートします。ここに示されているのは軸索メッシュワークです。

播種から7日後。この動画は、β 3チューブリンを染色することにより標識された神経ネットワーク細胞を含む足場の中央のコラーゲン窓の共焦点Zスキャンを示しています。このビデオを見れば、3Dの脳のような組織構造をどのように設定するかをよく理解できるはずです。