ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離
August 18th, 2015
肝臓マクロファージは、Kupffer細胞と名付けられ、循環するナノ粒子の捕捉に関与しています。ここでは、Kupffer細胞単離のための高い細胞純度と高収率の方法について説明します。ここでは、修飾LDHアッセイを使用して、Kupffer細胞のカーボンナノチューブによって誘発される毒性を測定します。
次の実験の全体的な目標は、ナノ粒子の毒性を研究するために、多数の細胞のマウスカップを分離および精製することです。これは、マウスの肝臓にH-B-S-S-E-G-T-A溶液とコラーゲン(肝臓組織を穏やかに消化する溶液)を灌流することによって達成されます。次に、肝細胞を密度、遠心分離、および選択的接着によって精製し、細胞の精製カップの培養物を得る。
次に、細胞のカップの純度とF酸性特性を確認するために、フローサイトメトリー分析が行われます。その結果、官能基化されたカーボンナノチューブの毒性を細胞のカップで測定できることが示されています。このモデルは、ナノ粒子毒性試験に適用できることをサポートする修正されたL-D-H-S-Aに基づいています。
今日お見せしようとしている方法は、最近開発された薬物担体の毒性を評価するなど、ナノ毒物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちますが、これは非常に重要なことです。この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この方法が成功裏に実施されれば、高収率と高純度のke細胞が得られ、その毒性についてさまざまなナノ粒子をスクリーニングするためのモデルとして使用できます。
添付のテキストプロトコルとともに見つかった材料と試薬の表に記載されているすべての試薬を新たに調製した後、E-G-T-A-H-B-S-S溶液とコラゲナーゼ溶液を摂氏40度で30分間温め、70%エタノールを使用してポンプフレキシブルチューブをすすぎます。次に、ウォーターバスに浸した遠心分離管に40ミリリットルのE-G-T-A-H-B-S-S溶液を注ぎ、予熱したE-G-T-A-H-B-S-Sを使用してポンプフレキシブルチューブをすすぎます。CDマウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに従って、腹部の毛を剃り、70%エタノールを使用して腹部表面を消毒します。
つま先をつまんで麻酔を確認します。腹腔内を切開し、腸を腹部の左側に横方向に動かして門脈と下大静脈を露出させます。E-G-T-A-H-B-S-S溶液と23ゲージのバタフライニードルを使用して、毎分1〜3ミリリットルの速度でポンプを始動し、門脈をカニューレにし、門脈のカニューレ部分をクランプし、開いたマウス腹部の表面で正弦鉗子を反転させます。
肝臓は灌流の最初の30秒以内に青白くなり、肝臓に過剰な圧力がかかるのを避けるために下大静脈の下部を急速に切開し、灌流の最初の1分間で流量を毎分7ミリリットルに徐々に増やします。遠心分離管に残っているE-G-T-A-H-B-S-S溶液が5ミリリットル未満の場合。溶液に40〜50ミリリットルのコラーゲンを加え、その後、30秒間かけて毎分10ミリリットルまで流量を徐々に増やします。
ピンセットを使用して、下大静脈に10〜32回間隔で定期的に圧力を加えることにより、肝臓を腫脹させます。これにより、細胞の解離が改善され、コラゲナーゼによる灌流時間が短縮されます。遠心分離チューブ内に残っているコラゲナーゼ溶液が10ミリリットル未満の場合は、さらに40〜50ミリリットルのプレウォームコラゲナーゼ溶液をチューブに追加します。
次に、70〜80ミリリットルを灌流したら、鉗子を使用して表面に軽い圧力をかけます。くぼみマークは、肝細胞が解離していることを示します。肝臓を腹腔から一体で取り出し、細胞分離のために20〜30ミリリットルのカップが入った遠心チューブに入れます。中程度。
肝細胞を最大3時間氷上に置き、最大3つの肝臓をプールして精製し、細胞のカップを精製します。灌流した肝臓1つを、細胞単離用の15ミリリットルのカップ、はさみまたはピンセットで培ったペトリ皿に入れます。光沢のあるカプセルを破裂させ、すべての肝細胞を培地に放出します。
溶液を100μmのセルストレーナーで遠心分離管にろ過します。次に、細胞懸濁液を摂氏4度で50GSで2分間遠心分離します。実質細胞はペレット内にあり、非実質細胞は上清中にあります。
上清を清潔な遠心分離チューブに集め、50 gで2分間遠心分離します。合計4回の転送とスピンを繰り返します。次の遠心分離機。
スーパーナットを1,350GSで15分間。非実質細胞をペレット化するためには、スーパーナトを廃棄し、細胞単離培地用のカップの10ミリリットルに再懸濁し、テキストプロトコルに従って以前に調製した不連続な25 50%等張勾配に非実質細胞溶液を添加し、加速または中断せずに850GSで15分間遠心分離する。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、25 50%SIPインターフェースに近い25%SIPフラクション内で濁っているように見える細胞フラクション用の濃縮カップの約12ミリリットルを吸引します。
細胞単離のためのカップの35〜40ミリリットルを含む遠心チューブに細胞を移し、穏やかに混合し、その後、1、350GSと摂氏4度で遠心分離し、細胞をペレット化し、スーパーを廃棄し、5〜10ミリリットルの温熱培地を使用して、血液サイトメーターで細胞を再懸濁します。細胞を数え、トライアンブルー染色を使用して生存率プレートを測定します。精製した非実質細胞を24ウェルプレートに10の5倍の密度でウェルあたり5番目の細胞でプレートします。
細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。次に、メディウムをそっと取り出します。プレウォームHBSSを使用して細胞を洗浄し、細胞培養培地用の新鮮なプレウォームカップのウェルあたり500マイクロリットルと交換します。
細胞を摂氏37度に少なくとも4時間戻し、ナノ粒子粒子で処理する前に細胞が接着できるようにします。細胞に対するCの純度および食作用活性を特徴付け、テキストプロトコールで概説されているように官能基化されたカーボンナノチューブまたはfctsとインキュベートした後、上清を廃棄し、溶解バッファーのウェルあたり200マイクロリットルを添加します。摂氏37度で30〜60分間インキュベートし、激しいピペッティングを行い、マイクロ遠心チューブに細胞用の溶き伏せカップを回収します。
次に、20, 000 GSで10分間遠心分離し、細胞破片上の細胞によって取り込まれたfcn tsを引き出します。上清をマイクロ遠心チューブに集め、摂氏マイナス20度で保管します。あるいは、50マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、乳酸デヒドロゲナーゼキットから等量の基質混合溶液を添加します。
50マイクロリットルの溶解緩衝液と50マイクロリットルの基質混合溶液を含むブランクウェルのトリプリケートを含めます。次に、プレートを覆い、室温で15分間インキュベートしてから、50マイクロリットルの停止溶液を加えます。最後に、マイクロプレートリーダーで490ナノメートルの吸光度を読み取り、次の式を使用して細胞生存率を計算します。
この図は、精製された非実質細胞の数が、マウスおよびトライアンあたり10倍から6個の細胞の8倍から14倍の範囲であることを示しています。青色染色では、約95%の細胞生存率が示されました。細胞用接着カップは、インキュベーション後30分以内に丸い形状になり、4時間後にはこのように細胞が広がり、クラスターが形成され始めました。
細胞をF four 80抗体で染色して、細胞純度のカップを実証し、フローサイトメトリーにより95%以上で測定しました。また、培養12時間後、ローサイトメトリー解析の結果、85%の細胞が1μmの蛍光ビーズを取り込み、PHA酸性活性を持つことが示されました。しかし、この数値は培養72時間で減少し、ここに示されている細胞の40%のみが食作用していました。
官能基カーボンナノチューブと24時間および72時間インキュベートした細胞用カップは、ナイーブ細胞と比較して同様の形態を示しました。対照的に、10%DMSOでインキュベートした細胞のカップは、10%DMSOで24時間および72時間処理した細胞の改変LDHアッセイカップの分析後に壊死形態を示したが、それに比べて高い毒性を示し、fctsは、細胞を50μg/mLに72時間曝露した場合にのみ、細胞生存率のわずかではあるが有意な低下を誘発した。この方法に従えば、他の細胞ベースのSCおよびすべての種類のナノ粒子を、単離されたke細胞を用いて試験することができる。
これにより、動物の使用を最小限に抑えながら、信頼性の高いデータを収集することができます。この技術が、ナノテク心理学の分野の研究者が、ますます開発が進んでいる多くの有望なナノキャリアの安全性をスクリーニングする道を開くのに役立つことを願っています。
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概要
この研究は、ナノ粒子の毒性を調査するためにマウスのクッパー細胞の単離と精製に焦点を当てています。高い細胞純度と収率を達成するために、肝臓灌流と密度遠心分離を用いた方法が採用されています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 毒物学
背景
- クッパー細胞は、循環するナノ粒子を捕捉する肝臓マクロファージです。
- ナノ粒子の毒性理解は、生物医学応用にとって重要です。
- 高純度の細胞単離技術は、正確な毒性試験に不可欠です。
- 修正LDHアッセイは、細胞毒性を評価するための信頼できる方法です。
研究目的
- マウスの肝臓からクッパー細胞を単離し精製すること。
- これらの細胞におけるカーボンナノチューブの毒性を研究すること。
- ナノ粒子の毒性試験におけるクッパー細胞の使用を検証すること。
使用された方法
- マウスの肝臓をH-B-S-S-E-G-T-A溶液で灌流すること。
- 肝臓組織の優しい消化にコラーゲナーゼ溶液を使用すること。
- 細胞の精製に密度遠心分離を使用すること。
- フローサイトメトリ分析を使用して細胞の純度と機能を確認すること。
主要な結果
- 高純度のクッパー細胞培養が成功裏に得られました。
- クッパー細胞においてカーボンナノチューブの毒性が測定可能でした。
- 修正LDHアッセイが細胞毒性を効果的に評価しました。
- このモデルは、さらなるナノ粒子の毒性試験をサポートします。
結論
- 単離方法はクッパー細胞を研究するための信頼できるアプローチを提供します。
- このモデルで機能化されたカーボンナノチューブの毒性をテストできます。
- この研究結果は肝臓におけるナノ粒子の相互作用を理解するのに貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolating primary Kupffer cells addresses a key limitation in nanotoxicology where immortalized cell lines yield discrepant results, improving predictive confidence in nanoparticle safety assessment. This method supports target validation by providing a physiologically relevant model of liver macrophage function, critical for de-risking nanoparticle-based drug carriers. High-yield, high-purity isolation enables reproducible screening of nanomaterials, aligning with early discovery goals for translational biomarker alignment and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling nanoparticle-Kupffer cell interactions in a disease-relevant system.
- Operational Value: Provides a purified primary cell source (>95% purity) for consistent target engagement and pathway clarification studies.
- Predictive Value: Supports lead identification by measuring functional outcomes like phagocytic activity and viability after nanoparticle exposure.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers a standardized biological system for quantitative LDH-based toxicity readouts, enabling reliable compound evaluation.
- Operational Value: Uses accessible equipment (centrifuge, perfusion pump) to ensure scalability and cross-lab reproducibility.
- Assay Readiness: Generates sufficient cell yield (up to 14×10⁶ cells/mouse) for multi-well plate screening of nanoparticle libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Bridges discovery and preclinical workflows by using primary cells that reflect human liver macrophage biology more closely than immortalized lines.
- Operational Value: Supports risk-adjusted advancement decisions through consistent toxicity measurement (e.g., LDH release) across nanoparticle doses and exposure times.
- Translational Continuity: Enables biomarker-aligned screening where Kupffer cell activation or dysfunction predicts in vivo nanoparticle clearance and safety.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a reproducible assay for nanoparticle toxicity screening before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on nanoparticle uptake and macrophage activation via flow cytometry confirmation of F4/80+ phagocytic cells.
- Screening: Enables assay standardization through density gradient purification and selective adhesion steps that yield homogeneous Kupffer cell populations.
- Analytics: Generates quantitative viability data via modified LDH assay, allowing dose-response modeling and cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling RES-mediated nanoparticle capture, a key determinant of biodistribution and clearance.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable to diverse nanomaterials (e.g., functionalized CNTs, drug carriers) across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by using primary cells that maintain native phagocytic and cytokine signaling functions.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized perfusion, digestion, and purification steps yielding >95% pure Kupffer cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early predictive confidence in nanoparticle biocompatibility, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of nanocarriers based on liver macrophage toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, perfusion techniques, and primary cell handling.
- Dependent on centrifugation equipment, cell strainers, and flow cytometry for validation.
- Necessitates standardization across teams for collagenase digestion times and gradient preparation to ensure consistency.
- Adaptation considerations include adjusting mouse weight (35-45 g) to optimize yield and cannulation success.
- Practical limitations include cell viability decline in culture (phagocytic activity drops from 85% to 40% over 72 hours), requiring timely assay execution.
