Name: 再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学ぶ眼刺激性試験法で、再構成ヒト角膜上皮様組織モデルを用いて化学物質の眼刺激性を評価する。MTTアッセイで細胞生存率を測定し、動物実験を代替する信頼性の高い毒性評価を実現する。

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著者は、EITプロジェクト専用の彼の科学的な支援と時間のためにドクター・ジョンHarbellに感謝したいと思います。著者らはまた、バイヤスドルフAG（ドイツ）、IIVS（米国）、メアリーケイ社（米国）、エイボンプロダクツ社（米国）、プロクター・アンド・ギャンブル/ Cosmital（スイス）、ラボラトリーピエール・ファーブル（フランス）に感謝したいと思いますハーランラボラトリーズ（イギリス）、および眼刺激性試験15の多施設国際事前検証と検証研究に参加するためのLVMH Parfume（フランス）。

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この記事の発行手数料はマテック社が支払われました。

我々はEpiOcular組織モデルのために開発された眼刺激性試験（ 図1）を提示しています。 GHS区分とを区別しない、本明細書に提示されるようEITは、感度と特異17 EITを度の高いラベル（GHSなしカテゴリ）を必要としない材料から眼刺激物や腐食（GHSカテゴリー1と2を組み合わせ）を分離することができます1カテゴリからの2物質。 EITは、化粧品および医薬成分を含む化学物質の広い範囲の眼刺激性の分類と表示のために検証されました。他のin vitro試験に関連して、EITは、in vivoウサギ眼刺激性試験の代替として機能します。 EITは露光および露光後のインキュベーション期間の長さ（ 図1）に変化する液体および固体材料のための2つの類似するが異なるプロトコルを使用します。 EITで使用するエンドポイント以前に検証されたヒト上皮組織モデル20,21で使用されているMTTアッセイによって決定し、組織の生存率です。このアッセイを行うために、標準的な細胞培養装置の他に特別な装置が必要とされません。高い組織対組織の再現性のレベル、n ​​= 2の組織の代わりに通常推奨されるN = 3が使用されます。それはそれによって個々の組織14の異なる取り扱いをすると生じる可能性がアッセイのばらつきを最小限に抑え、同時に2つの組織を処理するために、経験豊富なオペレータを可能にするため、2組織を使用し、N =能力は、プロトコルの重要な側面です。また、陽性対照および陰性対照と一緒に、被験物質あたりn = 2の組織、同一の物理的状態（液体または固体）の10の試験物質の刺激を用いて、1キット（24組織）を用いて評価することができます。 材料の信頼性の分類を確保する他の重要なポイントは、陽性コントロールのsuの仕様ですbstance（組織生存率≤50.0％）、重複した組織（差&lt;20.0％）、およびネガティブコントロールOD読み取り値（&gt; 0.8 &lt;2.5）との間の再現性。 EIT試験を行う場合、インキュベーション期間中にプロトコルまたは変化の偏差が変化した結果をもたらすことができるので、それは、検証プロトコルと推奨投薬およびすすぎスケジュール（ 表3および4）に接着することが重要です。同様に、MTTインキュベーションのための3時間の時間からの偏差は異なるMTTの読みになり、アッセイの結果に影響を与える可能性があります。 時折、試験化学物質は、MTT組織生存率アッセイ又はMTTの原因の減少を妨害することができる光学的または他の特性を有していてもよいです。例えば、試験化学物質を直接青紫色の反応生成物にMTTを低減することができる、またはMTTホルマザン（〜570ナノメートル）と同じ範囲の光を吸収する着色された物質であってもよいです。しかし、これらの試験の化学物質はPRますMTTアッセイの際に、材料の十分な量は、依然として上に存在する（またはによって吸収）である場合にのみ、組織の問題をESENT。この干渉を回避するために、大規模な洗浄手順は、EITプロトコルに組み込まれています。すすぎはTAを削除しないとTAはMTT還元を妨害した場合、追加のコントロールはそれを検出し、修正するために使用されなければなりません。被験物質の直接MTT還元が疑われる場合に簡単に説明すると、当該化学物質の50μlの（又は固体50 mg）をSCC（NC、滅菌脱イオン水50μlで作業MTT溶液で3時間インキュベートする、であるべきです同時に実行）。 MTT溶液が青紫色になった場合、試験物品を、MTTが低下していると推定されます。この場合、凍結殺し組織コントロールを使用して機能的なチェックは、試験物質は、組織に結合し、偽のMTT低減信号に先行しているかどうかを評価するために行われるべきです。 TA-さらされ、殺された組織制御でかなりのMTT還元がある場合（未処理の生存組織内の量に対して）、試験品の平均組織の生存率は、殺された対照の平均生存率を差し引くことにより補正しなければなりません。 偽陰性分類14,15,18の発生率が低いことによって実証されるように、EITは、安全性の側面に誤差が生じるが。重要なのは、目には腐食性であり、GHS区分1の化学物質のいずれもが、最も深刻な眼の危険性を表していませんこのアッセイ14,15,18,19に非刺激性として分類されました。最後に、 インビトロ試験方法で RHCEの主要な利点の一つは、原液と（2次元、沈められた細胞培養物では不可能である）固体材料を試験する可能性があります。 EITは、国連GHS分類および表示システムによる材料の広い範囲の眼刺激性を決定する際に重要な一因になります。 Oを決定するために、動物の交換cular毒性は、長年にわたって毒物学研究の目標でした。 EIT試験方法は、2014年にEURL ECVAMでサポートされている正式なバリデーション試験を完了したとEpiOcular EITは、2015年にはOECD TG 492としてOECDテストガイドラインに実装されました。

このような化粧品、洗剤、家庭用クリーナーとして消費者製品は、彼らが目に連絡した場合、重大な損傷を誘発する可能性が種々の化学物質が含まれています。そのため、目への刺激のためのこれらの薬剤のテストは、消費者の安全を確保するための1、米国とEUの規制当局によって必要とされます。混合物および製剤の眼刺激性の評価はまた、化学物質の輸送のためのEUの化粧品指令の下で化粧品成分の標識のためにREACH（登録、評価、認可および化学物質の使用制限）法律を遵守する要件である、とのために殺虫剤や家庭用製品2のラベル。現在、規制当局は、化学品の分類およびラベリングに関する世界調和システム（GHS）3を用いて、眼のハザード評価が必要です。 GHSは、主にドレイズ眼刺激性試験に基づいており、最も広く使用されている眼刺激アッセイもので異物とマイルxturesは、ウサギの眼4の結膜嚢に直接導入されています。 GHS分類によると、GHS区分1（眼腐食）は、露光3,5以下の21日以内に眼の組織または完全に可逆的ではない、目と視力に重大な損傷に深刻な最初の損傷の原因となる化学物質をテストすることを指します。 GHS区分2は、露出の21日以内に完全に可逆的で目に有意な変化を生じる化学物質をテストすることを指します。腐食性または刺激性物質ではない試験化学物質はGHSはありませんカテゴリと呼ばれています。 40年以上にわたり、ドレイズウサギの目のテストでは、その再現性の欠如、人間の応答の過大評価、そして生きている動物5-8の使用のために批判されています。これらの懸念は、洗練、縮小、およびin vivo試験 9の交換のための多くの提案を奨励しています。検証非動物代替物の必要性がさらに強化されました（2009年）化粧品（2005年）化粧品の安全性評価における動物の使用を禁止指令、および成分に第七改正の採用により2。 1996年から、再構成された角膜のような組織モデルは、広く目、原料、界面活性剤ベースの製剤、および、または近傍で使用するために設計された配合混合物の刺激性を評価するために化粧品業界で使用されています10-13。 RHCEの組織モデルの使用は、その本来の、希釈しない形で、組織表面への試験物質の直接局所適用することができます。この方法では、非水溶性製剤は溶剤でそれらを希釈することなく試験することができます。 （代替法の検証のための欧州連合（EU）のリファレンスラボラトリーヨーロッパセンター）EURL ECVAMのに対応して広く、該当簡単で、経済法の要求SINGLを利用眼刺激性試験（EIT）電子露光時間とラベリングを必要としない材料から眼刺激物や腐食を分離することができる（図1）14を開発しました。 83化学物質（44液体および39固体）の結果をもとに、EITは95.5 / 68.2 /と81.8パーセントの感度/特異度と精度（SS＆A）液体のため、固体のための100.0 / 68.4 /と84.6パーセントSS＆A、および97.6を/達成しました68.3 /と全体のSS＆Aの83.1パーセント。 2007年には、EURL ECVAMの後援化粧品ヨーロッパ（旧COLIPA）が主催する多実験室前の検証研究では、正式な検証15にそれをもたらすことを目的としたEITの妥当性と信頼性を評価しました。本研究では、298の独立した試験では、7つの独立の研究室で行いました。研究結果は、すべての参加研究室15全体の変動の低い係数の予測で99.7％の契約を実証しました。その結果、2010年にはEITプロトコルは正式なEURL ECVAMに入りました検証プログラム。バリデーション試験は、in vivoでの参照データ（ドレイズ眼刺激性データ）が利用可能であった対象の個々の物質と化学の混合物、を含む104コード化されたテスト化学物質を利用しました。この作品の成功に基づき、OECDドラフトテストガイドラインには、それは、EITは、国連GHS分類および表示システムによる材料の広い範囲の眼刺激性の分類に大きく貢献することが期待される2014年に提出されました。

再構成ヒト角膜上皮様（rhce）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（eit）

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

EU化粧品指令、欧州REACH法規に第七改正に準拠するために、ヒトの眼毒性の信頼性と正確な評価のための検証非動物代替の方法が必要とされています。このニーズに応えるために、我々は正常なヒト細胞に基づいて3次元再構成人間の角膜のような上皮（RHCE）組織モデルを利用した眼刺激性試験（EIT）を開発しました。 EITは、眼刺激物や腐食（GHSカテゴリー1と2を組み合わせ）とラベリング（GHSなしカテゴリ）を必要としないものを分離することができます。テストは、2つの別々のプロトコル、液体化学物質と第二のために設計された1つ、固体試験物品のための同様のプロトコルを利用しています。 EIT予測モデルは、単一の露光期間（液体で30分間、固形分6時間）、および単一の組織の生存率のカットオフ（MTTアッセイによって決定される60.0％）を使用します。 EITは95.5 / 68.2 / 81.8パーセントとのSENSを達成した（44液体および固体39）83化学物質の結果に基づいて、液体用itivity /特異性と精度（SS＆A）、100.0 / 68.4 / 84.6パーセントとSS＆A固体用、および97.6 / 68.3 /と全体のSS＆Aの83.1パーセント。 EITは、規制テスト要件を満たすために、動物を使用することなく、液体及び固体の化学物質の広範囲の眼刺激性を分類に大きく貢献します。 EpiOcular EIT法は、TG 492としてOECDテストガイドラインに2015年に実施されました。

我々は、3次元再構成人間の角膜のような上皮（RHCE）組織モデルを利用した眼刺激性試験を開発しました。テストは、眼刺激性及び腐食性物質（GHSカテゴリー1と組み合わせた2）とラベル（GHSなしカテゴリ）を必要としないものとを区別することができます。

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

眼刺激性試験の全体的な目的は、物質および混合物をその眼刺激性の可能性に基づいて分類およびラベル付けすることです。この手順では、3次元再構築角膜様組織モデルを使用します。試験キットが届いた後、アッセイ培地で一晩事前インキュベーションを行い、翌日に組織を水和させます。その後、ポジティブコントロール、ネガティブコントロール、および目的の試験化学物質を、組織表面に2連（duplicate）で局所適用します。一定期間の曝露後、洗浄によって試験化学物質を除去します。組織を新鮮なアッセイ培地で後インキュベートし、その後MTTアッセイによって化学物質の毒性を評価します。最終的に、試験物質処理組織の相対的な生存率を陰性対照処理組織と比較することで、試験物質の刺激性を評価することができます。迅速眼刺激試験などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、実験動物を用いないことです。本手法では、正常なヒト細胞で構成される、in vitroの再構成角膜様眼組織モデルを利用します。あらゆる種類の物質および混合物に適用可能であり、眼刺激または深刻な眼損傷を誘発する化学物質を、それ以外の材料から識別することができます。分類および表示を必要としない非刺激性物質。再構築ヒト角膜様上皮組織（EpiOcular）は、細胞に栄養素を供給するための多孔質膜を備えたインサート内で調製されます。再構成組織は、漸進的に層形成されるが角化していない細胞によって、角膜上皮をモデル化した非角化上皮を形成します。ヒト角膜様上皮キットを受け取ったら、24ウェル配送容器内の組織を室温に慣らしてください。15分後、無菌条件下で24ウェル組織プレートが入ったバッグを開き、アグロスゲルとインサートの間に気泡がないかすべての組織を確認します。カットしてください。テープを開けます。滅菌ガーゼを用いてカバーを取り除き、組織表面を確認します。次に、37 °Cに温めたキットのアッセイ培地1 mLを、あらかじめラベルを貼った6ウェルプレートの各ウェルに分注します。その後、滅菌ピンセットを使用して、インサートに入った組織を滅菌ガーゼで軽く押さえ、輸送液を完全に取り除いてから、6ウェルプレートの各ウェルに個別に配置します。1時間後、培地を1 mLの新鮮な37 °Cのアッセイ培地と交換し、組織を標準的な培養条件下で一晩インキュベートします。翌日、各組織の頂端面に20 µLのカルシウム・マグネシウムフリーDPBSを滴下します。DPBSが組織全体に広がらない場合は、ピンセットでインサートを軽く固定し、プレートを軽く叩いて、生理食塩水が組織表面全体を濡らすようにしてください。プレートを30分間インキュベートします。次に、液体試験物質で組織を処理するために、タイムテーブルに従って陰性対照、陽性対照、および適切な試験物質をそれぞれ50 µLずつ2連（duplicate）で添加します。処理剤が組織表面全体を覆うように注意し、その後、固体試験物質で組織を処理するためにインサートを30分間インキュベートします。まず、インサートを滅菌済みの表面に移動させます。空気中の固形粒子による汚染を防ぐため、プレートは蓋をしたままにしておきます。次に、水平にしたスプーンを用いて、タイムテーブルに従い、テスト物質 50 milligrams を重複した組織上に局所的に塗布し、処理剤が組織表面全体を覆うように注意してください。あるいは、先端を切断した1 mLの充填済みシリンジを使用します。粉末を培養物に直接配置してください。固形試験物質を適用した直後にプランジャーを押し下げて粉末を塗布し、インサートを6ウェルプレートに戻して、組織を洗浄するために6時間インキュベートします。処理後、曝露インキュベーションの終了時に、被験物質1つにつき150 milliliterのビーカー3個に100 millilitersのDPBSを満たします。曲がったピンセットでインサートの上端を掴み、ウェルから取り出します。次に、ピンセットを使用して、同じ処理のインサート2つを上端から持ち上げ、処理液を清潔な吸収材の上にデカンテーションします。次に、インサートを1つ目のDPBSが入ったビーカーに浸し、円を描くように回しながら2秒間組織を洗浄します。その後、インサートの大部分にDPBSが入った状態で引き上げ、液体をビーカーに戻します。1つ目のビーカーでこの洗浄を2回繰り返します。その後、最後の洗浄と同様の手順で、DPBSが入った2つ目と3つ目のビーカーでインサートをそれぞれ3回ずつすすぎます。各インサートを約45度の角度に傾け、開口部を下に向けて、上端を吸水材に触れさせて残っているDPBSを捨てます。その後、すぐに組織を5 mLの室温のアッセイ培地に浸します。浸漬期間の終了後、あらかじめラベルを貼った12ウェルプレートからアッセイ培地をデカントし、インサートを吸収材でブロットします。次に、インサートを、1ウェルあたり1 mLの温めたアッセイ培地を含む新しい6ウェルプレートに移し、インキュベーターに入れてMTT生存率アッセイを開始します。その後、インサートを、0.3 mLの調製直後のMTT溶液を含む24ウェルプレートに移します。転移させる前に、インサートを吸収材で軽く叩いて水分を取り除きます。インサートの下に溜まった気泡を出し、3時間後に組織をインキュベーターに戻し、インサートの底部を吸収材の上に置きます。次に、非着色液体試験物質の浸漬抽出では、あらかじめラベルを貼った24ウェルプレートに、1ウェルあたり2 mLの適切な抽出液を入れてインサートを浸します。固体または液体の着色物質の非浸漬抽出についても同様に行います。あらかじめラベルを貼った6ウェルプレートに、1ウェルあたり1 mLの抽出液を入れておき、そこにインサートを移します。次に、蒸発を防ぐためにヒートシーラーまたはパラフィルムでプレートを密閉し、室温で2〜3時間、オービタルシェーカーを用いて抽出します。浸漬抽出の最後には、緩やかに振盪させてください。組織を突き刺し、各インサート内の液体をウェルに戻した後、組織が入ったインサートを廃棄します。各ウェルの抽出液を混合し、非浸漬抽出の最後にある概略図に示されるように、各サンプルから200 µLずつ2回分を、あらかじめラベルを貼った96ウェルプレートの適切なウェルに分注します。インサートと組織を、刺さずに廃棄し、それぞれに1 mLの抽出液を加えます。ウェル内の抽出液を十分に混合し、先ほど示した通り、各サンプルから200 µLずつ2回分を、ラベル貼りのある96ウェルプレートの適切なウェルに分注します。最後に、リファレンスフィルターを使用せずに、96ウェル分光光度計を用いて570 nanometerの波長でサンプルの吸光度を測定し、それぞれの組織生存率を算出するために結果をスプレッドシートに入力します。ここにあるテキストプロトコルに示されている通り、試験化学物質による干渉に伴う補正を考慮してください。本実験では、10種類の試験物質および陰性・陽性対照を用いて実施された眼刺激性試験の代表的な結果を示しています。100%の組織生存率に対応する陰性対照の平均吸光度は1.31であり、陽性対照の相対的組織生存率は31.2%でした。試験物質1、2、4、7および8は60%以上の組織生存率を示し、これらの物質は非刺激性として分類されました。また、試験物質3、5、6、9および10についても同様です。一方で、組織生存率が60%以下であったため、これらは刺激物として分類されました。本実験における重複組織間の組織生存率の差は、試験物質2を除き、試験したすべての物質で20%未満でした。したがって、試験物質2を除くすべての試験物質の結果は、眼刺激性試験のすべての許容基準を満たしていたため、適格であると判断されました。このビデオを視聴することで、化学物質の危険性特定ラベル付けにおける、in vitro 再構築ヒト角膜様組織モデル4を用いたDICATION試験の実施方法について十分に理解することができます。この手順は、階層的試験戦略の一環として、EOC D試験ガイドラインに導入されています。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このビデオでは、我々は表皮の皮膚刺激性試験（表皮SIT）のために開発および検証を実証する...

アンインビトロ</em表皮を使用して>皮膚刺激性試験（SIT）は、ヒト上皮（RHE）モデルを再構築

我々は、形態学、生理学、極性、および成人のネイティブ組織の蛋白質と遺伝子の発現パターンを示すことを人間の胎児の網膜色素上皮細胞（hfRPE）細胞の培養コンフルエントな単層のための再現可能な方法を提供する。この作品は、いくつかの眼疾患の動物モデルに拡張されています。...

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

この報告では、ラット涙腺抽出物、オボアルブミン、完全フロインドアジュバントのエマルジョンで免疫化した後、涙腺下涙腺および涙腺に涙腺抽出物およびオボアルブミンを注入することにより、Lewisラットにおいて慢性的な実験的自己免疫ドライアイを誘導する方法が記載されている6週間後。...

眼球組織におけるエフェクター記憶T細胞の増加を伴う慢性自己免疫ドライアイラットモデル

高スループットと小さな抑制 RNA スクリーニングはより急速に化学角膜上皮傷害の分子機構を解明するために助けることができる重要なツールです。ここで、開発と露出モデルとフッ化水素とクロルピクリンによる角膜上皮障害の高スループット...

クロルピクリンとフッ化水素誘起角膜上皮細胞傷害のための高スループット SiRNA スクリーニング

この記事では、眼窩涙腺系のすべての部分にコンカナリンAを注入することによって、ウサギの急性または慢性ドライアイ病を誘発する方法の開発について説明します。この方法は、既に報告されているものよりも優れ、薬理剤の研究に適したドライアイの再現性、安定モデルを生成する。...

コンカナバリンによる涙腺への注射によって誘発される水性欠損性ドライアイ病のウサギモデル:薬物有効性研究への応用

このプロトコルの目的は、異なる人工涙液製剤が、インビトロモデルを用いてヒト角膜上皮細胞を乾燥から保護できるかどうかを評価することです。人工涙液製剤および乾燥液への曝露後、ヒト角膜上皮細胞は代謝活性について評価される。...

乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

このプロトコルは、再現性と堅牢な方法で三次元再構成ヒト表皮を栽培するための簡単な方法を記述する。さらに、表皮バリアモデルの構造機能関係を特徴付けます。炎症促進刺激の際に再構成されたヒト表皮の生物学的応答も提示される。...

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。...

初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定

ここでは、角膜上皮の機械的および化学的損傷のためにマウスとウサギに基づく動物モデルを開発し、新しい治療法とそのメカニズムをスクリーニングします。...

角膜上皮の機械的および化学的損傷のためのEx Vivoおよびin vivo動物モデル

臓器培養ブタ角膜および上皮創傷治癒を用いた治療毒性および化学的毒性の評価

ウサギの角膜間質創傷修復のための現場ブルーライト交差ゲラチンリボフラビンハイドロゲルの調製、濃縮、適用に関する再現可能なプロトコルを提示し、手術的取り扱い、部分的な足蘠切除術、術後ケアの手技手順を含みます。...

ウサギの角膜創傷修復のための強化光交連ゲラチン–リボフラビンハイドロゲルの製造および外科的応用

学ぶ眼刺激性試験法で、再構成ヒト角膜上皮様組織モデルを用いて化学物質の眼刺激性を評価する。MTTアッセイで細胞生存率を測定し、動物実験を代替する信頼性の高い毒性評価を実現する。

再構成ヒト角膜上皮様（RHCE）組織モデルを使用して眼刺激性化学物質の有害性の同定のための眼刺激性試験（EIT）

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