Name: 一過性脳低酸素性虚血に基づく血栓性脳卒中モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 学ぶマウス血栓性脳卒中モデルで一過性脳低酸素性虚血を誘導し、tPA治療の効果を評価する方法。この手法は虚血性脳卒中の治療戦略研究に有用です。

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この研究は、NIHの助成金NS074559(C.K.)によって支援されました。本方法論レポートの基となった研究論文に貢献してくださったすべての共同研究者に感謝します。

このプロトコルは、エモリー大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認され、ケアと実験動物の使用のための健康ガイドラインの国立研究所に追従されます。 1.セットアップ<ol><li>手術の前に少なくとも15分間、37℃で熱ポンプに接続された温暖化のパッドの上に手術台を準備します。手術台の上に3ミリリットルの注射器のバレルを使用して、首のロールを配置します。医療空気中2％イソフルランで麻酔ガスを準備します。 </li><li>オートクレーブした鉗子、はさみ、マイクロニードルホルダー、止血剤、綿棒や縫合糸を準備します。組織接着剤や眼軟膏を準備します。 </li><li>加熱ランプおよび直腸プローブと低酸素システムと温度コントローラを設定します。 92.5％N 2でバランス7.5％のO 2中の2％イソフルランで低酸素ガスを準備します。 </li><li>一時間手術前に、マウスを徐放メロキシカム（4.0ミリグラム/ kg）を皮下注射することによりanalgesizedされています。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 2。一過性脳低酸素虚血（図1B） <ol><li>動物が足のスクイズに応答しなくなるまで、3％イソフルランで麻酔導入室で22〜30グラムの重さの10〜13週齢の雄のC57BL / 6マウスを麻酔し、その後電子シェーバーを使用して、右の首の毛を削除します。 </li><li> 2 L / minの流量で医療空気中の2％イソフルランで接続された手術台の上にマウスを置きます。セキュア前肢は、医療テープを使用して、両側にネックロールに沿って伸ばし。 </li><li>アルコール、その後綿棒続いベタジンで切開するための外科手術部位を清掃してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で、まっすぐ鉗子と約0.2センチ正中皮膚からの横方向のマイクロはさみを使用して0.5センチメートル右頸部切開を行います。 </li><li>右総頸動脈（RCCA）を露出させるために筋膜と組織を引き離すために微細な鋸歯状の鉗子のペアを使用してください。慎重に細かいなめらかなピンセットを使用して、迷走神経からRCCAを分離します。 </li><li>ライブRCCA上の2つのプレカット5-0絹縫合糸（解除可能）を結び目、その後、4-0ナイロンモノフィラメント縫合糸（ 図1C）を用いて皮膚を縫い合わせます。 </li><li>乾燥を防ぐために、両眼に眼軟膏を適用します。 </li><li>素早く低酸素システムにマウスを転送し、30分間、0.5 L /分の流速で7.5％のO 2中の2％イソフルランでフェイスマスクで鼻と口を置きます。 <ol><li>低酸素時には、37.5±0.5℃の直腸温度を制御する加熱ランプと温度コントローラを使用しています。 80〜120呼吸/分で呼吸速度を監視します。低酸素時に37℃以上の体温を維持することは、一貫性の脳梗塞を作成することが重要です。低呼吸数は、通常20分の低酸素症の後に発生します。フェイスマスクを外し、呼吸数は40に下回る場合、これは1〜2分を取り、30分間の低酸素症の期間にカウントされません通常の空気の供給を可能にします。 </li></ol></li><li>低酸素症の後、転送手術台のマウスとはRCCAから2本の縫合糸を解放します。組織接着剤を使用して傷を閉じて、ケージにマウスを返します。 2つのライブノットの両方が予期せず、低酸素後にリリースされた場合、動物を除外します。 </li><li>低酸素および麻酔から回復するために5〜10分間マウスを監視します。ケージに濡れた食品を置き、動物飼育施設に戻します。 注：THI後24時間で重度の旋回動作に軽度を示す動物は脳梗塞と相関しています。発作症状を持つほとんどの動物は、Th1 24時間後の時点前に死亡します。 </li></ol> 3.レーザースペックルコントラストイメージング注意：これはTHIモデルの本質的な手順ではないが、二次元のレーザースペックルコントラスト画像化システム16は、中または一時低酸素性虚血後の脳の血流（CBF）の変化を特徴づけるために使用することができます。 STの直後に、THIで、レコードをCB​​Fの変化を文書化することEP 2.6。あるいは、THI傷害後のCBFの回復を比較するために、これらの手順は、ステップ2.10以下を行うことができます。 <ol><li>腹臥位で麻酔したマウスを置き、頭蓋骨露出したが、未開封で、頭皮に約1cm長の正中切開を行います。 </li><li>製造業者のプロトコルに従って、血流画像化装置の下で両方の大脳半球にCBFを監視し、CCAO手術（ステップ2.6）の直後に脳血流の記録を開始。 50分間続けます。 </li><li> 16色のパレットで任意の単位でCBF画像を表示して、製造業者の指示（ 図2）は、次のMoorFLPIソフトウェアを使用してリアルタイムで選択した領域を分析します。 </li><li> CBF画像を記録した後、組織接着剤で頭皮を閉じて、ケージに動物を返します。 </li></ol> 4. tPAの管理<ol><li> 220〜300（溶媒または10mg / kgの組換えtPAを尾静脈で動物を注入＆＃956; 1ミリグラム/ M TPA）のL 0.5、1、またはtCCAoプラス低酸素症後4時間で（ 図4）。 </li></ol>いくつかの異なるオプションで5脳の損傷検出注：THI後、脳試料を採取1でマウスを安楽死させる、4または24時間にします。 <ol><li> in vivoでの塩化2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム（TTC）が記載以前のようなTHI傷害後24時間目の方法で梗塞体積の定量化を行う。17 <ol><li>腹腔内transcardial灌流前に1.4 Mマンニトール溶液（〜0.1ミリリットル/ g体重）を30分で動物を注入します。 PBSでTranscardial散らすマウスを2％TTCを10mlました。 </li><li> 10分後に手術器具を用いた動物の脳を削除し、ビブラトームで、1mmの厚さに一晩固定し、セクションの4％パラホルムアルデヒド中に配置します。 </li><li>デジタル顕微鏡および定量によって4区分脳のスライドの一連のスナップImageJソフトウェアを使用して、損傷していない、反対側の半球の面積に対する梗塞領域（右側の白い部分）の割合としての梗塞体積をIFY。 </li></ol></li><li>あるいは、THI傷害後の1時間後に免疫蛍光法により血栓形成を行います。 <ol><li> OCT化合物および部分クライオスタットを用いて、12μmの厚さで脳内の固定脳をフリーズします。 </li><li>蛍光顕微鏡で蛍光を観察するために：（200 1）ヤギ抗ウサギアレクサFluro 488色素により以下：（100 1）ウサギ抗フィブリノゲン抗体を用いた脳のスライドをインキュベートします。 </li></ol></li><li>あるいは、THI傷害の後4時間で100μlの2％エバンスブルー色素の尾静脈注射により血管閉塞を行います。 <ol><li>マウスを安楽死させるとすぐにエバンスブルー注射後、4％パラホルムアルデヒド中に脳を除去するために頭を切りました。注：これは、両方の前足の青色とエバンスブルー循環のための5-10分を取り、後肢。 </li><li> Secti100ミクロンの厚さで固定された脳にスライディングミクロトームを用いて、蛍光顕微鏡で680 nmの発光フィルターを用いて蛍光を観察します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

脳卒中は、人口の高齢化との任意の社会の高まる重要性の主要な健康問題です。世界的には、ストロークが全死亡18の11.1％に相当する2010年の推定590万致命的なイベント、との死因の第2位です。脳卒中は障害調整生存年数（DALYs）の第三の主要な原因は、1990年19で5位から上昇し、2010年に世界的に失われたもである。これらの疫学データは、急性のより有効な治療法（虚血性）脳卒中の必要性を強調しています。しかし、前臨床神経保護治療に熱心な研究にもかかわらず、のtPA血栓溶解は、動物実験で多数回有望な神経保護剤は、臨床試験で失敗したが、米国では食品医薬品局によって承認された急性虚血性脳卒中の唯一の特定の治療法のままです。患者に神経保護療法を翻訳の難しさは、多くの要因があり、現在の重点は、良好な実験室のpractiにありCE、複数のデータセットのメタ分析、および前臨床ストローク研究20,21を改善するための国際協力。しかし、翻訳難易度が日付2,3に前臨床脳卒中の研究の大部分で機械的な血管閉塞モデルのお粗末な選択（ 例えば、腔内縫合MCA...

血栓溶解および再疎通は、臨床診療1急性虚血性脳卒中の最も効果的な治療法です。しかし、前臨床神経保護研究の大部分は、血管閉塞を除去すると脳血流量の急速な回復を生成したtPAの血栓によるない利点のほとんどを示す過渡メカニック閉塞モデル（腔内縫合中大脳動脈閉塞）で行いました。これは、脳卒中モデルの選択は、疑わしい患者2,3に神経保護療法を変換することが困難に、少なくとも部分的に寄与することが示唆されています。したがって、前臨床研究におけるtPAの応答性血栓塞栓性脳卒中モデルを採用したため増加コールがありますが、このようなモデルはまた、技術的な問題（説明を参照）4-7を有しています。ここでは、一方的な一過性低酸素性虚血性（THI）侮辱および静脈内のtPA療法8への応答に基づいて新たな血栓性脳卒中モデルについて説明します。 THIストロークモデルは、1960年9成体ラットを用いた実験のために発明されたLevineの手順（チャンバ内の過渡的低酸素への曝露が続く一方的な総頸動脈の永久結紮）に基づいて開発されました。オリジナルのレバイン手順はあいまいに色あせたため、それが唯一の変数脳の損傷を生じたが、それは1981年10新生児低酸素性虚血性脳症（HIE）のモデルとしてロバート·バンヌッチと彼の同僚によって再導入されたときと同じ侮辱は、げっ歯類の仔で一貫性のある神経病理の原因となった。近年では、いくつかの低酸素室11内の温度を調整することにより、成体マウスの研究者の再適応レヴァイン-バンヌッチモデル。これは、元レヴァインの手順で一貫性のない脳病変は、低酸素室に大人のげっ歯類の体温の変動から生じ得ることがもっともらしいです。この仮説を試験するために、我々は、低酸素ガスを投与することにより、レヴァイン手順を改変しましたフェイスマスクを介して、手術台12の上に、37℃でげっ歯類コア温度を維持します。予想されるように、ストリンジェントな体温調節が大きくHI誘発性脳病変の再現性を増加させました。 HI傷害はまた、凝固、オートファジー、とグレーと白質損傷13をトリガします。他の研究者らはまた、脳卒中後の炎症反応14を調査するためにHIモデルを使用しています。 HIストロークモデルのユニークな特徴、それは密接に血流のうっ滞を含む、血栓形成のウィルヒョウのトライアドに従うことで、内皮損傷（ 例えばによるHI-誘導される酸化ストレスに対する）、および凝固亢進（HI誘発性血小板活性化）（ 図1A）15。このように、HIモデルは、実世界の虚血性脳卒中に関連したいくつかの病態生理学的メカニズムを取り込むことができます。念頭に置いてこの考えでは、我々はさらに、国連の可逆的ライゲーションとHIモデルを洗練しましたilateral総頸動脈（したがって過渡HI傷害を作成する）、およびまたはエダラボンなしのtPA血栓溶解にその応答をテストしました。エダラボンは、すでに発症9の24時間以内の虚血性脳卒中を治療するために、日本で承認され、フリーラジカルスカベンジャーです。我々の実験は、短い30分の過渡HIは、血栓性梗塞をトリガし、その組み合わせのtPA-エダラボン処理が相乗便益8を与えることを示しました。ここでは、詳細な外科的手順および急性虚血性脳卒中の再灌流治療を最適化するために使用することができますTHIモデルの方法論的な考慮事項について説明します。

<table><tbody><tr><td>成体雄マウス</td><td>Charles River</td><td>C57BL/6&nbsp;</td><td>生後10-13週齢 (22-30 g)</td></tr><tr><td>移動式実験動物麻酔システム</td><td>VetEquip</td><td>901807</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>医療用空気(圧縮)エアタンク</td><td>エアガス</td><td>UN1002</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマルヘルスケア</td><td>NDC 66794-013-25</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>マルチステーション 実験動物麻酔システム</td><td>サージベット</td><td>V703501</td><td>低酸素システム</td></tr><tr><td>7.5% O2 92.5% N2タンクとバランス</td><td>エアガス</td><td>UN1956</td><td>低酸素システム</td></tr><tr><td>暖房ランプ付き温度コントローラー&nbsp;</td><td>コール・パーマー&nbsp;</td><td>EW-89000-10</td><td>温度調節器</td></tr><tr><td>直腸プローブ</td><td>コールパーマー&nbsp;</td><td>NCI-00141PG</td><td>温度調節器</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス&nbsp;</td><td>SZ40</td><td>外科用セットアップ</td></tr>保<tr><td>温パッド付きヒートポンプ</td><td>ゲイマー&nbsp;</td><td>TP700</td><td>外科用セットアップ</td></tr><tr><td>細かい湾曲した鉗子(鋸歯状)</td><td>FST</td><td>11370-31</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>細かい湾曲した鉗子(滑らか)</td><td>FST</td><td>11373-12</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>マイクロはさみ</td><td>FST</td><td>15000-03</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>マイクロニードルホルダー</td><td>FST</td><td>12060-01</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>ハルステッド・モスキート止血剤</td><td></td><td>FST13008-12</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>5-0シルク縫合糸&nbsp;</td><td>ハーバード624143装置</td><td></td>外科<td>用品</td></tr><tr><td>4-0ナイロンモノフィラメント縫合</td>糸<td>LOOK</td><td>766B</td><td>外科用品</td></tr><tr><td>組織接着剤</td><td>アボット研究所</td><td>NC9855218</td><td>外科用品</td></tr><tr><td>Puralube 獣医軟膏</td><td>フィッシャー</td><td>NC0138063&nbsp;</td><td>目の乾燥予防&nbsp;</td></tr><tr><td>MoorFLPI-2 血流イメージャー</td><td>Moor</td><td>780-nm レーザー光源</td><td>レーザー スペックル コントラスト イメージング</td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>Σ</td><td>M4125</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム クロリド (TTC)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>T8877</td><td>in vivo TTC</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Stoelting</td><td>51425</td><td>脳切片 in vivo TTC&nbsp;</td></tr><tr><td>デジタル顕微鏡</td><td>Dino-Lite</td><td>AM2111</td><td>全脳イメージング</td></tr><tr><td>O.C.T化合物</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ 抗ウサギ Alexa Fluro 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>免疫組織化学</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ビブラトーム</td><td>ウルトラプロ 5000</td><td>IHC用脳切片</td></tr><tr><td>エバンスブルー</td><td>シグマ</td><td>E2129</td><td>血管の検出灌流</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>5000</td><td>組織学のための脳切片</td></tr><tr><td>アベルチン (2,2,2-トリブロモエタノール)</td><td>シグマ</td><td>T48402</td><td>安楽死</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>メロキシカム SR</td><td>ズー</td><td></td>ファーム <td>NSAID鎮痛</td></tr></tbody></table>

一過性脳低酸素性虚血に基づく血栓性脳卒中モデル

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

脳卒中の研究は、臨床実践に神経保護療法を変換するときに、多くの挫折に耐えてきました。これとは対照的に、現実世界の治療因子（tPAの血栓溶解）はめったに前臨床ストローク研究を支配する機械的閉塞ベースの実験モデルで利益を、生成しません。ベンチとベッドサイドの間のこの分割は、前臨床ストローク研究でのtPA応答モデルを採用する必要性を示唆しています。この目的のために、簡単かつ反応性のtPA血栓性脳卒中モデルを考案し、ここで説明されています。 37.5±0.5℃で、動物の直腸温度を維持しながら、このモデルは、30分間、成体マウスにおいて、フェイスマスクを介して片側の総頸動脈および7.5％酸素の送達の一過性閉塞から成ります。片側頚動脈または低酸素の可逆的連結各のみ一過性脳血流を抑制しているが、両方の損傷の組合せが持続する再灌流障害、フィブリンおよび血小板沈着、および大infarを引き起こし中大脳動脈が提供する地域におけるCT。重要なことには0.5で、組換えtPAの、尾静脈注射、1、または4時間後THI（10mg / kg）は死亡率および梗塞サイズの時間依存的な減少をもたらしました。この新たな脳卒中モデルが単純であり、実験結果を比較するために実験室を横切って標準化することができます。また、頭蓋骨切除術または予め形成された塞栓を導入することなく、血栓症を誘発します。これらのユニークなメリットを考えると、THIモデルは、前臨床ストローク研究のレパートリーに有用な付加です。

二次元レーザスペックルコントラストイメージング（LSCI）16は、30分の過渡片側頚動脈閉塞（tCCAO）、低酸素状態に30分間露光（7.5％酸素）、および30分片側によって脳血流（CBF）の変化を比較しました低酸素症（THI）の下で連結を頸動脈。この実験は、tCCAOが通常酸素下で迅速に頸動脈閉塞（ 図2AのR）のリリース後85％以上に回復し、ベースライン値の〜50％に頸動脈結紮した半球のCBFを抑制することが明らかになりました。単独の全身低酸素への曝露は、一過正常酸素雰囲気（ 図2B）に戻った後〜130％にリバウンドベースライン値の約75％にCBFを減少させました。迅速めったに頸動ligatioのリリース後20分で30％以上に回復していない10分、周りにベースライン値の20％未満に、同側半球にCBF低下し、低酸素下でのコントラスト頸動脈結紮（THI）でn及び酸素正常状態に復帰します。対側半球（L）のCBFは、しかし、低酸素症の間に20〜50％の間で変動し、かつ迅速にTHI傷害（ 図2C）の後に80％以上に戻りま...

血栓塞栓性脳卒中モデルは、再開通療法を最適化するための重要なツールです。ここでは、一過性脳低酸素性虚血性(tHI)傷害に基づくマウス血栓性脳卒中モデルを報告します。これは、血栓症と梗塞を引き起こし、脳卒中患者と同様の治療ウィンドウで組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)を介した線維素溶解に良好に反応します。

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

この手順の全体的な目的は、安定した脳梗塞を伴う簡便な血栓性脳卒中モデルを構築し、組織プラスミノゲン活性化因子（TPA）療法の保護効果を評価することです。まず、右総頸動脈（RCCA）の二重結紮を行い、結紮した動物を低酸素条件下に置くことで、一過性脳低酸素虚血（THI）を誘導し、血栓を形成させます。30分間の低酸素条件の後、頸動脈の2つの結び目を解除します。最終ステップでは、TPA療法の投与およびその効果の評価について示します。また、脳血流のリアルタイム記録、血栓の形成、および血管閉塞の程度を調査することも可能です。本手法を用いることで、成マウスにおいて、マウス自身の凝固系を利用した血栓性脳卒中を導入することができます。本モデルを用いて、虚血条件下で脳がどのように自身の血流を調節しているかを研究することを目的としています。また、血栓治療をどのように改善できるかの研究にも活用します。脳梗塞の誘発中には、適切な体温の維持やスムーズな呼吸の確保が困難な場合があるため、本手法の視覚的なデモンストレーションは極めて重要です。導入手順 手順を開始する少なくとも15分前に、手術台をウォーミングパッドの上に置き、37 °Cに設定し、3 mLシリンジの筒で作製したネックロールを台の上に配置します。低酸素システムを、92.5%の窒素で調整した7.5%酸素中に2%イソフルランを投与するように設定し、温度コントローラーを調整します。生後10～13週、体重22～30gのC57BL/6雄マウスを手術台の上に置きます。足指へのピンチ刺激で麻酔状態を確認した後、動物の眼に軟膏を塗布します。4肢を頸方向に伸ばし、ロールして医療用テープで固定します。次に、除毛クリームを使用して動物の首の毛を除去し、手術部位を洗浄します。手術台を解剖顕微鏡の下に移動させ、正中線に沿って皮膚に0.5 cmの右頸部切開を加えます。微細ピンセットを用いて気管と筋肉を押し分け、右総頸動脈を露出させ、動脈の下に予めカットした5-0シルク縫合糸を2本配置します。総頸動脈を迷走神経から慎重に分離し、右総頸動脈（RCCA）に2本のあらかじめ切断された解除可能な5-0シルク縫合糸を留置します。次に、4-0ナイロンモノフィラメント縫合糸を用いて皮膚を縫合し、速やかにマウスを低酸素システムへ移動させます。動物の鼻と口にフェイスマスクを装着し、低酸素投与の間、体温が37.5 °Cに維持されるよう直腸プローブを挿入します。30分後にヒートランプを調整します。マウスを手術台に戻し、2本の縫合糸を解除します。その後、組織用接着剤で傷口を閉鎖し、マウスをケージに戻して、完全に回復するまで観察します。あるいは、レーザースペックルコントラストイメージングを用いて、低酸素虚血中および低酸素虚血後の脳血流を調べることもできます。動物を腹臥位に固定します。次に、正中線に1 cmの切開を加えて頭皮を開き、頭蓋骨を露出させます。ただし、頭蓋骨は開頭しないでください。その後、直ちに動物を血流イメージング装置に移し、脳血流の記録を開始します。メーカーの指示に従い、FLPIソフトウェアを用いて脳血流画像を確認し、選択した領域をリアルタイムで解析します。TPA療法の効果を評価するために、一過性の片側頸動脈閉塞および低酸素状態の後の適切なタイミングで、動物の尾静脈に静脈内投与を行います。その後、一過性脳低酸素虚血から24時間後に、生体内でTTC染色を行い、梗塞体積を定量化します。翌日、ビブラトームを用いて厚さ1 mmの切片を作成します。最後に、デジタル顕微鏡で4枚の一連の脳切片画像を取得し、適切な画像解析ソフトウェアを使用して、白く染まった梗塞領域の面積と、損傷のない対側半球の面積の比として梗塞体積を定量化します。本手順に代わり、他の血栓溶解法を用いて、その効果や臨床的有用性を評価することが可能です。本手法は、虚血性脳卒中の分野における研究者が、脳内での血栓溶解療法を探索するための道を開きました。

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Medicine

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一過性脳低酸素性虚血に基づく血栓性脳卒中モデル

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