Name: マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶマイクロ流体ゲニピン堆積技術による血管筋薄膜の長期培養法。PDMS基板上にゲニピンとフィブロネクチンを精密パターニングし、血管平滑筋細胞の構造維持と収縮機能を2週間保持する体外モデルを構築します。

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私たちは、米国心臓協会の科学者開発助成金、13SDG14670062(PWA)、およびミネソタ大学博士論文フェローシップ(ESH)からの財政的支援に感謝します。また、ミネソタ大学のミネソタナノセンター(MNC)の微細加工リソースと大学イメージングセンター(UIC)の画像処理リソースにも感謝しています。この作業の一部は、ミネソタ大学のキャラクタリゼーションファシリティで実施され、MRSプログラムを通じてNSFから部分的な支援を受けています。

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<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、慢性血管疾患経路1,23,24の拡張実験時間は、より一般的なことができ、以前に開発VMTF技術に基づいて構築されたプロトコルを提示します。これを達成するために、我々は、以前にMTF収縮実験で使用するための改良された血管組織の生存率で操作動脈ラメラを得るために、マイクロ流体堆積技術を用いて、PDMS基板11の長期的な官能化を提供することが示されているゲニピンを、微細。マケインら 。関連MTFモデル25に数週間のための工学的心臓組織の拡張文化のための代替micromoldedゼラチンハイドロゲル基材を開発しました。 このプロトコルは、正常に2週間にわたって動脈ラメラ構造（図2）と機能（図3）模倣vMTFsを得ました。提示されたプロトコルが正常に完了し、所望の解像度が得られているが疾患関連の時間経過の拡張培養時間のULT（ 例えば、脳血管攣縮の病理学的効果は14日まで26持続する）、いくつ...

血管のような脳血管攣縮1,2、3高血圧、アテローム性動脈硬化症および4のような疾患、徐々に開発、自然界に一般的に慢性的であり、血管平滑筋細胞（VSMC）の機能不全の力の生成を伴います。我々は、in vivoモデルよりも実験条件をより詳細に制御を用いたin vitroの方法で使用して、これらの遅い進行血管機能障害を研究することを目指しています。我々は以前のin vitroの機能的収縮を測定するために、血管、筋肉薄膜（vMTFs）を開発した心血管組織5を設計しますが、この方法は、比較的短期間の研究に限定されていました。ここでは、長期的な測定のために私たちの前のVMTF技術を拡張基板修正手法を提示します。 内皮は、全体の血管機能でも重要であるが、人工動脈ラメラは、血管の変化を評価するための有用なモデルシステムを提供します疾患の進行中に収縮。機能性血管疾患の組織モデルを設計するために、動脈ラメラの構造と機能、血管の収縮基本ユニットの両方が、忠実に再現されている必要があります。動脈ラメラ、エラスチン6のシートによって分離された収縮のVSMCの円周方向に整列されたシート同心です。ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板上に細胞外マトリックス（ECM）タンパク質のマイクロコンタクト印刷は、予め整列心臓血管組織5,7-10を模倣するために、組織の組織のガイダンスキューを提供するために使用されています。しかし、マイクロコンタクト印刷を使用してパターン化組織が慢性試験でその適用を制限し、培養液中の3-4日後に整合性を失う可能性があります。このプロトコルは、新しいマイクロ流体堆積技術を用いて、前のマイクロコンタクト印刷技術を置き換えることによって、この問題に対する解決策を提供します。 Genchi らゲニピンとfにPDMS基板を改変ound文化11で1月に筋細胞の生存率を延長しました。ここでは、PDMS上にパターン血管平滑筋細胞の培養物を拡張するために同様のアプローチを使用します。ゲニピン、クチナシ果実の自然加水分解誘導体は、同様の架橋剤および組織修復12,13とECMの変更14の分野における生体材料としての使用の増加に比べ、その比較的低い毒性のために、基板の修正のための望ましい候補であります15。このプロトコルでは、フィブロネクチンは、前のマイクロコンタクトプリント法のように、細胞のガイダンスキューとして利用されます。しかしながら、ゲニピンは、フィブロネクチンのパターニングの前にPDMS基板上に堆積されます。細胞がパターン化されたマトリックスを分解するとしてこのように、添付のVSMCから新たに合成されたECMは、ゲニピンでコーティングされたPDMS基板に結合することができます。 このプロトコルは、2段階ゲニピンとECM沈着のためのマイクロ流体送達装置を利用します。マイクロ流体デバイスの模倣体の設計microco以前の研究16において操作動脈ラメラに使用ntact印刷パターン。従って、我々は、このプロトコルが正常に生体内の構造と動脈ラメラの収縮機能に高度に整列を再現動脈ラメラ模倣を得ことを期待しています。我々はまた、ゲニピンは、インビトロ血管疾患モデルにおける長期的に適した基板修飾化合物であることを確認するために、組織の収縮性を評価します。

<table><tbody><tr><td>カバーガラス染色ラック</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>ポリ(N-イソ-プロピルアクリルアミド) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-ブタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a</td><td>>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>蛍光マイクロビーズ</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td> 株式会社ウェーハ<td>ワールド</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>フォトレジスト&nbsp;</td><td>マイクロケム株式会社</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>接触式マスクアライナー</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>トリデカフルーロ-トリクロロシラン</td><td>UCTスペシャリティーズ株式会社</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>外科用生検パンチ</td><td>インテグラライフサイエンス株式会社</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a</td><td>>10010622</td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>コーニング株式会社</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>臍帯動脈平滑筋細胞</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Tyrodeの溶液成分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>各種</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>温度制御プラットフォーム</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>エンドセリン-1</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</A></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</A></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

>jove_content<血管疾患の進行の慢性的な性質は、疾患に関連する時間スケールで生理学的および病理学的血管の挙動をシミュレートする実験的技術の開発を必要とします。これまで、マイクロコンタクトプリンティングは、組織組織のガイダンスキューとして細胞外マトリックスタンパク質をパターニングすることにより、2次元の機能的な動脈模倣物を製造するために使用されてきました。血管筋薄膜は、これらの機能的収縮性を評価するためにこれらの模倣を利用しました。ただし、使用されるマイクロコンタクト印刷製造技術には、通常、疎水性PDMS基板が組み込まれています。組織がその下にある細胞外マトリックスをひっくり返すと、新しいタンパク質は、疎水性アミノ酸残基を疎水性PDMS表面に露出させて付着させるために、構造変化または変性を受ける必要があり、その結果、マトリックスタンパク質の生理活性が変化し、層間剥離が起こり、組織の死が生じます。
ここでは、架橋剤化合物のジェニピンのパターニングのためのマイクロ流体堆積技術を紹介します。ジェニピンは、パターン化された組織とPDMS基質との間の仲介役として機能し、細胞が新たに合成された細胞外マトリックスタンパク質をより親水性な表面に沈着させ、PDMS基質に付着したままにすることができます。また、細胞外マトリックスタンパク質を沈着したゲニピンに直接パターン化できることも示し、操作された組織構造のディクテーションを可能にすることも示しています。この技術で作製した組織は、血管筋薄膜モデルにおいて、血管平滑筋組織の構造的整列と収縮機能の両方で高い忠実度を示します。この技術は、他の細胞タイプを使用して拡張することができ、慢性組織および臓器レベルの機能の将来の研究のためのフレームワークを提供します。

この研究の主な目的は、疎水性のPDMS基板上にマイクロパターンのVSMCの生存を延長することでした。これは、PDMS（図1）上にパターンゲニピンおよびフィブロネクチンを堆積させるために、マイクロ流体送達システムを組み込むことによって達成されました。マイクロ流体送達を用いECMタンパク質の沈着は、ゲニピンおよびフィブロネクチン（図1D）のライン間の裸のPDMSとのチャネルパターンの忠実度の高い転送を得ました。以前のマイクロコンタクトプリント法5,10,16と同様の動脈ラメラのインビボ構造を模倣付着した細胞（図1E）フォームコンフルエントな単層（ 図2）。これらの組織は、その応力VMTF技術を用いて測定した（図3）に応答して、収縮構造を、得ました。 2週間にわたって組織の生存率の定性的評価は、ゲニピンMODIFIに最小限の劣化を示しました編基板（図2A）。</s...

私たちは、PDMS基質上にパターン化されたゲニピンとフィブロネクチンをマイクロ流体で堆積させる方法を提示します。これにより、血管平滑筋の細胞密度の高い組織の生存能力が延長されます。この組織作製法は、従来の血管筋薄膜技術と組み合わされ、疾患に関連する時間経過における血管の収縮性を測定する。

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

本手順の全体的な目的は、疾患に関連する時間スケールにおける脳血管痙攣などの血管機能不全のメカニズムを研究するために使用できる、平滑筋収縮機能のin vitroモデルを構築することです。これは、まずカバーガラスにPIAMとPDMSを順次スピンコートしてエラストマー基板を作製し、長期的に維持可能な血管筋薄膜を用いることで達成されます。第2のステップでは、マイクロ流体堆積デバイスを使用して、ゲニンとフィブロネクチンを表面に順次堆積させます。血管・筋肉薄膜上での組織の自己組織化に誘導キューを提供するため、最終ステップとして、サンプルのイメージングを行いながら血管・筋肉薄膜に収縮と弛緩を誘導させる収縮アッセイを実施します。最終的に、このアプローチにより、培養状態で最大2週間、構造的忠実性と機能的な収縮性を維持する組織が得られます。マイクロコンタクトプリント法を用いた筋肉薄膜などの既存手法に対する本手法の主な利点は、従来の手法で構築された組織が3〜4日後に分解し始めるのに対し、組織の完全性と機能的な収縮性が数週間にわたって維持されることです。培養において、本手法は、慢性疾患の進行に伴い動脈の機能的メカニズムがどのように変化するかなど、血管疾患における重要な課題を研究するためのプラットフォームを提供します。ここでは血管力学について研究していますが、本手法は、心筋や骨格筋の機能を再現するためのオルガンチップ技術など、他のモデル臓器系にも応用可能です。私たちが本手法を考案したのは、緩徐に進行する血管機能不全の研究を目指した際、既存の手法では血管平滑筋細胞の機能を定量化できなかったか、あるいは十分な期間にわたって完全性を維持できなかったためです。Jinマイクロ流体堆積法は、マイクロコンタクトプリンティングと同様の方法で細胞の自己組織化のためのテンプレートを提供しますが、同時に、血管リモデリングの研究に適した時間スケールで、パターン化された組織がその構造と完全性を維持することを可能にします。まず、付属のテキストプロトコルに従って、直径25 mmのガラスカバースリップの一群を洗浄します。洗浄したカバースリップの側面に粘着テープを貼り、中央にガラスの帯状の部分が露出するようにして、端を覆います。次に、カバースリップをディッシュから切り離し、1枚ずつスピンコート用チャックに設置します。ピンセットを使用して、1-ブタノールに溶解させた10% poly N-isopropylacrylamide（poly PAMまたはPIAMとも呼ばれる）溶液を150 µL加えます。カバースリップの露出部分が完全に覆われていることを確認してください。次に、スピンコーターの電源を入れ、10秒かけて回転速度を3000 RPMまで上げます。5秒間待機した後、さらに10秒かけて6,000 RPMまで上げます。6,000 RPMで1分間保持し、その後10秒かけて3000 RPMまで速度を下げます。スピンコーティングサイクルを終了する前に、そのまま5秒間保持します。乾燥後、すべてのカバーガラスから粘着テープを慎重に取り除き、ガラスカバースリップの中央に薄いPIAMコーティング層が残った状態でカバーガラス全体を露出させます。次に、各カバーに脱気済みPDMSの層をスピンコートします。これらをスリップさせ、90 °Cのオーブンで少なくとも1.5時間キュアします。組織マイクロ流体フォトマスクを設計し、付属のテキストプロトコルに従ってパターン化されたシリコンウェハーを準備します。パターン化後、標準的な手法を用いてウェハーをエッチングし、構造面を上にしてペトリ皿に配置します。次に、PDMS 100 gramsを架橋剤との比率10:1で混合し、パターン形成済みのウェハーを完全に均一に覆うように、PDMSをディッシュに流し込みます。ディッシュを真空デシケーターに入れ、すべての気泡が除去されるまで約30分間脱気します。その後、ディッシュに入れたままのPDMSを90 °Cで少なくとも1.5時間硬化させます。硬化後、余分なPDMSを切り取り、パターンが形成されたPDMSをウェハーのパターン側からゆっくりと剥がします。カミソリを用いてパターンの周囲の余分なPDMSを切り取り、後の工程でのデバイス取り出しを容易にするため、デバイスを長方形に整形します。次に、1 mmの外科用生検パンチを使用して、入口孔と出口孔の両方を形成します。使用前に、マイクロ流体デバイスを70%エタノール中で30分以上超音波洗浄します。最大10枚の血管平滑筋薄膜基質カバーガラスを紫外線オゾンクリーナーに入れ、8分間処理します。次に、5 mgの凍結乾燥geninが入った容器に滅菌二回蒸留水を1 mL加え、5 mg/mLのgenin溶液を調製します。ボルテックスミキサーを用いて溶液を混合し、バイアルを室温で少なくとも30分間放置します。洗浄済みのマイクロ流体デバイスの機能面を下にして、各カバーの上に配置します。一つずつ慎重に滑り込ませてください。デバイスをしっかりと押し付け、PDMSコーティング済みのカバーガラスとの密閉性を確保します。デバイスのプライミングのため、各デバイスの入口に70% ethanolを1滴素早く滴下します。5〜10分後、入口にある過剰なethanolを慎重に吸引し、直ちに約100 microlitersのPBSに置き換えます。真空ポンプを用いてPBSをデバイスの出口まで吸引し、エタノールを洗い流します。入口に少量のPBSが残るまで吸引を続けてください。その後、各入口に5 mg/mLのゲニン溶液を60 µLずつ注入し、出口に真空アスピレーターチップを装着してゲニン溶液をデバイス内に吸引させます。入口に少量の溶液のみが残った時点で吸引を停止します。次に、溶液の乾燥を防ぐため、入口と出口の両方にPBSを数滴滴下します。インキュベーションの間、デバイスを入れたディッシュを37 °Cに設定した加湿オーブンまたはインキュベーターに移し、4時間インキュベートします。インキュベーション中、フィブロネクチンを滅菌二回蒸留水を用いて50 µg/mLの濃度に再懸濁し、Jinとのインキュベーション後、少なくとも30分間氷上に置いておきます。インレットから最小限のPBSを流します。次に、50 µg/mLのフィブロネクチン溶液を100 µL加えます。各入口において、バキュームアスピレーターチップを用いてデバイス内に溶液を吸引します。出口側では、デバイスが入った蓋のないディッシュを37°Cに設定したオーブンまたはインキュベーターに移し、24時間インキュベートします。インキュベーション後、片方の手でカバーガラスを軽く固定しながら、もう一方の手でデバイスの角をゆっくりと剥がし、カバーガラスから慎重にデバイスを取り除きます。その後、カバーガラスを滅菌済みの6ウェルプレートに入れます。各ウェルにペニシリン・ストレプトマイシン溶液を少なくとも5 mL加え、その後、ディッシュを37°Cの滅菌インキュベーターに30分以上置きます。滅菌後、ペニシリン・ストレプトマイシン溶液を吸引し、培養したヒト臍帯動脈血管平滑筋細胞を80,000 cells/cm²の濃度でカバーガラスに播種します。試験前に、細胞を37°C、5% CO2条件下で24時間以上インキュベートします。試験を開始するために、組織サンプルを100 mmディッシュに入れます。サンプルが浸るまで、pH 7.4に調整し予熱した滅菌タイロ液を加えます。カミソリの刃を使用して、パイプアームの端に対して垂直に、細胞シートに数本の平行な切り込みを入れます。約2 mmの厚さで、幅の広い組織切片となるように切断します。これが、後で除去する細いストリップと交互に配置される血管筋薄膜となります。次に、ディッシュを90度回転させ、組織の中央で軟膜のストリップと平行に、2本の直線的な平行切断を行います。隣接するフィルム同士が接触するのを防ぐため、血管・筋肉薄膜の間の細いストリップを取り除きます。次に、ディッシュを実体顕微鏡ステージ上の温度制御プラットフォームに設置し、処理アッセイの間、所定の間隔でタイムラプス、透過光、および蛍光光画像を撮影し始めます。血管・筋肉薄膜に50 nanomolarのendotheliumを20分間添加して収縮を誘発させた後、100 micromolarのHA 10 77を30分間添加し、32 degrees Celsius以下に冷却して弛緩を誘発させる処理を連続的に行います。軟膜が溶解し、血管平滑筋薄膜が放出されます。投影長の測定値から曲率半径に変換し、ここに示す代表的な収縮能アッセイの連続透過光画像における薄膜上の細胞層の平均応力を算出します。これらの画像から応力値に変換し、そこから基底トーンおよび誘発された収縮能を算出することができます。このビデオでは、収縮能アッセイ全体の代表的なタイムラプス映像を示します。筋肉薄膜が収縮平衡に達した後、50 nMのendotheliumを添加することでさらに収縮します。その後、100 µMのha 10 77を添加すると、一方の薄膜が弛緩します。アッセイ終了時に見られる基底トーンおよび組織収縮性のわずかな低下は、組織を構成する細胞数の減少による直接的な結果であると考えられます。血清飢餓状態の血管平滑筋細胞は増殖しないため、ここでは1日から2週間のさまざまな採取時点において、genin修飾表面で培養した平滑筋細胞の位相差画像を示しています。ここでは免疫組織化学法を用い、血清飢餓後1日、4日、7日における組織のコンフルエンスと細胞配列を、F actinフィラメントを緑色に染色することで強調しました。この期間における組織のコンフルエンスを定量的に評価した結果、これらの表面では劣化が最小限であることが示されました。f actinフィラメントの配向性を定量化したところ、2週間にわたって配向性が維持されていることが確認されました。培養において、このin vitro組織作製技術を習得すれば、2日間で完了させることができます。本手順を実施する際は、細胞播種予定日の1日前からマイクロ流体堆積を開始すること、およびフィンフィルム実験中に生理的な一定温度を維持することが重要です。本手順の後、ウェスタンブロッティングやPCRなどの伝統的な生化学的手法を用いてタンパク質および遺伝子発現の変化を解析し、細胞の表現型と機能的挙動との相関を検討することができます。本手法は、脳血管攣縮、高血圧、動脈硬化などの緩徐に進行する血管機能不全の進行や、ヒト動脈壁のin vitroモデルを研究する研究者に道を開くものです。

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

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Bioengineering

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