マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

本手順の目的は、マウス初代肝細胞における脂肪酸代謝を評価することです。まず、消化培地を用いてマウス肝臓を灌流し、肝臓を摘出した後、肝細胞を単離します。次に、コラーゲンコートしたプレート上で肝細胞を培養します。

次に、肝細胞をテストしたい試験的な介入操作で処理します。最終ステップは、放射標識された基質存在下で細胞をインキュベートすることです。最終的に、液体シンチレーション分析を用いて、一次肝細胞における脂肪酸酸化または脂質合成に対する、さまざまな薬理学的または遺伝学的介入の効果を明らかにします。

この手法は、特定の薬理学的および遺伝学的介入が肝細胞の生物学にどのような影響を与えるかを含め、代謝および糖尿病分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法を視覚的に実演することは、2つの理由から極めて重要です。1つ目は、肝細胞の健全性に影響を与える特定の灌流条件を得ることが困難であること、2つ目は、放出される二酸化炭素の定量化が必要であることです。

ガスの取り扱いは直感的ではありません。この手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるTom Akeyです。滅菌チューブの一端を予熱した肝灌流培地に、もう一端を廃棄容器に配置し、ペリスタルティックポンプをセットアップします。

チューブ全体に培地が満たされるまでポンプを作動させます。対象のマウスを安楽死させた後、マウスの腹部を70% ethanolで十分に噴霧します。次に、鈍端鋏を用いて真皮に沿って腹部の正中線に切開を加え、側方に反転させます。

腹膜に同様の切開を加え、内臓を露出させます。鈍的な器具を用いて、腸管をそっとずらします。腹部血管系を露出させるため、腹部下大静脈を確認し、腎静脈より遠位の血管の下に縫合糸を配置します。縫合糸よりもさらに遠位に配置してください。

下大静脈に針とカテーテルを挿入し、縫合糸を越えて進めます。針を入れたまま、カテーテルを固定するために縫合糸をカテーテルの周囲で結び、その後、慎重に針を抜きます。正しく行われていれば、ピペットを使用してカテーテルから血液が流れます。

カテーターの残りの領域に灌流液を満たし、気泡が入っていないことを確認します。その後、細心の注意を払ってチューブをカテーターに接続します。次に、鋭い先端のハサミで横隔膜を慎重に穿刺し、側切開を行って胸腔を露出させます。

胆嚢および胸膜血管を避けるように注意しながら、肝静脈のすぐ近位側で胸部下大静脈をブルドッグクランプで遮断します。次に門脈を切断し、ポンプを3～4 mL/minに設定して作動させます。約20 mLの肝灌流液を用い、5分間肝臓を灌流します。

この間に、肝臓の色が赤からグレーがかった褐色に即座に変化するのを観察します。肝臓の一部が赤いままである場合は、灌流不全を示しており、分離が成功する可能性は大幅に低下します。5分間の灌流後、ポンプを停止し、チューブを肝臓消化剤培地へ移します。

ポンプを再起動し、さらに10～15分間、肝臓を灌流します。培地がなくなるまで、1分間に3～4 mLの速度で灌流してください。灌流終了後、ポンプを停止します。

肝臓は淡いピンク色を呈し、やや腫大しているはずです。この時点で、慎重に解剖して肝臓を摘出します。10 cmの組織培養皿に移し、胆嚢を除去します。

次に、肝臓に10 millilitersの播種培地を加え、メスを用いて肝臓を穏やかに掻き出します。肝細胞を回収するため、懸濁液を100 micronのセルストレーナーでろ過し、50 milliliterのコニカルチューブに移します。プレートをさらに10 millilitersの播種培地で洗浄し、その液を50 milliliterのコニカルチューブに回収します。

次に、4°Cで350 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、培地を吸引除去した後、細胞ペレットを10 mLの播種用培地で再懸濁します。続いて、ポリビニルピロールでコーティングした90%コロイダルシリカを10 mL加え、穏やかに混ぜた後、前述と同様に細胞をペレット化します。遠心分離後、混合物の上層に浮遊している死細胞層を吸引除去します。

次に、回収した生細胞ペレットを20 mLの播種用培地で2回洗浄します。最終的な細胞ペレットを10 mLの播種用培地に再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。コラーゲンコートした24ウェル培養プレートの各ウェルに90,000個の細胞を播種し、アッセイ開始の16〜20時間前に、37 °C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。

細胞を温めたPBSで2回洗浄し、20 nanomolesのグルカゴンを含む血清不活化飢餓培地に置換します。アッセイ実施日の前日に、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で細胞を一晩インキュベートします。

前インキュベーション用培地を調製し、その後、血清飢餓状態に置換します。前インキュベーション用培地を用います。インキュベーション中、細胞をこの混合液中で37 °C、5% CO2の条件下で2時間インキュベートします。

窒素気流下でエタノール溶媒を蒸発させ、1ウェルあたり0.5 µCiのC 14 palmitateを乾燥させます。インキュベーション終了の約15分前に、0.1 N 水酸化ナトリウム中でC 14 palmitateを1 µCiあたり12.5 µLの割合で再懸濁します。この混合物を70 °Cで10分間インキュベートします。その後、3倍量の加温したプレインキュベーション培地を加え、ピペッティングにより混合します。

プレートを静かに揺らしながら、希釈したC 14パルミチン酸ミックスを各ウェルに25 µLずつ添加し、37 °Cで90分間インキュベートします。これがアッセイプレートとなります。インキュベート中に、滅菌済みの24ウェルプレートからカバーを取り外し、各ウェルの底に2 cm × 2 cmのフィルターペーパーを1枚ずつ配置します。次に、マイクロピペットチップボックスのような大きな長方形の物体を使用して、4インチ × 7インチのパラフィルムでプレートを覆います。

パラフォームをウェル部分でこすり、ウェル開口部を穿孔させ、プレートの残りの部分にシールを作成します。次に、穿孔したパラフォームの円形部分を取り除きます。インキュベーション終了の10分前に、フィルターペーパープレートの各ウェルに3 N 水酸化ナトリウムを 200 µL 加え、フィルターペーパーがすべての液体を吸収するようにしてください。

インキュベーション終了後、アッセイプレートを液体窒素で急冷します。次に、アッセイプレートの各ウェルに70%過塩素酸を100 µLずつ加えます。直ちにフィルターペーパープレートで覆い、プレートをオービタルシェーカーに設置します。

プレートを室温で80 RPMのオービタル速度で2時間振とうします。次に、フィルターペーパーの正方形をシンチレーションバイアルに入れた4 mLの液体シンチレーション液に転送して二酸化炭素画分を測定し、シンチレーションカウンターでC 14信号を測定して酸可溶性物質を定量します。培地400 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、最大速度で10分間遠心分離した後、得られた上清100 µLをクロロホルムとメタノールの2:1混合液500 µLに加えます。

混合物を短時間ボルテックスした後、250 µLの水を加えてさらにボルテックスします。再度、サンプルを1,000 Gで10分間遠心分離します。次に、上清相を200 µL取り、シンチレーションバイアルに入れた4 mLの液体シンチレーション液に加え、細胞を血清飢餓状態にした後、C 14信号を測定します。その後、細胞を脂質合成培地に変更します。

試験したい化合物を添加し、インキュベーション期間後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。PBSで細胞を2回洗浄し、0.1 N 塩酸を120 µL添加して細胞を溶解させます。各ウェルをスクレイピングしてライセートを回収し、ライセート 100 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。

次に、クロロホルムとメタノールの2:1混合液を500 µLずつ各チューブに加えます。短時間ボルテックスした後、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、250 µLの水を加え、ボルテックスし、さらに室温で5分間サンプルをインキュベートします。

次に、サンプルを3000 Gsで10分間遠心分離します。分離した液の下層を慎重にシンチレーションバイアル内の4 mLの液体シンチレーション液に移し、シンチレーションカウンターを用いてトリチウム活性を測定します。この手順により、通常、マウス1匹あたり1,000万から3,000万個の肝細胞が単離されます。一晩インキュベートした後、生存細胞は六角形に見え、その多くには核が認められます。

不健康な培養物には、細胞死を示す顆粒やブレブ（水疱）が含まれていることがよくあります。ここでは、完全酸化を測定するために、細胞呼吸促進剤であるF-C-C-P-Aおよび呼吸抑制剤であるオリゴマイシンの添加を、ビークルコントロールと比較した脂肪酸酸化アッセイの結果を示しています。二酸化炭素と酸可溶性物質の比率を算出します。

FCCPなどの細胞呼吸を促進する物質は、この比率を二酸化炭素側にシフトさせ、TCAサイクルによる酸化の促進を示します。呼吸鎖阻害剤は、測定時の全体的な酸化を減少させます。lipo活性化合物において、FCCPのように脂肪酸酸化を促進するものや、オリゴマイシンのようにTP合成を減少させるものは、ビークルコントロールと比較して、培養肝細胞におけるlipo活性を低下させます。この手順を行う際は、動物の犠牲後、灌流が完全かつ適時に行われることを確認することが重要です。

さらに、脂肪酸酸化アッセイにおいて、二酸化炭素ガスの再現性のある測定を行うには、培地を完全に凍結させることが極めて重要です。このビデオを視聴することで、初代肝細胞の単離方法、およびこれらの細胞を用いてin vitroで脂肪酸酸化と脂質合成を分析する方法について十分に理解できるはずです。