三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させますインビトロ気道壁のモデル

この手順の全体的な目標は、3次元の位相足場をエレクトロスピンし、完全に分化した成体ヒト細胞の共培養を可能にして、これらの細胞がC twoで遭遇する天然の細胞外マトリックスを複製することです。これは、ランダムに整列したマイクロファイバーの足場である最初のエレクトロスピニングによって達成されます。第2のステップは、ランダムに整列したナノファイバー層をマイクロファイバー足場上に直接エレクトロスピニングすることにより、二相性足場を形成することです。

次に、別の配向したナノファイバー足場をエレクトロス紡糸します。最後のステップは、各足場にそれぞれの細胞タイプを播種し、大量のバイオリアクターシステムで足場を単一の構築物として共培養することです。最終的には、メディエーター放出と免疫染色の測定を通じて、多細胞相互作用を解析することができます。

コンストラクト。この手法が2D変換膜のような既存の方法よりも優れている点は、電気足場が3D繊維状環境を提供し、生理学的に適切な形態を提供するように適応できることです。これはより多孔質の構造であり、複数の細胞タイプのコア培養を可能にします。

この方法は、コホート細胞、疾患細胞、または健康なヒト細胞のいずれかをin vitroモデルとして使用して、安定したプラットフォームを提供します。これにより、ヒトの疾患との関連性に限界がある動物モデルへの依存を減らし、実験に使用する動物の数を減らすことができます。この方法は、喘息やCOPDなどの疾患に関する洞察を得ることができますが、腸の炎症性疾患の研究や化学試験用の皮膚モデルの開発など、他のシステムにも適用できます。

まず、8%10%と30%PETをクロロメタンとトリクロロ酢酸の1対1の混合物に溶解することにより、3つの異なるPETの10ミリリットル溶液を準備します。溶液を室温で一晩攪拌し、翌日PETを溶解します。PET溶液をシリンジに移し、23ゲージの針を8%混合物を含むシリンジに取り付け、18ゲージの針を10%および30%PET溶液を含む他の2つのシリンジに取り付けます。

マイクロファイバーの足場を準備します。まず、30%PET溶液が入ったシリンジを、針先が底にあるシリンジポンプにロードします。マンルを針先から15センチメートルの位置に配置し、針がドラムの中央を向いていることを確認します。

金属製のワニクリップを使用して針先に正の電力供給ラインを取り付け、アースラインをバナナソケットに接続してマンルを接地します。モーターのスイッチを入れ、回転数を60RPMsに設定し、シリンジポンプをONにして、毎時2.0ミリリットルの流量を供給します。

マイクロファイバーの足場を作成しながら。針の先端から溶液が押し出されるまでポンプを作動させ、針の空気を除去してシステムをプライミングします。次に、シリンジポンプのポンプを停止します。

吐出する溶液の総量を2ミリリットルに設定し、ポンプを始動します。次に、針とマンドレルの間に14キロボルトの電位を印加し、30%PET溶液の2ミリリットルがマンドレル上にまだマイクロファイバーの足場でエレクトロスピンされるまで1時間エレクトロスピンし、電圧ポテンシャルをオフにします。ワニ口クリップを取り外し、30%PET溶液を含むシリンジを8%PET溶液を含むシリンジと交換します。

次に、ワニ口クリップを23ゲージの針に再接続します。シリンジポンプの流量を毎時0.5ミリリットルに変更し、溶液が先端から流れるまでシリンジポンプを運転して針をプライミングします。マンドレルが60RPMで回転し続けている状態で、針先とマンドレルの間に14キロボルトの電位を印加し、シリンジポンプによって押し出される総体積を2ミリリットルに設定します。

8%PET溶液の2ミリリットルがエレクトロスピンされるまで、4時間エレクトロスピンします。エレクトロスピニングが完了したら、電源とモーターのマンドレルスピンをオフにしてください。マンドレルの幅に沿ってブレードで二相性足場を切断し、マンドレル表面積のサイズの2D足場シートを作成します。

整列したPETスキャフォールドを調製するには、10%PET溶液を含むシリンジを、針先を底にしてシリンジポンプにロードします。次に、ワニ口クリップを針に接続します。流量を毎時0.5ミリリットルに設定し、PET溶液で針をプライミングします。

次に、モーターをオンにし、マンドレルの回転速度を2000RPMに設定します。次に、シリンジポンプのスイッチを入れます。電圧供給を14キロボルトに設定し、2ミリリットルの溶液がエレクトロスピンされるまで、電源エレクトロスピンを4時間オンにします。

エレクトロスピニングが完了したら、電源とモーターの電源を切ります。マンドレルの幅に沿ってブレードで足場を切断し、整列した2Dシートの足場を作成します。エレクトロスピンスキャフォールドをアルミホイルに保管して、静電荷を減らします。

直径0.8mmの生検ペンを使用して、SPUシートから二相性または整列した足場のディスクを打ち抜きます。次に、無毒の水槽用接着剤を使用して、二相性足場ディスクをガスケットに接着します。ガスケットとスキャフォールドを12ウェル組織培養プレートに入れます。

足場の両側で紫外線I放射を使用して、ガスケットと足場を30分間滅菌します。その後、翌日、20%の抗生物質抗真菌剤溶液に摂氏4度で一晩浸します。足場はPP S3回洗浄し、足場は使用するまで摂氏4度のPBSに保管します。

PBSから二相性足場を新しい12ウェルプレートに移し、10%FCSを添加したDMEM培地で摂氏37度で1時間温めます。DMEMを補充した媒体を取り外し、足場のマイクロファイバー相を30マイクロリットルのDMEMに添加した培地に15,000 MRC 5つの線維芽細胞を各足場に播種して、線維芽細胞が足場に浸透するのを助けます。プレートをオービタルシェーカーにセットし、100 RPMで2時間足場を攪拌します。

次に、2ミリリットルのDMEM添加培地を各足場に加え、5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩足場をインキュベートします。翌日、ウェルから培地を取り出し、足場のナノファイバー相が頂端を向くように足場を裏返します。次に、30,000 Caliの3つの上皮細胞を、10%FCSを添加したD-M-E-M-F 12培地に30,000匹の3つの上皮細胞を足場のナノファイバー相に播種します。

足場を摂氏37度と二酸化炭素5%で2時間インキュベートした後、足場をD-M-E-M-F 12とDMEM添加培地の70 30混合物に沈め、さらに12時間静的インキュベーションを続けて気道を培養します。平滑筋細胞は、まず、PBSから整列した足場を新鮮な12ウェルプレートに移し、それらを温め、DMEM補充培地を摂氏37度で1時間加熱します。DMEMを補充した培地を取り出し、30マイクロリットルのDMEMを補充した培地に25,000個の気道平滑筋細胞を各足場に加え、摂氏37度と二酸化炭素5%で2時間インキュベー

取り付けたら、足場をDMEM添加培地に浸します。それらをインキュベーターに戻し、一晩放置してから、バイオリアクターでトライカルチャーをセットアップします。翌日、二相性シードスキャフォールドをバイオリアクターチャンバーに置き、上皮相を上に向けてチャンバーに入れます。

次に、整列した足場を二相性足場の下に配置して、二相性足場のマイクロファイバー相に隣接するようにします。バイオリアクターの2つのチャンバーを一緒にロックします。次に、添付のテキストプロトコルで説明されているように、インキュベーター内で2つの灌流フロー回路を組み立て、1週間後に蠕動ポンプを使用して2つの回路の周囲に約0.1ミリリットル/分で媒体を汲み上げます。

培地を頂端チャンバーと培養物から取り出します。分析前にさらに1週間の空気液体界面上の上皮細胞は、バイオリアクターで2週間後、ここに示すトライカルチャー足場を固定し、構築細胞核の3つの層すべてに分布する細胞核を示すために切片化され、DPIで染色され、足場材料が灰色に見える青色に見える。これは、上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞をそれぞれ播種するために調製されたエレクトロスピンナノファイバーマイクロファイバーと整列した足場の走査型電子顕微鏡画像です。

3つの細胞タイプはすべて、2週間にわたって個々の足場で培養すると生存率の増加を示しました。彼らはまた、2週間の培養期間後も細胞型特異的タンパク質を発現し続けました。この手順を試みる際には、エレクトロファイバーで再現しようとしている天然の細胞外マトリックスを研究することを忘れないでください。

Aは、異なる3Dトポグラフィーにアタッチすると、セルの動作が異なります。例えば、上皮細胞は、ナノファイバー上で培養した場合にのみ機能的なバリアを形成します。このビデオを見れば、ダイナミックな培養環境における細胞間相互作用の研究に使用できる多層共培養システムの構築方法について十分に理解できるはずです。

この手順を実行する際には、使用する予定のポリマーや溶剤システムに合わせて、流量や電圧などのエレクトロスピニングパラメータを調整することが重要であることを忘れないでください。これは、目的の繊維を生成するために重要です。さらに、溶剤を適切に抽出できるように、通気孔のあるフードまたは食器棚を回転させることを選択することを忘れないでください。