三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます

この手順の全体的な目的は、3次元の相分化スキャフォールドを電界紡糸し、完全に分化した成人ヒト細胞を共培養できるようにして、これらの細胞がC twoで遭遇する天然の細胞外マトリックスを再現することである。これは、まずランダムに配向したマイクロファイバースキャフォールドを電界紡糸することで達成される。次のステップでは、マイクロファイバースキャフォールド上にランダムに配向したナノファイバー層を直接電界紡糸し、二相性スキャフォールドを形成する。

次に、別の配向性ナノファイバースキャフォールドを電界紡糸します。最終ステップとして、各スキャフォールドにそれぞれの細胞型を播種し、それらのスキャフォールドを単一の構築物として灌流バイオリアクターシステム内で共培養します。最終的に、メディエーターの放出測定および免疫染色を通じて、多細胞間相互作用を分析できます。

構築物。2D変換膜などの既存の手法と比較して、本技法の主な利点は、電気紡糸足場が生理学的に適切な形態を提供できるよう調整可能な3D繊維環境を提供することである。より多孔質な構造であり、複数の細胞種類の共培養が可能となる。

この手法は、コホート研究による細胞、疾患細胞、または健康なヒト細胞をin vitroモデルとして用いることで、安定したプラットフォームを提供します。これにより、ヒトの疾患への適合性に限界がある動物モデルへの依存を減らし、実験に使用される動物数を削減することが可能になります。本手法は、喘息やCOPDなどの疾患に関する知見を得るために有効であるだけでなく、腸の炎症性疾患の研究や、化学物質試験のための皮膚モデルの開発など、他の系にも適用可能です。

まず、クロロメタンとトリクロロ酢酸を1:1の割合で混合した溶液に、8%、10%、30%のPETをそれぞれ溶解させ、10 mLのPET溶液を3種類調製します。PETを完全に溶解させるため、室温で一晩撹拌し、翌日に確認します。PET溶液をシリンジに移し、8%の混合溶液が入ったシリンジには23ゲージの針を、10%および30%のPET溶液が入った他の2本のシリンジには18ゲージの針を取り付けます。

マイクロファイバー・スキャフォールドを調製します。まず、30% PET溶液を入れたシリンジを、針先を下に向けた状態でシリンジポンプに装着します。マニホールドを針先から15 cmの位置に配置し、針がドラムの中心を向いていることを確認してください。

金属製のクロコダイルクリップを使用して、正極電源線をニードルの先端に取り付け、接地線をバナナソケットに接続してマニアル（manl）を接地させます。モーターのスイッチを入れ、マニアルの速度を60 RPMに設定します。シリンジポンプを起動し、2.0 milliliters/hourの流速で供給します。

マイクロファイバー・スキャフォールドを作製します。針内部の空気を除去してシステムをプライミングするため、溶液が針先から押し出されるまでポンプを作動させます。その後、シリンジポンプのポンプを停止します。

排出する溶液の総量を2 mLに設定し、ポンプを始動させます。次に、針とマンドレルの間に14 kVの電位を1時間印加し、30% PET溶液2 mLが電界紡糸されるまで待ちます。マイクロファイバー足場がマンドレルに付着した状態で、電圧をオフにします。クリップを取り外し、30% PET溶液が入ったシリンジを、8% PET溶液が入ったシリンジに交換します。

その後、クリップを23ゲージの針に再接続します。シリンジポンプの流速を0.5 mL/hrに変更し、溶液が先端から流れるまでシリンジポンプを作動させて、針のプライミングを行います。マンドレルを60 RPMで回転させたまま、針先とマンドレルの間に14 kVの電位を印加し、シリンジポンプで押し出す全量を2 mLに設定します。

8%PET溶液が2 mL電界紡糸されるまで、4時間電界紡糸を行います。電界紡糸が完了したら、電源およびマンドレルを回転させているモーターのスイッチを切ります。二相性スキャフォールドを、マンドレルの幅に沿ってブレードで切り取り、マンドレルの表面積と同サイズの2次元シート状のスキャフォールドを作成します。

配向PETスキャフォールドを調製するために、10% PET溶液が入ったシリンジを、針先を下にしてシリンジポンプに装着します。次に、クロコダイルクリップを針に接続します。流量を0.5 milliliters per hourに設定し、針内をPET溶液で満たしてプライミングします。

次にモーターを起動し、マンドレルの回転速度を2000 RPMに設定します。続いて、シリンジポンプのスイッチを入れます。電圧供給を14 kilovoltsに設定し、電源をオンにして、溶液2 mLが電界紡績されるまで4時間電界紡績を行います。

電界紡糸が完了したら、電源とモーターを切ります。マンドレルの幅に沿ってブレードでスキャフォールドを切り出し、配向した2Dシート状のスキャフォールドを作成します。静電気による帯電を抑えるため、電界紡糸したスキャフォールドはアルミホイルに包んで保管してください。

直径0.8 mmのバイオプシーパンチを用いて、SPUシートから二相性または配向性スキャフォールドのディスクを打ち抜きます。次に、無毒性の水槽用接着剤を使用して、二相性スキャフォールドディスクをガスケットに接着します。ガスケットとスキャフォールドを12ウェル組織培養プレートに入れます。

ガスケットとスキャフォールドを紫外線照射装置を用いて、スキャフォールドの両面から30分ずつ滅菌します。その後、20%抗生物質・抗真菌剤溶液に浸し、4°Cで一晩静置します。翌日、スキャフォールドをPBSで3回洗浄し、使用まで4°CのPBS内で保存します。

二相性スキャフォールドをPBSから新しい12ウェルプレートに移し、10% FCSを添加したDMEM培地中で37℃で1時間温める。添加物入りDMEM培地を除去し、スキャフォールドのマイクロファイバー相を上にして、各スキャフォールドに30 µLの添加物入りDMEM培地に懸濁した15,000個のMRC-5線維芽細胞を播種し、線維芽細胞がスキャフォールド内に浸透するようにする。プレートをオービタルシェーカーにセットし、100 RPMで2時間振とうさせる。

次に、各スキャホールドにDMEM添加培地を2 mL加え、37 °C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートします。翌日、ウェルから培地を除去し、スキャホールドのナノファイバー相が上を向くように反転させます。その後、10% FCSを添加したDMEM/F12培地30 µLに懸濁した30,000個のCali 3上皮細胞を、スキャホールドのナノファイバー相に播種します。

スキャフォールドを37°C、5% carbon dioxideの条件下で2時間インキュベートした後、D-M-E-M-F 12とDMEM補完培地の70:30混合液に浸漬し、気道平滑筋細胞を培養するためにさらに12時間の静置インキュベーションを行います。まず、配向性スキャフォールドをPBSから新しい12ウェルプレートに移し、37°Cで1時間、DMEM補完培地とともに温めます。DMEM補完培地を除去し、30 µLのDMEM補完培地に含まれる25,000個の気道平滑筋細胞を各スキャフォールドに添加し、37°C、5% carbon dioxideの条件下で2時間インキュベートします。

接着後、スキャフォールドをDMEM補充培地に浸します。そのままインキュベーターに戻し、バイオリアクターで三共培養をセットアップするまで一晩静置します。翌日、二相性播種スキャフォールドをバイオリアクターチャンバーに設置し、上皮相がチャンバーの上を向くように配置します。

次に、配向したスキャフォールドを、バイフェージックスキャフォールドのマイクロファイバー相に隣接するように、その下側に配置します。バイオリアクターの2つのチャンバーを固定します。その後、付属のテキストプロトコルに記載されている通りに、インキュベーター内で2つの灌流フロー回路を組み立て、1週間後にペリスタティックポンプを用いて、約0.1 milliliters per minuteの速度で2つの回路に培地をポンプ送液します。

アピカルチャンバーから培地を除去し、培養します。バイオリアクター内で2週間経過した後、さらに1週間、気液界面で上皮細胞を培養し、解析を行います。ここに示す三層共培養スキャフォールドを固定し、切片を作成したところ、構築物の3層すべてに細胞核が分散していることが確認されました。細胞核をDAPIで染色したため青色に染まっており、スキャフォールド材料は灰色に見えます。ここでは、それぞれ上皮細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞を播種するために作製した、電界紡糸によるナノファイバー、マイクロファイバー、および配向性スキャフォールドの走査型電子顕微鏡画像を示します。

3種類すべての細胞において、個別のスキャフォールド上で2週間にわたって培養した際、生存率の向上が認められました。また、いずれの細胞も2週間の培養期間後も、細胞型特異的なタンパク質の発現を維持していました。この手順を行う際は、電紡糸で再現しようとしている天然の細胞外マトリックスについて十分に調査することが重要です。

細胞は、異なる3Dトポグラフィーに接着させることで、異なる挙動を示します。例えば、上皮細胞はナノファイバー上で培養した場合にのみ、機能的なバリアを形成します。このビデオを視聴することで、動的な培養環境における細胞間相互作用の研究に利用可能な、多層共培養システムの構築方法について十分に理解することができます。

本手順を実施する際は、使用するポリマーおよび溶媒系に合わせて、流量や電圧などのエレクトロスピンニング条件を最適化することが重要であることに留意してください。これは、目的の繊維を生成するために不可欠です。また、溶媒を適切に排気できるよう、エレクトロスピンニングは排気フードまたはキャビネット内で行ってください。