Name: マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-27T15:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学ぶマウス初代肝細胞における脂肪酸酸化と脂質生成の定量法。灌流分離と液体シンチレーション分析により、薬理学的・遺伝学的介入が代謝経路に与える影響を評価し、脂肪肝疾患などの治療戦略開発に貢献する。

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私たちは、肝細胞単離プロトコルの技術的側面について、Susan Gray氏とUmadevi Chalasani氏に感謝したいと思います。この作業は、NIDDK助成金5R01DK089185(M.P.クーパー宛)およびUMMSのDERCパイロットおよびフィージビリティプログラム(M.P.クーパー宛)によって支援されました。

すべての動物実験は、ローカルおよび連邦規制に従って及び制度IACUCと放射線安全管理の承認を得て実施されるべきです。 1.準備<ol><li>数日前、アッセイに、肝臓ダイジェストミディアム（LDM）の500ミリリットル瓶を解凍し、50mlのコニカルチューブに〜35ミリリットルのアリコートを再凍結。必要になるまで-20℃で保存してください。 </li><li>アッセイの1日前に、オートクレーブによりクリーンな解剖ツールを事前に滅菌します。 </li><li>アッセイの日に、コラーゲンとの24ウェル培養プレートの必要な量を扱います。 <ol><li> PBSの50部で3 mg / mlのラット尾コラーゲン1部を混合します。 24ウェルプレートの各ウェルに約500μLを加え、室温（RT）で3~5分間インキュベートします。コラーゲンを外し、プレートをフード内空気乾燥することができます。少なくとも一つの追加の時間を繰り返します。 注意：コラーゲンコーティングが広告に1週間まで行うことができますヴァンス、プレートをプラスチックラップで密封し、4℃で保存しました。 </li></ol></li><li> 37℃に解凍LDMと暖かいと1N KOHを使用してpHを7.4に調整します。アッセイのLDMを準備します。再循環を42℃の水浴中で、0.2μmのシリンジフィルターと場所を使用してフィルタ。 </li><li>水浴を再循環で42°Cまでの肝灌流中のウォーム25ミリリットル。 </li><li>ポリビニルピロリドンの溶液を塗布し、90％のコロイダルシリカを準備します。ポリビニルピロリドンで被覆されたコロイド状シリカの9ミリリットルに10倍のDPBS 1ミリリットルを追加します。 0.1 N HClを用いてpHを7.4に調整します。滅菌0.2μmのシリンジフィルターでろ過します。室温で保管してください。 </li><li> 37°Cまでのめっき中暖かいです。 </li></ol>初代マウス肝細胞の単離2。 <ol><li>蠕動ポンプ、チューブ、および解剖テーブルを設定します。滅菌水10ml、続いて蒸留水で5ミリリットルの70％エタノールで洗浄することによりチューブを滅菌します。埋めるために肝灌流培地でチューブと実行ポンプを配置しますチューブの全長。 </li><li>制度承認の方法により、マウスを生け贄に捧げます。 </li><li>腹腔を開き、解剖70％エタノールで自由にマウスの腹部スプレー。平滑末端はさみを使用して、真皮を通って腹部の長さを正中切開を行い、横方向に反映しています。内臓を露出するために腹膜に同様の切開を行います。 <ol><li>鈍器を使用して、静かに腎静脈の遠位に、腹部下大静脈（IVC）を見つけて、血管の下に縫合糸を配置腹部血管系を露出するように腸を変位</li></ol></li><li>遠位縫合糸に、縫合糸のレベルを超えて、それを進める、IVCに針やカテーテルを配置します。まだ場所に針で、所定の位置に保持するために、カテーテルの周りに縫合糸を結びます。慎重に針を取り除きます。カテーテルを通して流れに血液、正しく行われた場合。 </li><li>ピペットを使用することで、確実に、灌流媒体とカテーテル内の残りの領域を埋めます空気が存在しません。細心の注意を払って、カテーテルにチューブを取り付けます。 </li><li>肺の空洞を開く解剖：優しくダイヤフラムを露出するために、優れた肝葉を反映しています。慎重に胆嚢と胸膜血管系を避けるように注意しながら、胸膜腔を露出するために、横方向の切開を行い、その後、鋭い先端のハサミで隔膜を穿刺。肝静脈のすぐ近位胸部下大静脈の周りブルドッグクランプを配置します。 </li><li>門脈をカットし、3でポンプの電源をオンに - 4ミリリットル/分。灌流培地の約20ミリリットルを用いて5分間肝灌流培地で肝臓を灌流。 注：肝臓はすぐにグレー/黄褐色に赤から変更する必要があります。肝臓の部分が赤のままである場合、これはおそらく乏しい灌流を示し、成功した分離の可能性が大幅に減少します。灌流の間に、媒体が出て実行されず、気泡がチューブに入らないことを保証するように注意してください。 </li><li> 5分間のインキュベーションに続いて、停止しますポンプおよび肝臓ダイジェスト中にチューブを移します。 （媒体がなくなるまで）15分 - ポンプを再起動して、別の10のために肝臓を灌流。 </li><li>灌流の終了時に、ポンプを停止します。肝臓はピンクがかった色合いを持っており、やや拡大表示されます。慎重な切開により、肝臓を切除。胆嚢を削除し、10cmの組織培養皿に肝臓を転送します。 </li><li>バイオセーフティキャビネットでは、肝臓にメッキミディアム（ 表1）の10ミリリットルを追加します。静かに肝細胞を除去するために、いずれかのピンセットやメスを用いて肝臓をこすり。 50mlコニカルチューブに100μmのセルストレーナー、転送を使用してサスペンションをフィルタリングします。 50mlコニカルチューブにめっき中、プールの追加10mlでプレートを洗浄します。 </li><li> 350×gで、4℃で5分間の遠心分離により細胞をペレット化。 </li><li>めっき中の10ml中の培地を吸引し、再懸濁ペレットとPOでコーティングされた90％のコロイダルシリカの10ミリリットルを追加しますlyvinylpyrrolidone。穏やかに混合し、ステップ2.11のように遠心します。生細胞が底にペレット化する一方遠心分離した後、死細胞の層は、混合物の上に浮遊されます。 </li><li>吸引し死んだ細胞および培地。メッキ中、2.11のように遠心20mlで2回洗浄します。 </li><li>めっき中の10ml中に再懸濁細胞。血球計数器で細胞をカウントし、コラーゲン処理した24ウェル培養皿に9×10 4細胞/ウェルで置き。 2時間、37℃の組織培養インキュベーター中でインキュベートします。各プレートは、脂肪酸酸化アッセイまたは脂質生成アッセイのいずれかのために使用することができます。 </li><li>必要に応じて、37℃で維持培地（ 表1）と文化に井戸を変更します。アッセイの結果に影響を与えずに3日 - 細胞を2ために培養することができます。 </li></ol> 3.脂肪酸酸化アッセイ警告：放射能の使用は危険です。すべての購買、保管、取り扱い、およびジ放射性物質のsposalは、制度的状態、および連邦の規制やガイドラインに従って行われるべきです。 <ol><li> 16から20時間アッセイの前に、温かいPBSで細胞を2回洗浄します。 20 nMのグルカゴンで無血清血清飢餓培地（ 表1）に細胞を変更し、37℃で一晩インキュベートします。 注意：ウシ胎児血清は、代謝ホルモンの未知の濃度（ 例えば、インスリン 、グルカゴン）を含んでいるので、血清これはアッセイに持つかもしれない交絡の影響を除去するために、細胞を飢えさせます。細胞は&gt; 24時間血清飢餓培地中で生存可能です。グルカゴン治療は、肝細胞内の脂肪酸酸化を刺激するために使用されます。 </li><li>アッセイの朝に、前培養培地を準備し、10分間70℃で100mMの溶液と熱を加えるために超純水にナトリウムパルミチン酸の適切な量を再懸濁します。一方で、必要量（24ウェルプレートのウェルあたり0.5 ml）を調製25mMのHEPES、1％のBSAフラクションV、および20 nMのグルカゴンを含むDMEMの。 37℃に加熱します。 <ol><li>可溶化した後、培地に250μmの最終濃度にパルミチン酸を追加します。プレインキュベーション中に肝細胞を変更し、37℃で2時間インキュベートします。後で使用するために、37℃で、いくつかのプレインキュベーション中を予約。 </li></ol></li><li>インキュベーションの間、窒素ガス下で蒸発させて14 C-パルミチン酸（0.5μCiの/ウェル）の適切な量を乾燥させます。 <ol><li>例えば、24ウェルプレートで24のサンプルを測定して1.5 mlチューブに0.1μCiの/ mlの14 C-パルミチン酸120μlのを転送します。ゆっくりとヒュームフード3-5センチの距離からの溶液上に窒素ガスを吹き付けてエタノール溶媒を蒸発させます。チューブの底に乾燥14 C-パルミチン酸を残し、40分-溶媒が約30を蒸発させる必要があります。 </li></ol></li><li>約15分間のインキュベーションの終了前に、14を再懸濁0.1 N NaOH中のC-パルミチン酸（12.5μL/マイクロCi）。 70℃で10分間インキュベートします。暖かいプレインキュベーション中の三巻を追加し、ピペッティングにより混和します。 </li><li>希釈された14 C-パルミチン酸の25μlの各ウェルをスパイク。静かにプレートをロッキングすることによって混合し、37℃で90分間インキュベートします。これは、アッセイプレートです。 </li><li>インキュベーションの間、フィルターペーパープレート（ 図1）を作製 。 <ol><li>滅菌24ウェルプレートからカバーを取り外します。各ウェルの底にろ紙の2センチメートル×2センチピースを置きます。 4 &quot;×7&quot;パラフィルムの切れ端でプレートをオーバーレイ。 </li><li>このようなピペットチップボックスとして、大きな長方形のオブジェクトを使用して、ウェル開口部にパラフィルムを穿孔し、プレートの残りの部分の上にシールを作成するために、ウェル上にパラフィルムをこします。今井戸をカバーするパラフィルムの穴あき円を削除します。プレートは現在、しっかりウェルOを除くすべての地域でパラフィルムでカバーされるべきですpenings。 </li></ol></li><li>インキュベーションの終了の10分前に、ろ紙は、液体の全てを吸収し確認して、フィルターペーパープレートの各ウェルに3 N NaOHを200μlを添加します。 <ol><li>必要に応じて前に新鮮な24ウェルプレートにメディアを転送し、凍結します。 PBSで1回洗浄した後、0.1 N HCl中の残りの細胞を溶解し、BCAアッセイによってタンパク質含量を算出します。 </li></ol></li><li>インキュベーションの終了時に、スナップ凍結アッセイプレートを、液体窒素中で。各ウェルは、先に進む前に、完全に凍結されていることを確認するように注意してください。 </li><li>アッセイプレートの各ウェルに70％過塩素酸を100μlのを追加します。すぐにフィルターペーパープレートでカバーしています。室温で2時間80 rpmでの軌道速度でオービタルシェーカーと岩の上にプレートを置きます。 </li><li>インキュベーション後、サンプルを処理します。 <ol><li>シンチレーション4 mlの液体シンチレーション液をろ紙の正方形を転送する、CO 2の画分を測定します14 C信号をバイアルおよび測定します。 </li><li>酸可溶性物質を測定するために、1.5mlマイクロチューブに培地を400μlのを転送します。 10分間最大速度で遠心します。簡単に1クロロホルム - メタノール（v / v）であり、渦：2の500μlに得られた上清を100μlを追加します。 <ol><li>再び混合物に水を250μl加え、ボルテックス。 3000×gで10分間遠心サンプル。シンチレーションバイアルに液体シンチレーション流体4ミリリットルに上相の200μLを移し、14 C信号を測定します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 4.脂質生成アッセイ<ol><li>アッセイの前に開始する夜は、温かいPBSで細胞を2回洗浄します。 100nMのインスリンで血清飢餓中に肝細胞を変更します。 37℃で一晩インキュベートします。 ウシ胎児血清は代謝ホルモンの未知の濃度が含まれているので（ 例えば、インスリン 、グルカゴン注：）、血清がこのアッセイに持つかもしれない交絡の影響を除去するために、細胞を飢えさせます。細胞は&gt; 24時間血清飢餓培地中で生存可能です。インスリンは、脂質生成を刺激するために、このアッセイで使用されます。 </li><li> 100nMのインスリン、10μMの冷たい酢酸および0.5μCiの3 H-アセテートウェル当たりで血清飢餓培地：脂質生成中にします。脂質生成中に細胞を変更し、37℃で2時間インキュベートします。試験しようとする目的の任意の化合物が含まれます。 </li><li>インキュベーション期間の後、PBSで細胞を2回洗浄します。 0.1 N HClを120μlの掻き落とし行ない、細胞を溶解します。リザーブ10タンパク質アッセイ用μL（BCAアッセイにより評価）、および1.5mlマイクロチューブに100μlのを転送します。 </li><li> 1クロロホルム - メタノール（v / v）の：2の500μlに添加することにより、脂質を抽出します。渦は簡単にし、5分間室温でインキュベートします。水、渦の250μLを加え、さらに5分間室温でインキュベートします。遠心サンプル3000×gで、室温で10分。慎重にシンチレーションバイアルに4 mlの液体シンチレーション流体に下相を転送し、3 H活性を測定します。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、利益相反はないことを示しています。

犠牲から灌流までの時間は、肝臓の理想的な灌流およびコラゲナーゼ消化のために3分未満でなければなりません。灌流培地で灌流が開始されると、肝臓はすぐに淡赤からに外観を変更する必要があります。 LDMとのインキュベーションの約10分後、肝臓が腫れてピンク色に表示されます。潅流が不十分である場合には、肝臓はこれらの変化を示さないことがあり、これは典型的にはより低い肝細胞の収率をもたらします。 洗浄工程の後に、単離された肝細胞は、従来のめっきを氷上で懸濁液中で数時間保存することができます。メッキ後は、培養肝細胞が付着して広がるために数時間を必要とします。めっき中でのインキュベーションの2時間後に、肝細胞は小さくて丸いままになります。一晩インキュベートした後、肝細胞は、二核されますそれらの多くは、より特徴的な六角形の外観になります。準備が不健康である場合には、Cellsは、細胞死を示す多数の顆粒と時折小疱形成を示すであろう。最良培養生存度を維持するために、培地は24時間毎に変更する必要があり、外気への暴露を最小限に抑えるように注意。 パル...

非アルコール性脂肪肝疾患は、西洋化された文化における肝疾患の主要な原因の一つです1,2.肝臓内の脂質蓄積は、まだ知られていないメカニズム3-6を介して細胞死、線維化、および肝不全に関連しています。脂肪肝疾患では、肝細胞を介したβ脂肪酸酸化とde novo脂肪生成が正味の脂質蓄積の重要な決定因子です7,8。したがって、この記事では、肝細胞の単離に焦点を当て、続いてβ脂肪酸酸化とde novo脂肪生成の定量化に焦点を当てます。
肝細胞脂質代謝を調査するために、数多くの方法論が開発されてきました。安定同位体9,10を用いてin vivoで脂肪の代謝を測定することは可能ですが、これらの方法は高価で、多数の動物を必要とします。さらに、in vivo実験の性質上、外因性化学物質の影響を調査する能力は限られています。対照的に、マウスの肝臓からの初代肝細胞の単離は、11を追求するための手頃な手段を提供する。さらに、培養中の肝細胞を研究することで、研究者はin vivo実験の困難を回避しながら、さまざまな化学物質が脂質処理に及ぼす影響を研究することができます。最後に、単離された肝細胞は、単一の動物の肝臓に由来するため、さまざまな遺伝学による交絡を回避します。
ここでは、肝細胞を分離して培養し、放射性標識パルミテートを使用してβ脂肪酸の酸化とde novo脂肪生成を測定します。以下に詳述するプロトコルは、簡単で、効果的で、再現性があります。

<table><tbody><tr><td>肝臓灌流ミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>17701038</td><td></td></tr><tr><td>肝臓ダイジェストミディアム</td><td>ライフテクノロジー</td><td>17703034</td><td>アリコートと-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>PBS</td><td>コーニング</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>10X DPBS</td><td>コーニング</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>コーニング</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>26140079&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A1048301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルピロリドンでコーティングされたコロイダルシリカ</td><td>GEライフサイエンス</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>セルグロ</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>セルグロ</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I0516-5ML</td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ</td><td>D2915-100MG</td><td></td></tr><tr><td>アルブミン (BSA)、フラクションV</td><td>MPバイオメディカル</td><td>103703</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル培養皿</td><td>コーニングファルコン</td><td>353047&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>タイゴンS3チューブ&nbsp;</td><td>コールパー</td><td>マー06460-34</td><td></td></tr>男性の<tr><td>Leurロックから200バーブコネクタ</td>コール<td>パー</td><td>マー45518-00</td><td></td></tr><tr><td>24 G x 3/4 "カテーテル</td><td>SurFlo</td><td>SROX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>パーマハンドシルク縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー</td><td>コーニングファルコン</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>IsoTemp 3013HD再循環ウォーターバス</td><td>フィッシャー</td><td>13-874-3</td><td></td></tr><tr><td>MasterFlex C / L蠕動ポンプ</td><td>MasterFlex</td><td>HV-77122-24</td><td></td></tr><tr><td>Microclamp</td><td>Roboz</td><td>RS-7438</td><td>オートクレーブ5インチで予備滅菌</td></tr><tr><td>ストレート、ブラントブラント手術ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-6810</td><td>オートクレーブで事前滅菌</td></tr><tr><td>24mm ブレード ストレートでシャープポイントのマイクロダイセッシングハサミ</td><td>ロボズ</td><td>RS-5912</td><td>オートクレーブでプレ滅菌</td></tr><tr><td>4インチ 0.8mm チップマイクロダイセッシング鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-5130</td><td>オートクレーブで予備滅菌</td></tr><tr><td>4インチ 0.8mm チップフルカーブマイクロディスセッション鉗子</td><td>ロボズ</td><td>RS-5137</td><td>オートクレーブで予備滅菌</td></tr><tr><td>60 ml シリンジ</td><td>ベクトン ディキンソン</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>コーニング ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>BCA タンパク質アッセイ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セロジカルピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,000、200、20 &MU;Lピペットとチップ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

肝臓の脂質代謝は複雑です。肝細胞は、リポタンパク質を介した脂質の輸入と輸出に加えて、脂肪酸酸化によって脂質を酸化したり、de novo脂肪生成によって新しい脂質を合成したりできます。これらの経路の正味の合計は、いくつかの要因によって決定され、特定の病状では脂肪肝疾患につながります。肝臓の脂質の過剰な蓄積は、全身のインスリン抵抗性や冠状動脈性心臓病と関連しています。肝細胞の脂質代謝を研究するツールは、特定の代謝障害における肝脂質代謝の役割を理解するのに役立ちます。
肝臓では、肝細胞はβ脂肪酸の酸化とde novo脂肪生成を通じて脂肪酸の分解と合成を調節します。これらの経路の代謝を定量化することで、肝臓の脂質の取り扱いに関する洞察が得られます。in vitro定量とは異なり、初代肝細胞を用いたin vivo測定は技術的に困難であり、リソースを大量に消費します。したがって、培養マウス肝細胞におけるβ脂肪酸酸化とde novo脂肪生成を定量化することは、肝細胞脂質の取り扱いを評価するための簡単な方法を提供します。
ここでは、初代マウス肝細胞の単離方法について説明し、放射性標識基質を使用して、β脂肪酸酸化とde novo脂肪生成の定量化を実証します。

3×10 7の全細胞-肝細胞の単離は、一般的に1になります。一晩のインキュベーションの後、細胞は、六角形の表示され、その多くは（ 図2）二核れます。健康な細胞は、細胞死の指標である顆粒またはブレブ、を欠いでなければなりません。 一般的には、脂肪酸酸化アッセイは、試験化合物ごとに3〜4回繰り返して実行されます。 CO 2のサンプルのカウントは、酸可溶性物質から誘導されるものの約五分の一です。我々は一般的に（つまり、クエン酸サイクルを経て酸化量である）完全な酸化の指標としての酸可溶性物質へのCO 2の比を計算します。このようなシアン化カルボニル-4-（トリフルオロメトキシ）フェニルヒドラゾン（FCCP）などの細胞呼吸を促進する物質は、TCAサイクルを経由してより多くの酸化を示す、CO 2に向けてこの比率をシフトします。呼吸鎖の阻害剤は、全体的に酸化を減少します（ 図3）。このアッセイを操縦する場合は、手順は、細胞特異的活性を生産し...

デノボ脂質生成およびβ脂肪酸酸化は、肝細胞に脂肪肝疾患を含むいくつかの代謝障害に摂動された経路を主要な代謝経路を構成しています。ここでは、マウス初代肝細胞の単離を実証し、β - 脂肪酸の酸化および脂質生成の定量化について説明します。

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

本手順の目的は、マウス初代肝細胞における脂肪酸代謝を評価することです。まず、消化培地を用いてマウス肝臓を灌流し、肝臓を摘出した後、肝細胞を単離します。次に、コラーゲンコートしたプレート上で肝細胞を培養します。次に、肝細胞をテストしたい試験的な介入操作で処理します。最終ステップは、放射標識された基質存在下で細胞をインキュベートすることです。最終的に、液体シンチレーション分析を用いて、一次肝細胞における脂肪酸酸化または脂質合成に対する、さまざまな薬理学的または遺伝学的介入の効果を明らかにします。この手法は、特定の薬理学的および遺伝学的介入が肝細胞の生物学にどのような影響を与えるかを含め、代謝および糖尿病分野におけるいくつかの重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法を視覚的に実演することは、2つの理由から極めて重要です。1つ目は、肝細胞の健全性に影響を与える特定の灌流条件を得ることが困難であること、2つ目は、放出される二酸化炭素の定量化が必要であることです。ガスの取り扱いは直感的ではありません。この手順のデモンストレーションを行うのは、私の研究室の大学院生であるTom Akeyです。滅菌チューブの一端を予熱した肝灌流培地に、もう一端を廃棄容器に配置し、ペリスタルティックポンプをセットアップします。チューブ全体に培地が満たされるまでポンプを作動させます。対象のマウスを安楽死させた後、マウスの腹部を70% ethanolで十分に噴霧します。次に、鈍端鋏を用いて真皮に沿って腹部の正中線に切開を加え、側方に反転させます。腹膜に同様の切開を加え、内臓を露出させます。鈍的な器具を用いて、腸管をそっとずらします。腹部血管系を露出させるため、腹部下大静脈を確認し、腎静脈より遠位の血管の下に縫合糸を配置します。縫合糸よりもさらに遠位に配置してください。下大静脈に針とカテーテルを挿入し、縫合糸を越えて進めます。針を入れたまま、カテーテルを固定するために縫合糸をカテーテルの周囲で結び、その後、慎重に針を抜きます。正しく行われていれば、ピペットを使用してカテーテルから血液が流れます。カテーターの残りの領域に灌流液を満たし、気泡が入っていないことを確認します。その後、細心の注意を払ってチューブをカテーターに接続します。次に、鋭い先端のハサミで横隔膜を慎重に穿刺し、側切開を行って胸腔を露出させます。胆嚢および胸膜血管を避けるように注意しながら、肝静脈のすぐ近位側で胸部下大静脈をブルドッグクランプで遮断します。次に門脈を切断し、ポンプを3～4 mL/minに設定して作動させます。約20 mLの肝灌流液を用い、5分間肝臓を灌流します。この間に、肝臓の色が赤からグレーがかった褐色に即座に変化するのを観察します。肝臓の一部が赤いままである場合は、灌流不全を示しており、分離が成功する可能性は大幅に低下します。5分間の灌流後、ポンプを停止し、チューブを肝臓消化剤培地へ移します。ポンプを再起動し、さらに10～15分間、肝臓を灌流します。培地がなくなるまで、1分間に3～4 mLの速度で灌流してください。灌流終了後、ポンプを停止します。肝臓は淡いピンク色を呈し、やや腫大しているはずです。この時点で、慎重に解剖して肝臓を摘出します。10 cmの組織培養皿に移し、胆嚢を除去します。次に、肝臓に10 millilitersの播種培地を加え、メスを用いて肝臓を穏やかに掻き出します。肝細胞を回収するため、懸濁液を100 micronのセルストレーナーでろ過し、50 milliliterのコニカルチューブに移します。プレートをさらに10 millilitersの播種培地で洗浄し、その液を50 milliliterのコニカルチューブに回収します。次に、4°Cで350 Gで5分間遠心分離して細胞をペレット化し、培地を吸引除去した後、細胞ペレットを10 mLの播種用培地で再懸濁します。続いて、ポリビニルピロールでコーティングした90%コロイダルシリカを10 mL加え、穏やかに混ぜた後、前述と同様に細胞をペレット化します。遠心分離後、混合物の上層に浮遊している死細胞層を吸引除去します。次に、回収した生細胞ペレットを20 mLの播種用培地で2回洗浄します。最終的な細胞ペレットを10 mLの播種用培地に再懸濁し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測します。コラーゲンコートした24ウェル培養プレートの各ウェルに90,000個の細胞を播種し、アッセイ開始の16〜20時間前に、37 °C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。細胞を温めたPBSで2回洗浄し、20 nanomolesのグルカゴンを含む血清不活化飢餓培地に置換します。アッセイ実施日の前日に、37 °C、5% carbon dioxideの条件下で細胞を一晩インキュベートします。前インキュベーション用培地を調製し、その後、血清飢餓状態に置換します。前インキュベーション用培地を用います。インキュベーション中、細胞をこの混合液中で37 °C、5% CO2の条件下で2時間インキュベートします。窒素気流下でエタノール溶媒を蒸発させ、1ウェルあたり0.5 µCiのC 14 palmitateを乾燥させます。インキュベーション終了の約15分前に、0.1 N 水酸化ナトリウム中でC 14 palmitateを1 µCiあたり12.5 µLの割合で再懸濁します。この混合物を70 °Cで10分間インキュベートします。その後、3倍量の加温したプレインキュベーション培地を加え、ピペッティングにより混合します。プレートを静かに揺らしながら、希釈したC 14パルミチン酸ミックスを各ウェルに25 µLずつ添加し、37 °Cで90分間インキュベートします。これがアッセイプレートとなります。インキュベート中に、滅菌済みの24ウェルプレートからカバーを取り外し、各ウェルの底に2 cm × 2 cmのフィルターペーパーを1枚ずつ配置します。次に、マイクロピペットチップボックスのような大きな長方形の物体を使用して、4インチ × 7インチのパラフィルムでプレートを覆います。パラフォームをウェル部分でこすり、ウェル開口部を穿孔させ、プレートの残りの部分にシールを作成します。次に、穿孔したパラフォームの円形部分を取り除きます。インキュベーション終了の10分前に、フィルターペーパープレートの各ウェルに3 N 水酸化ナトリウムを 200 µL 加え、フィルターペーパーがすべての液体を吸収するようにしてください。インキュベーション終了後、アッセイプレートを液体窒素で急冷します。次に、アッセイプレートの各ウェルに70%過塩素酸を100 µLずつ加えます。直ちにフィルターペーパープレートで覆い、プレートをオービタルシェーカーに設置します。プレートを室温で80 RPMのオービタル速度で2時間振とうします。次に、フィルターペーパーの正方形をシンチレーションバイアルに入れた4 mLの液体シンチレーション液に転送して二酸化炭素画分を測定し、シンチレーションカウンターでC 14信号を測定して酸可溶性物質を定量します。培地400 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、最大速度で10分間遠心分離した後、得られた上清100 µLをクロロホルムとメタノールの2:1混合液500 µLに加えます。混合物を短時間ボルテックスした後、250 µLの水を加えてさらにボルテックスします。再度、サンプルを1,000 Gで10分間遠心分離します。次に、上清相を200 µL取り、シンチレーションバイアルに入れた4 mLの液体シンチレーション液に加え、細胞を血清飢餓状態にした後、C 14信号を測定します。その後、細胞を脂質合成培地に変更します。試験したい化合物を添加し、インキュベーション期間後、細胞を37 °C、5% CO2条件下で2時間インキュベートします。PBSで細胞を2回洗浄し、0.1 N 塩酸を120 µL添加して細胞を溶解させます。各ウェルをスクレイピングしてライセートを回収し、ライセート 100 µLを1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注します。次に、クロロホルムとメタノールの2:1混合液を500 µLずつ各チューブに加えます。短時間ボルテックスした後、室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、250 µLの水を加え、ボルテックスし、さらに室温で5分間サンプルをインキュベートします。次に、サンプルを3000 Gsで10分間遠心分離します。分離した液の下層を慎重にシンチレーションバイアル内の4 mLの液体シンチレーション液に移し、シンチレーションカウンターを用いてトリチウム活性を測定します。この手順により、通常、マウス1匹あたり1,000万から3,000万個の肝細胞が単離されます。一晩インキュベートした後、生存細胞は六角形に見え、その多くには核が認められます。不健康な培養物には、細胞死を示す顆粒やブレブ（水疱）が含まれていることがよくあります。ここでは、完全酸化を測定するために、細胞呼吸促進剤であるF-C-C-P-Aおよび呼吸抑制剤であるオリゴマイシンの添加を、ビークルコントロールと比較した脂肪酸酸化アッセイの結果を示しています。二酸化炭素と酸可溶性物質の比率を算出します。FCCPなどの細胞呼吸を促進する物質は、この比率を二酸化炭素側にシフトさせ、TCAサイクルによる酸化の促進を示します。呼吸鎖阻害剤は、測定時の全体的な酸化を減少させます。lipo活性化合物において、FCCPのように脂肪酸酸化を促進するものや、オリゴマイシンのようにTP合成を減少させるものは、ビークルコントロールと比較して、培養肝細胞におけるlipo活性を低下させます。この手順を行う際は、動物の犠牲後、灌流が完全かつ適時に行われることを確認することが重要です。さらに、脂肪酸酸化アッセイにおいて、二酸化炭素ガスの再現性のある測定を行うには、培地を完全に凍結させることが極めて重要です。このビデオを視聴することで、初代肝細胞の単離方法、およびこれらの細胞を用いてin vitroで脂肪酸酸化と脂質合成を分析する方法について十分に理解できるはずです。

determination-fatty-acid-oxidation-lipogenesis-mouse-primary

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Biology

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マウス初代肝細胞における脂肪酸酸化および脂質生成の決意

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