再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

眼刺激性試験の全体的な目標は、物質と混合物を眼刺激性に応じて分類し、ラベル付けすることです。この手順では、3次元再構成された角膜のような組織モデルを利用します。到着すると、テストキットは、翌日アッセイ培地中で一晩前インキュベートされ、組織を水和させ、続いて、ポジティブおよびネガティブコントロールおよび目的の試験化学物質を組織の表面に局所適用する。

一定期間の暴露試験後、洗浄により薬品を除去します。組織は新鮮なアッセイ培地でポストインキュベートされ、その後、化学物質の毒性がMTTアッセイによって評価されます。最終的には、試験物の刺激性の可能性は、試験物で処理した組織と陰性対照で処理した組織の相対的な生存率を比較することで評価できます。

この技術の主な利点は、迅速微量刺激性試験のような既存の方法であり、実験動物を関与させないことです。これは、正常なヒト細胞で構成される眼球組織モデルのようなin vitroで分解された角質を利用しています。あらゆる種類の物質や混合物に適用でき、眼の刺激や材料による深刻な眼の損傷を誘発する化学物質を区別することができます。

分類や表示を必要としない非刺激性物質。上皮組織またはエピのような再構築されたヒト角膜。眼球は、栄養素が細胞に渡される多孔質膜を備えたインサートで調製されます。

再構築された組織は、角膜上皮をモデル化する非角質化上皮を形成し、角膜上皮は漸進的に層状化しているが角化していない細胞でモデル化されます。上皮キットのような人間の角膜を受け取ったら、24ウェル輸送コンテナ内の組織を室温に平衡化します 15分後、無菌条件下で24ウェル組織プレートが入ったバッグを開き、アグロスゲルとインサートの間の気泡についてすべての組織を検査します。切る。テープを開きます。

滅菌ガーゼでカバーを取り外し、ティッシュ表面を検査します。次に、37°Cのキットアッセイ培地1ミリリットルを、事前に標識された6つのウェルプレートのウェルに分注します。次に、滅菌鉗子を使用して、インサートを含む組織を滅菌ガーゼで静かに拭き取り、残っている輸送用アロを取り除き、6つのウェルプレートの個々のウェルに配置します。

1時間後、培地を1ミリリットルの新鮮な37°Cアッセイ培地と交換し、標準培養条件下で組織を一晩インキュベートします。翌日、20マイクロリットルのカルシウムとマグネシウムを含まないDPBSを各組織の頂端表面に撫でます。DPBSが組織全体に広がっていない場合は、鉗子でインサートを優しく保持し、プレートを軽くたたいて、生理食塩水が組織表面全体を濡らすようにします。

プレートを30分間インキュベートします。次に、液体試験品で組織を治療するために、50マイクロリットルの陰性対照、陽性対照、および適切な試験物をスケジュールに従って二重に適用します。治療が組織表面全体を覆うように注意し、その後、インサートを30分間インキュベートして、固形の試験物で組織を治療します。

まず、インサートを滅菌面に移します。空気中の固体粒子による汚染を防ぐために、プレートを覆ったままにしてください。次に、水平なスプーンを使用して、治療が組織表面全体を覆うように注意しながら、タイムテーブルに従って50ミリグラムの試験物を重複組織に局所的に塗布します。

または、ヘッドを切り落とした状態でプレフィルドの1ミリリットルシリンジを使用します。粉末を培養物に直接置く。固形試験体を塗布した直後にプランジャーを押して粉末を塗布し、インサートを6つのウェルプレートに戻し、組織を6時間インキュベートして組織をすすぎます。

処理後、曝露インキュベーションの終了時に、試験品ごとに3つの150ミリリットルのビーカーに100ミリリットルのDPBSを充填します。湾曲した鉗子でインサートの上端をつかんで、ウェルから取り出します。次に、鉗子を使用して、同じ治療から2つのインサートを上端でピックアップし、治療をきれいな吸収材料にデカントします。

次に、インサートをDPBSの最初のビーカーに浸し、円を描くように渦巻くように組織を2秒間洗浄します。次に、インサートを持ち上げて、ほとんどがDPBSで満たされるようにし、液体をビーカーに戻します。最初のビーカーで洗濯を2回繰り返します。

次に、最後の洗浄後、DPB S3の2番目と3番目のビーカーでインサートをそれぞれ同じ方法ですすぎます。各インサートを約45度の角度に回転させ、開放端を下に向けて、上唇を吸収材に接触させて、残りのDPBSをデカントします。その後、すぐに組織を5ミリリットルの室温アッセイ培地に浸します。

浸漬後の浸漬期間の終わりに、事前に標識された12ウェルプレートで、アッセイ培地をデカントし、インサートを吸収剤にブロットします。次に、インサートをウェルあたり1ミリリットルの温かいアッセイ培地を含む新しい6ウェルプレートに移し、プレートをインキュベーターに置いてMTT生存率アッセイを開始します。インサートを、新たに調製したMTT溶液0.3ミリリットルを含む24ウェルプレートに移します。

転写する前に、インサートを吸収材に軽くたたきます。インサートの下に閉じ込められた気泡を放出し、3時間後に組織をインキュベーターに戻し、インサートの底を吸収材にロットします。次に、非着色剤液体試験品の水中抽出のために、インサートをウェルあたり2ミリリットルの適切な抽出溶液を含む予め標識された24ウェルプレートに浸し、固体または液体着色剤の非水中抽出を行います。

インサートを、ウェルあたり1ミリリットルの抽出溶液を含む事前に標識された6ウェルプレートに移します。次に、プレートをヒートシーラーまたはパラフォームでシールして蒸発を抑制し、オービタルシェーカーで室温で2〜3時間抽出し、水中抽出の最後に穏やかに振とうします。組織を突き刺し、各インサート内の液体をデカントして戻してから、組織と一緒にインサートを廃棄します。

各ウェルで抽出溶液を混合し、各サンプルの200マイクロリットルのアリコートを、非水中抽出の最後に図に示されているように、事前に標識された96ウェルプレートの適切なウェルに移します。インサートとティッシュをピアスせずに廃棄し、それぞれに1ミリリットルの抽出液を追加します。ウェルで抽出溶液を混合し、各サンプルから2つの200マイクロリットルのアリコートを、先ほど示したように、事前に標識された96ウェルプレートの適切なウェルに移します。

最後に、参照フィルターを使用せずに、96ウェル分光光度計で570ナノメートルの波長でサンプルの光学密度を読み取り、結果をスプレッドシートに入力して、それぞれの組織負債を計算します。この実験では、ここのテキストプロトコルに示されているように、テストの化学的干渉による修正を考慮し、10個のテスト記事で実施された代表的な眼刺激性テスト結果と陰性および陽性のコントロールが示されています。100%の組織生存率に対応するネガティブコントロールの平均光学密度1.31が観察され、31.2%の相対組織生存率で観察されましたポジティブコントロール試験品1、2、4、7、および8は、60%を超える組織変動を示し、これらの記事を非刺激性試験品3、5、6、9、および10として分類しました。

一方、組織変動は60%以下であり、刺激物として分類されました。この実験における重複組織間の組織生存率の差は、試験論文2を除くすべての論文で20%未満でした。したがって、試験物2を除くすべての試験物品の結果は、眼刺激性試験の受け入れ基準をすべて満たしていたため、適格であると見なされました。

このビデオを見た後、組織モデル4のようなin vitro再建ヒト角膜、化学物質の危険性識別標識を利用して、DICATIONテストをどのように実行すべきかをよく理解しているはずです。この手順は、階層テスト戦略の一部として EOC D テスト ガイドラインに実装されています。