のレア細胞集団からのTRAP-RC、翻訳リボソームアフィニティー精製ショウジョウバエ胚

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの胚において、細胞型特異的な方法で翻訳に関与するRNAを単離することです。これは、まずトランスジェニックフライ系統から胚を採取し、標的細胞型(この場合は前かがみ筋細胞)におけるA GFPタグ付きリボソームサブユニットの特異的発現を可能にすることによって達成されます。第2のステップは、ライセートを生成して、タグ付きリボソームとタグなしリボソームの混合物を含むポリソーム調製物を得ることです。

次に、ライセート中のタンパク質濃度を推定し、GFP抗体に結合したビーズを用いてアフィニティー精製を行い、目的の細胞タイプからリボソームRNA複合体を捕捉します。最後のステップは、トリオール、RNA、抽出、精製に専念しています。最終的に、品質と特異性の評価は、それぞれバイオアナライザーとR-T-Q-P-C-Rで行われます。

その後、RNAは、RNAシーケンシングまたはマイクロアレイによるグローバルな定量分析に使用できます。VXソーティングのような既存の方法のこの技術の主な利点は、細胞解離のラボステップを必要としないことです。ベンチで行うことができます。

これは高速で、非常に小さな細胞集団で翻訳RNAを直接同定できるため、細胞特性の獲得を理解するための手段として役立ちます。この方法がジョセフィン胚の筋形成に関する洞察を提供する場合でも、植物、シマウマ、魚、マウスなどの他の組織や現代の生物にも適用でき、病理の場合に治療がタンパク質合成に与える影響を追跡するのにも役立つ可能性があります。手順を実証するのは、私の研究室の博士課程の学生であるベンジャミン・ベルタですエンジニアリング後、プロトコルの書かれた部分の指示に従ってトランスジェニックラインと交差してトラップダブルクロストランスジェニックラインを作成し、最初にケージあたり約40グラムの若いハエを含む8つの大きな円筒形の個体群ケージを準備することにより、ラインを増幅します。 これは、ケージあたり約180、000匹のハエに相当します。

固化した寒天とぶどう果汁を混ぜたものを、表面の3分の1を焼きたてのイーストペーストで覆った直径11cmのシャーレを用意し、これらの皿にハエが卵を産むのを1時間待ちます。このプロセスをさらに2セットの新鮮なブドウジュースプレートで繰り返して、ハエがUCTを完全に空にするようにします。十字架からの目的の二重トランスジェニック胚は、4番目のプレートに置かれます。

目的の胚が入ったプレートをケージから取り出し、室温で目的の発生段階までインキュベートします。ここでは13時間のインキュベーションが使用されます。次に、ブラシを使用してプレートの内容物を約50ミリリットルの水で再懸濁します。

液体を直径700、355、112ミクロンの3つのふるいに通すことにより、死んだハエから胚を分離します。イオン化された水で最小直径のふるいで収集した胚をすすぎます。胚をイオン化水で4.5%漂白剤に2分間コーティングし、イオン化水で30〜60秒間十分にすすいでください。

胚をPBS 0.01%Tで20〜100マイクログラム/ミリリットルでインキュベートします。攪拌しながら室温で5〜10分間シクロハイドします。セルロース吸収シート上で胚を乾燥させた後、マイクロ遠心チューブに移し、チューブの秤量とフラッシュを行い、液体窒素に浸して胚を凍結します。

この段階では、乾燥した胚は摂氏マイナス80度で数ヶ月間保存することができます。乾燥胚の1.5グラムを予め冷却した15ミリリットルのチューブに移し、4ミリリットルのポリソーム抽出、緩衝液、均質化を含ませます。滅菌済みの10ミリリットル血清ピペットを使用。

次に、均質化された胚を2つのプレチル、2ミリリットルのチューブに広げ、多方向の高速ビーズグラインダーで胚を粉砕します。各サイクルの間に 15 秒の一時停止を挟んで、5 、 000 RPM で 10 秒間 2 回実行するように設定されています。2000 Gで10分間遠心分離した後、ライセートを氷上の新鮮な予冷マイクロ遠心チューブに移します。

S上清に10%non P 40を最終濃度0.1%まで加え、チューブを反転させて穏やかに混合します。300マイクロモルのDHPCを最終濃度30ミリモルに加え、チューブを反転させて穏やかに混合します。混合物を氷上で5分間インキュベートし、インキュベーション中に数回反転して混合します。

氷でのインキュベーション後。ブラッドフォード法でタンパク質濃度を測定し、60〜80ミリグラム/ミリリットルのタンパク質濃度を得た後、20、000 G.Afterで摂氏4度の遠心分離により、ポストミトコンドリアのすくい酸を調製し、SNATを新鮮な予冷マイクロ遠心分離管に移し、すぐに予備吸収ステップに進みます。磁気ビーズを穏やかに攪拌して再懸濁し、ライセート1ミリリットルにつき30マイクロリットルのビーズをマイクロ遠心チューブに移します。

磁石にビーズを集め、スナットからピペットで取り出し、ビーズと500マイクロリットルのポリソーム抽出バッファーを再懸濁します。次に、磁石にビーズを集めます。再度、胚性ライセートを加え、ローテーター上で摂氏4度で1時間インキュベートします。

ビーズを取り出し、免疫精製ステップまで仰臥位剤を氷の上に置きます。免疫精製後に採取したサンプルと比較するために、100マイクロリットルのスーピネートをグローバルRNAサンプルとして確保し、サンプルを免疫精製するために、GFP抗体に結合した90マイクロリットルのブロックビーズを含むRNAフリーチューブに、事前に吸収したライセート1ミリリットルを添加します。インキュベーション後、サンプルを摂氏4度で2時間または一晩インキュベートし、チューブローテーターで穏やかに混合します。

まず、ミニ遠心分離機で残りのビーズをスピンダウンしてビーズを洗浄します。次に、500マイクロリットルの洗浄液に再懸濁した磁石に集め、緩衝し、インキュベートします。冷蔵室で10分間の混合を終了し、再度、磁石にビーズを収集します。

ビーズを新しいプレシールドR RNAフリーチューブに移し、さらに2回洗浄します。最後に、ビーズを磁石に集めた後、ビーズに1ミリリットルのTRIOLを加えてRNA抽出を進め、メーカーの指示に従って抽出を行います。これに続いて、製造元の指示に従ってRNEZマイクロキットを使用してRNAクリーンアップを行います。

トラップされたRNAの特異性をテストするには、標準的な手順に従って、免疫精製されたインプットRNAの3ナノグラムで逆転写を行います。次に、QPCRで得られたCDNAを遺伝子特異的プライマーセットとともに使用します。このステージ16の胚の共焦点画像は、RPL 10 A-E-G-F-Pの発現を示しており、特に各HEMIセグメントの6つの前かがみ筋細胞において、RPL 10 A-E-G-F-Pと一般的な筋マーカーβ 3チューブリンとの共局在が観察されます。

トラップされたRNAは、品質管理の目的でバイオアナライザーで実行されました。one eight s リボソーム RNA と 2 8 s リボソーム RNA の完全な完全性に注意してください。この図は、ステージ16の胚の3つの生物学的複製に対するRT QPCR解析の結果を示しており、トラップ単離されたmRNAの高い特異性を示しています。

FO変化はインプットと比較して計算され、RPL 32遺伝子メスに対して正規化されました。すべての筋肉系統に存在する2つの転写産物は、インプットと比較して2.3倍濃縮されていますが、より制限された前かがみ転写産物は、プロスペロを発現する5.6倍に濃縮された神経細胞であり、ソックスと遺伝子は、その発生後にそれぞれ2.2倍と5.5倍枯渇します。この技術は、特に発生生物学の分野の研究者が、ドフ胚の分化における自己援助のコミットメントと細胞特性の獲得を探求する道を開きました。