Name: マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶマイクロ流体ゲニピン堆積技術による血管筋薄膜の長期培養法。PDMS基板上にゲニピンとフィブロネクチンを精密パターニングし、血管平滑筋細胞の構造維持と収縮機能を2週間保持する体外モデルを構築します。

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私たちは、米国心臓協会の科学者開発助成金、13SDG14670062(PWA)、およびミネソタ大学博士論文フェローシップ(ESH)からの財政的支援に感謝します。また、ミネソタ大学のミネソタナノセンター(MNC)の微細加工リソースと大学イメージングセンター(UIC)の画像処理リソースにも感謝しています。この作業の一部は、ミネソタ大学のキャラクタリゼーションファシリティで実施され、MRSプログラムを通じてNSFから部分的な支援を受けています。

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<li>McCain, M. L., Sheehy, S. P., Grosberg, A., Goss, J. A., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulating+maladaptive%2C+multiscale+remodeling+of+failing+myocardium+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Recapitulating maladaptive, multiscale remodeling of failing myocardium on a chip.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9770-9775 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
<li>Meer, A. D., van den Berg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips%3A+breaking+the+in+vitro+impasse%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips: breaking the in vitro impasse.</a> Integr. Biol. (Camb). 4, 461-470 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、慢性血管疾患経路1,23,24の拡張実験時間は、より一般的なことができ、以前に開発VMTF技術に基づいて構築されたプロトコルを提示します。これを達成するために、我々は、以前にMTF収縮実験で使用するための改良された血管組織の生存率で操作動脈ラメラを得るために、マイクロ流体堆積技術を用いて、PDMS基板11の長期的な官能化を提供することが示されているゲニピンを、微細。マケインら 。関連MTFモデル25に数週間のための工学的心臓組織の拡張文化のための代替micromoldedゼラチンハイドロゲル基材を開発しました。 このプロトコルは、正常に2週間にわたって動脈ラメラ構造（図2）と機能（図3）模倣vMTFsを得ました。提示されたプロトコルが正常に完了し、所望の解像度が得られているが疾患関連の時間経過の拡張培養時間のULT（ 例えば、脳血管攣縮の病理学的効果は14日まで26持続する）、いくつ...

血管のような脳血管攣縮1,2、3高血圧、アテローム性動脈硬化症および4のような疾患、徐々に開発、自然界に一般的に慢性的であり、血管平滑筋細胞（VSMC）の機能不全の力の生成を伴います。我々は、in vivoモデルよりも実験条件をより詳細に制御を用いたin vitroの方法で使用して、これらの遅い進行血管機能障害を研究することを目指しています。我々は以前のin vitroの機能的収縮を測定するために、血管、筋肉薄膜（vMTFs）を開発した心血管組織5を設計しますが、この方法は、比較的短期間の研究に限定されていました。ここでは、長期的な測定のために私たちの前のVMTF技術を拡張基板修正手法を提示します。 内皮は、全体の血管機能でも重要であるが、人工動脈ラメラは、血管の変化を評価するための有用なモデルシステムを提供します疾患の進行中に収縮。機能性血管疾患の組織モデルを設計するために、動脈ラメラの構造と機能、血管の収縮基本ユニットの両方が、忠実に再現されている必要があります。動脈ラメラ、エラスチン6のシートによって分離された収縮のVSMCの円周方向に整列されたシート同心です。ポリジメチルシロキサン（PDMS）基板上に細胞外マトリックス（ECM）タンパク質のマイクロコンタクト印刷は、予め整列心臓血管組織5,7-10を模倣するために、組織の組織のガイダンスキューを提供するために使用されています。しかし、マイクロコンタクト印刷を使用してパターン化組織が慢性試験でその適用を制限し、培養液中の3-4日後に整合性を失う可能性があります。このプロトコルは、新しいマイクロ流体堆積技術を用いて、前のマイクロコンタクト印刷技術を置き換えることによって、この問題に対する解決策を提供します。 Genchi らゲニピンとfにPDMS基板を改変ound文化11で1月に筋細胞の生存率を延長しました。ここでは、PDMS上にパターン血管平滑筋細胞の培養物を拡張するために同様のアプローチを使用します。ゲニピン、クチナシ果実の自然加水分解誘導体は、同様の架橋剤および組織修復12,13とECMの変更14の分野における生体材料としての使用の増加に比べ、その比較的低い毒性のために、基板の修正のための望ましい候補であります15。このプロトコルでは、フィブロネクチンは、前のマイクロコンタクトプリント法のように、細胞のガイダンスキューとして利用されます。しかしながら、ゲニピンは、フィブロネクチンのパターニングの前にPDMS基板上に堆積されます。細胞がパターン化されたマトリックスを分解するとしてこのように、添付のVSMCから新たに合成されたECMは、ゲニピンでコーティングされたPDMS基板に結合することができます。 このプロトコルは、2段階ゲニピンとECM沈着のためのマイクロ流体送達装置を利用します。マイクロ流体デバイスの模倣体の設計microco以前の研究16において操作動脈ラメラに使用ntact印刷パターン。従って、我々は、このプロトコルが正常に生体内の構造と動脈ラメラの収縮機能に高度に整列を再現動脈ラメラ模倣を得ことを期待しています。我々はまた、ゲニピンは、インビトロ血管疾患モデルにおける長期的に適した基板修飾化合物であることを確認するために、組織の収縮性を評価します。

<table><tbody><tr><td>カバーガラス染色ラック</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>顕微鏡カバーガラス - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>ポリ(N-イソ-プロピルアクリルアミド) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-ブタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a</td><td>>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>ポリジメチルシロキサン (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>蛍光マイクロビーズ</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>シリコンウェーハ</td> 株式会社ウェーハ<td>ワールド</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>フォトレジスト&nbsp;</td><td>マイクロケム株式会社</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>接触式マスクアライナー</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>トリデカフルーロ-トリクロロシラン</td><td>UCTスペシャリティーズ株式会社</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>外科用生検パンチ</td><td>インテグラライフサイエンス株式会社</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a</td><td>>10010622</td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>コーニング株式会社</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジーズ株式会社</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>臍帯動脈平滑筋細胞</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Tyrodeの溶液成分</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>各種</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>温度制御プラットフォーム</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659; 640352; 641922</td></tr><tr><td>エンドセリン-1</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</A></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</A></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

>jove_content<血管疾患の進行の慢性的な性質は、疾患に関連する時間スケールで生理学的および病理学的血管の挙動をシミュレートする実験的技術の開発を必要とします。これまで、マイクロコンタクトプリンティングは、組織組織のガイダンスキューとして細胞外マトリックスタンパク質をパターニングすることにより、2次元の機能的な動脈模倣物を製造するために使用されてきました。血管筋薄膜は、これらの機能的収縮性を評価するためにこれらの模倣を利用しました。ただし、使用されるマイクロコンタクト印刷製造技術には、通常、疎水性PDMS基板が組み込まれています。組織がその下にある細胞外マトリックスをひっくり返すと、新しいタンパク質は、疎水性アミノ酸残基を疎水性PDMS表面に露出させて付着させるために、構造変化または変性を受ける必要があり、その結果、マトリックスタンパク質の生理活性が変化し、層間剥離が起こり、組織の死が生じます。
ここでは、架橋剤化合物のジェニピンのパターニングのためのマイクロ流体堆積技術を紹介します。ジェニピンは、パターン化された組織とPDMS基質との間の仲介役として機能し、細胞が新たに合成された細胞外マトリックスタンパク質をより親水性な表面に沈着させ、PDMS基質に付着したままにすることができます。また、細胞外マトリックスタンパク質を沈着したゲニピンに直接パターン化できることも示し、操作された組織構造のディクテーションを可能にすることも示しています。この技術で作製した組織は、血管筋薄膜モデルにおいて、血管平滑筋組織の構造的整列と収縮機能の両方で高い忠実度を示します。この技術は、他の細胞タイプを使用して拡張することができ、慢性組織および臓器レベルの機能の将来の研究のためのフレームワークを提供します。

この研究の主な目的は、疎水性のPDMS基板上にマイクロパターンのVSMCの生存を延長することでした。これは、PDMS（図1）上にパターンゲニピンおよびフィブロネクチンを堆積させるために、マイクロ流体送達システムを組み込むことによって達成されました。マイクロ流体送達を用いECMタンパク質の沈着は、ゲニピンおよびフィブロネクチン（図1D）のライン間の裸のPDMSとのチャネルパターンの忠実度の高い転送を得ました。以前のマイクロコンタクトプリント法5,10,16と同様の動脈ラメラのインビボ構造を模倣付着した細胞（図1E）フォームコンフルエントな単層（ 図2）。これらの組織は、その応力VMTF技術を用いて測定した（図3）に応答して、収縮構造を、得ました。 2週間にわたって組織の生存率の定性的評価は、ゲニピンMODIFIに最小限の劣化を示しました編基板（図2A）。</s...

私たちは、PDMS基質上にパターン化されたゲニピンとフィブロネクチンをマイクロ流体で堆積させる方法を提示します。これにより、血管平滑筋の細胞密度の高い組織の生存能力が延長されます。この組織作製法は、従来の血管筋薄膜技術と組み合わされ、疾患に関連する時間経過における血管の収縮性を測定する。

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

本手順の全体的な目的は、疾患に関連する時間スケールにおける脳血管痙攣などの血管機能不全のメカニズムを研究するために使用できる、平滑筋収縮機能のin vitroモデルを構築することです。これは、まずカバーガラスにPIAMとPDMSを順次スピンコートしてエラストマー基板を作製し、長期的に維持可能な血管筋薄膜を用いることで達成されます。第2のステップでは、マイクロ流体堆積デバイスを使用して、ゲニンとフィブロネクチンを表面に順次堆積させます。血管・筋肉薄膜上での組織の自己組織化に誘導キューを提供するため、最終ステップとして、サンプルのイメージングを行いながら血管・筋肉薄膜に収縮と弛緩を誘導させる収縮アッセイを実施します。最終的に、このアプローチにより、培養状態で最大2週間、構造的忠実性と機能的な収縮性を維持する組織が得られます。マイクロコンタクトプリント法を用いた筋肉薄膜などの既存手法に対する本手法の主な利点は、従来の手法で構築された組織が3〜4日後に分解し始めるのに対し、組織の完全性と機能的な収縮性が数週間にわたって維持されることです。培養において、本手法は、慢性疾患の進行に伴い動脈の機能的メカニズムがどのように変化するかなど、血管疾患における重要な課題を研究するためのプラットフォームを提供します。ここでは血管力学について研究していますが、本手法は、心筋や骨格筋の機能を再現するためのオルガンチップ技術など、他のモデル臓器系にも応用可能です。私たちが本手法を考案したのは、緩徐に進行する血管機能不全の研究を目指した際、既存の手法では血管平滑筋細胞の機能を定量化できなかったか、あるいは十分な期間にわたって完全性を維持できなかったためです。Jinマイクロ流体堆積法は、マイクロコンタクトプリンティングと同様の方法で細胞の自己組織化のためのテンプレートを提供しますが、同時に、血管リモデリングの研究に適した時間スケールで、パターン化された組織がその構造と完全性を維持することを可能にします。まず、付属のテキストプロトコルに従って、直径25 mmのガラスカバースリップの一群を洗浄します。洗浄したカバースリップの側面に粘着テープを貼り、中央にガラスの帯状の部分が露出するようにして、端を覆います。次に、カバースリップをディッシュから切り離し、1枚ずつスピンコート用チャックに設置します。ピンセットを使用して、1-ブタノールに溶解させた10% poly N-isopropylacrylamide（poly PAMまたはPIAMとも呼ばれる）溶液を150 µL加えます。カバースリップの露出部分が完全に覆われていることを確認してください。次に、スピンコーターの電源を入れ、10秒かけて回転速度を3000 RPMまで上げます。5秒間待機した後、さらに10秒かけて6,000 RPMまで上げます。6,

microfluidic-genipin-deposition-technique-for-extended-culture

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルでは、我々は技術がベースとなっている垂直方向に変位の記事のマイクロアクチュエータアレイの製作、そしてどのようにこの基盤技術は2次元と3次元の両方の文化の中でハイスループット機械的にダイナミックな細胞培養を実施するように変更することができますを示していますパラダイム。...

機械的にダイナミックな細胞培養のための微細加工プラットフォーム

簡単なテクニックは、通常の細胞培養基板上への動的なマスク投影リソグラフィ用デジタルマイクロミラーデバイスを用いた微細加工神経培養システムの急速な生産のために説明されています。これらの培養系は、天然の生物学的なアーキテクチャのより代表的かもしれない、と説明された技法は数多くのアプリケーションに適応することができます。...

動的なマスク投影リソグラフィーを用いたニューラル培養システムのためのマイクロパターンハイドロゲルの作製

微小サイズのチャネル（&lt;30μm）を持つマイクロ流体デバイスの全体の内部の三次元表面全体に文化内皮細胞単層をに方法が記載されています。この...

血液疾患における血管相互作用を研究するためのEndothelializedマイクロフルイディクス

マイクロチャネル·オン·チップ·プラットフォームは、フォトリソグラフィリフローフォトレジスト技術、ソフトリソグラフィー、マイクロフルイディクスとの組み合わせによって開発されました。内皮マイクロチャネルプラットフォームは、 インビボにおける微小血管の3次元（3D）ジオメトリを模倣する制御された連続かん流の流れの下で実行され、高品質かつリアルタイムイメージングを可能にし、微小血管の研究に適用することができる。...

マルチ深円形の断面内皮マイクロチャンネル·オン·ア·チップの開発のための手順

この原稿は、内皮の生理学的特性を再現微小血管を設計するための射出成形方法を提供します。マイクロ流体ベースのプロセスは、このような流れ、細胞組成、幾何学、および生化学的勾配などの調整可能な条件、との特許の3D血管ネットワークを作成します。製造プロセスと潜在的な用途の例について説明します。...

微細と3D微小血管の組立

このプロトコルは、ポリ(エチレングリコール)ジアクリレート(PEGDA)ハイドロゲルに埋め込まれた血管由来の生体模倣マイクロ流体ネットワークを製造するための、イメージ誘導レーザーベースのハイドロゲル分解の実装を概説しています。これらの生体模倣マイクロ流体システムは、組織工学アプリケーション、in...

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

我々 は、二次電池の種類がさらに血管柄付き組織とオルガノイドを生成するには、このを用いた構造の間質性スペースに播種できるを用いた血管床をエンジニア...

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

プロトコルでは、回転楕円体の perfusable...

マイクロ流体デバイスにおける組織モデルと perfusable の血管ネットワーク

ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。...

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。...

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

私たちは、Vessels-on-a-Plate(VOP)と呼ばれる3Dバイオプリンティング技術を使用して、標準的な6ウェルプレート上で柔軟なサイズと目的のパターンを持つ血管チャネルのハイスループット生産のためのプロトコルを提示します。このプラットフォームは、内皮の障害に関連する疾患の治療法の開発を進める可能性を秘めています。...

サイズとパターンの柔軟性を備えた標準的な 6 ウェルプレートにおける血管透過性をモデル化するためのハイスループットバイオプリンティング法

学ぶマイクロ流体ゲニピン堆積技術による血管筋薄膜の長期培養法。PDMS基板上にゲニピンとフィブロネクチンを精密パターニングし、血管平滑筋細胞の構造維持と収縮機能を2週間保持する体外モデルを構築します。

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

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