Name: ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶマウス肝臓からのクッパー細胞単離法と密度遠心分離による精製技術。ナノ粒子毒性評価のための高純度細胞培養モデルを確立し、フローサイトメトリーで純度を確認する方法です。

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この作業は、EU FP7-ITN Marie-CurieネットワークプログラムRADDELによって支援されました。MBとKAJは、Joe Varguese氏とRui Serra Maia氏に対し、Kupffer細胞単離の最適化に関するご協力とご提案に感謝いたします。

全ての動物実験は、関連するすべてのガイドライン、規制、規制当局に準拠して実施されました。実証されているプロトコルは、英国のホームオフィスの規制の指導と承認の下で実施しました 1.灌流および細胞コレクション（図1） <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig1.jpg" /> 図1：肝灌流マウスを麻酔した後に、消化管は、横方向に門脈（PV）がアクセスできるようにするために、腹部の左側に移動します。 PVはすぐに肝臓内の任意の過剰な圧力を避けるために、破壊されるEGTA / HBSSソリューションと劣るveina静脈（IVC）の遅い流速（1-3 ml /分）を用いてカニューレを挿入します。灌流の最初の分以内、流速は徐々に7ml /分に増加させます。その完全な消化が達成されるまで、コラゲナーゼ溶液を、次いで、10 ml /分で灌流されます。 <ol><li> Prepaたての材料表に記載されているすべての試薬を再度。 </li><li> EGTA（エチレングリコール四酢酸）/ HBSS（ハンクス液）溶液（マウス当たり50ml）と40℃で30分間、コラゲナーゼ溶液（マウス当たり100ミリリットル）を温めます。 </li><li>最初の70％エタノールでポンプフレキシブルチューブを洗浄します。水浴に浸漬遠心分離管にEGTA / HBSS溶液40mlを注ぎ、予め温めておいたEGTA / HBSSソリューションとポンプフレキシブルチューブをすすぎます。 </li><li>確実に呼吸抑制と死の前に無意識を生成するためにバルビツール酸塩を用いて端末麻酔を実行します。女性または男性のCD1マウス（35〜45グラム）には1mg / kg、腹腔内でのフェノバルビトンを注入します。つま先のピンチによって麻酔を確認します。 </li><li>腹部の毛を剃る、70％エタノール溶液を用いて腹部表面を殺菌。 </li><li>腹腔を切断し、腹部の左側に横方向に腸を動かすことにより、門脈および下大静脈を露出させます。 </li><li>スターT EGTA / HBSS溶液で1〜3ミリリットル/分の速度でポンプと23グラム蝶の針を使用して、門脈にカニューレを挿入（翼はカット）。 23 G針でカニューレを挿入し、門脈の部分をクランプした後、開かれたマウスの腹部の表面に止血小鉗子鉗子を反転。肝臓は迅速にEGTA / HBSS溶液灌流の最初の30秒以内に淡い必要があります。 </li><li>急速に肝臓での過剰な圧力の建物を避けるために、 下大静脈の下部を切開し、その後灌流の最初の分を介して、7ミリリットル/分に徐々に流量を増加させます。動物は、大静脈穿刺を静脈する二次出血による死亡します。 </li><li> EGTA / HBSSソリューション未満の5mlを遠心分離管に残っている場合には、コラゲナーゼ溶液（40〜50ミリリットル）でそれを埋めます。 30秒かけて、10ml /分に徐々に流量を増加させます。 </li><li> 5-10秒間隔のために、ピンセットを使用して、 下大静脈に圧力を適用することにより、肝臓うねりを作ります。ティSは（消化中に5〜10倍）を定期的に行うことができます。このステップは、肝細胞の分離を改善し、コラゲナーゼ潅流時間を減少させます。 </li><li>コラゲナーゼ溶液未満の10mlを遠心分離管の中に残っている場合には、遠心分離管に予め温めたコラゲナーゼ溶液を40〜50ミリリットル注ぎます。 </li><li>灌流の10〜15分後、約70〜80ミリリットルのコラゲナーゼ溶液の灌流、鉗子で肝臓の表面に小さな圧力を加えます。圧力の記録は、肝細胞が解離されることを示しています。 </li><li>ワンピースとして腹腔から肝臓を取り出して、クッパー細胞の単離中20〜30 mlを含む遠心管に入れます。肝細胞の生存率への影響を回避するために3時間の最大期間氷上または4℃で肝細胞を保管してください。 </li><li>氷の上に灌流肝臓を維持しながら、必要に応じていくつかの動物で灌流手順を繰り返します。プールを精製するための3つの肝臓への1つ、ステージ3に進みます。 </li></ol>遠心分離のための密度勾配（図2）の調製<img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig2.jpg" /> 図2：密度勾配の調製すべての操作は、無菌状態下で行われます。 SIPは、10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液15.3 mlと混合することによって調製されます。 SIP 5mlの25％のSIP溶液20mlを作るためにPBS 15mlで混合されます。 SIP 10mlの50％のSIP溶液20mlを作るために10mlのPBSと混合します。 50％SIP溶液（20ml）で傾斜している、25％のSIP溶液（20ml）に含む遠心管をゆっくり25mLの血清学的ピペットを使用して追加されます。 <ol><li>無菌状態の下で、次のステップ（部2、3＆5）に進み、氷上で、または4℃で細胞を維持します。 10×PBS 1.7 mlの被覆シリカ粒子溶液の15.3ミリリットルを混合することにより、SIP（等張性被覆シリカ粒子溶液）を準備します。 </lI&gt; <li> 25％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 15mlでSIPの5ミリリットルを混ぜます。 50％のSIP溶液20mlを作るために、PBS 10mlでSIPの10ミリリットルを混ぜます。 </li><li> 50％のSIP溶液20mlで1遠心管を埋めます。 90°に近い角度で遠心チューブを傾けて、50％のSIP層の表面に触れることなく、25ミリリットルの血清学的ピペットを用いてチューブの側壁に徐々に25％SIP溶液（20ml）に加えます。 25％のSIPソリューションを追加する場合は、漸進的にチューブの角度を減少させます。使用するまで氷上で密度勾配を維持します。 </li></ol> 3.クッパー細胞精製（図3） <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52989/52989fig3.jpg" /> 図3：密度勾配遠心分離および細胞接着によってクッパー細胞の精製は、すべての手順は、無菌条件下で行われます。 （A）グリソン鞘が破裂した後に、肝細胞は、1で濾過します00ミクロンストレーナ。懸濁液は、肝細胞（ペレット）を破棄し、非実質細胞画分（上清）を収集するために×50 gで遠心分離します。この工程を3回繰り返します。非実質細胞は、不連続等張勾配の最上部に添加し、15分間、800×gで遠心分離します。 25％のSIPクッションから収集クッパー細胞は、細胞接着の選択によりさらに精製されます。 （B）細胞を、24ウェルプレートに播種し、30分間37℃、5％CO 2でインキュベートします。非接着細胞を500μlのHBSSで一回洗浄します。クッパー細胞を f -CNTsを細胞に添加することができる場合には、メッキ後に接着形態4時間を表示します。スケールバーは25μmで表す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52989/52989fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <ol><li> 1灌流肝臓はクッパー細胞の単離培地15mlでペトリ皿に入れてください。 （グリソン鞘を破裂肝臓の膜）はさみを使用し、クッパー細胞の単離培地にすべての肝細胞を放出します。 100μmのセルストレーナーを遠心管に収集することができるためにかかわらず、ソリューションをフィルタリングします。追加の灌流肝臓に灌流手順を繰り返し、（3匹のマウスから45ミリリットルまで、マウスを一回から15ミリリットル）同じ遠心チューブに細胞をプール。 </li><li> 4℃で2分間、50×gで細胞懸濁液を遠心。実質細胞（肝細胞）は、ペレットになり、（クッパー細胞を含む）の非実質細胞を上清になります。 </li><li> 2分ごとに、50×gで清潔な遠心チューブと遠心分離機で上清を収集します。このステップをさらに3回繰り返します。 </li><li>非実質細胞をペレット化するために15分間、1,350×gで遠心分離します。上清を捨て、クッパー細胞の単離培地10mlにペレットを再懸濁します。 </li><li> 2.3で説明したように不連続等張勾配に関して25/50％を非実質細胞溶液を追加します。セント加速度や休憩なしで15分間、850×gでrifuge。 </li><li> 50分の25％のSIPインターフェースに近い25％のSIP画分（ 図3）内に濁っ現れる富むクッパー細胞画分をローカライズ。約12ミリリットル濃縮されたクッパー細胞画分の、10ミリリットルの血清学的ピペットを用いて吸引します。クッパー細胞の単離中35〜40 mlを含む遠心チューブに細胞を移します。細胞をペレット化し、4℃で15分間、1,350×gで静かにして遠心混ぜます。 </li><li>予め温めておいたクッパー細胞培養培地5〜10mlの中で上清と再懸濁細胞を捨てます。細胞（血球計）をカウントし、トリパンブルー染色を用いて生存率を測定します。 </li><li> /ウェルで5×10 5細胞の密度で24ウェルプレート中の精製非実質細胞をプレート。 37℃、5％CO 2（ 図3）で細胞をインキュベートします。 30分後、静かに置き換える一旦予め温めたハンクス平衡塩溶液（HBSS）で洗浄し、培地を除去新鮮で予め温めておいたクッパー細胞培養培地500μlでそれ（ウェル）。 </li><li>彼らの付着形態を獲得できるようにするために、ナノ粒子を用いた治療の前に37℃で少なくとも4時間、5％CO 2のためのクッパー細胞のままにしておきます。 </li></ol> 4.特性<ol><li>クッパー細胞の純度<ol><li>クッパー細胞生存率を維持するために使用される新鮮なPBS / BSA溶液を調製します。 PBS / BSA溶液500μlで細胞を1回洗浄します。 PBS / BSA溶液を除去し、穏やかなスクレイピングを使用して、新鮮なPBS / BSA溶液500μlのクッパー細胞を切り離します。細胞を24ウェルプレートにプレーティングされている場合、続行するには着脱を容易にするためにハサミでスクレーパーブレードの先端を短縮。チューブ、フローサイトメトリーに細胞を移します。 </li><li>血球計および遠心1,350×gで1×10 5個の細胞を用いて、クッパー細胞をカウントします。 F4 / 80抗体（ニート）の30μlに再懸濁クッパー細胞。よく混ぜ、3室温でインキュベート0分。氷上で染色されていない細胞（抗体とインキュベートしていない）を保持します。 </li><li> 5分間1350グラムで、染色された細胞内で遠心分離機をPBS / BSA溶液2mlを添加し、得られた上清を捨てます。 PBS / BSA200μlの染色細胞を再懸濁します。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-1チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li><li>未染色のクッパー細胞のフローサイトメトリー分析に使用したのと同じ設定を維持染色クッパー細胞のための手順を繰り返します。選択し、クッパー細胞の純度を評価するために染色された細胞の蛍光を定量化します。 </li></ol></li><li>クッパー細胞貪食能<ol><li>クッパー細胞培養培地（v / v）の蛍光ビーズを0.5％と、メディアを交換し、37℃で4時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 1,350×gで、二に、非内在化ビーズを、遠心クッパー細胞を除去するために500μlのPBS / BSA溶液中の上清および再懸濁細胞をSCARD。このステップをさらに2回繰り返します。 </li><li>フローサイトメトリーチューブにPBS / BSAソリューションおよび転送細胞の500μlの中でかき取りクッパー細胞。 </li><li> 1,350×gで遠心分離しクッパー細胞は、PBS / BSA溶液の200μlの上清と再懸濁した細胞を捨てます。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、ゲート万未染色のクッパー細胞、そのサイズ（前方散乱）および粒度（側方散乱）に従って。 FL-2チャンネルでゲートされた細胞の蛍光を分析します。 </li></ol></li></ol> （-CNTs f）は 、化学的に機能カーボンナノチューブの5インキュベーション<ol><li>使用前に15分間の超音波処理により水中のF -CNTs（1mg / ml）の分散液を調製します。F -CNTsは、社内で22用意されています。 </li><li> 2倍濃縮したF-CNTを準備 クッパー細胞培養培地中での分散。 超音波処理をするための媒体中に分散されたCNTをF-ステップ5.3に進む前に2分）。 </li><li>各ウェルについて、2×F -CNTs分散液250μlの古いメディアの250μlのを交換してください。未処理のウェル（新鮮なクッパー細胞培養培地の馴化培地+ 250μlと250μl）を、10％のDMSOで処理したウェルを、それぞれ陰性および陽性対照として使用されています。 </li><li> 24または72時間、CO 2、37℃で、5％クッパー細胞をインキュベートします。 </li></ol>変更された乳酸脱水素酵素（LDH）アッセイによるクッパー細胞中のF -CNTsの6毒性評価<ol><li>上清を捨てます。 </li><li>溶解バッファーの（24ウェルプレートのウェルあたり）200μlを添加して、30分〜1時間、37℃でインキュベートします。 </li><li>激しいピペッティングを行った後、細胞と細胞の破片によって取り込まれた-CNTs fをペレット化し、10分間40,000×gでマイクロ遠心チューブと遠心分離機に溶解したクッパー細胞を収集します。 </li><li>に上清（ƒ-CNT無料）を収集マイクロ遠心チューブ、-20℃で保存または）は、6.5に進みます。 </li><li> 96ウェルプレートに50μLを移し、各ウェルに基質混合溶液（LDHキット）の同体積を追加します。プレートをカバーし、停止溶液（LDHキット）を50μlを添加する前に室温で15分間インキュベートします。溶解緩衝液50μlを、基質混合液50μlの停止溶液50μlを含むブランクウェルの三重を加えます。 </li><li>マイクロプレートリーダーで490 nmの吸光度を読んで、（％）細胞生存率を計算するために、次の式を使用しています。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52989/52989eq1.JPG" />

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

次の手順では、高収率とクッパー細胞の高い生存率を達成することが重要です。無菌状態は、細菌および真菌の汚染の危険性を制限するために使用されるべきです。すべての器具は、使用前に滅菌する必要があります。試薬は、新たに単離手順を実行する前に準備する必要があります。 コラゲナーゼIVの選択は、低いトリプシン活性を有する、非常に重要です。同一の供給者からの異なるロットは、異なる酵素活性を有し、それらは、クッパー細胞の単離のために最も適切なバッチを選択するために、最初に比較する必要があるかもしれません。これは、細胞収量および細胞生存率を評価することによって判断することができます。また、同様の用途のために使用されているバッチを提供するために、サプライヤーに連絡することをお勧めします。一度使用するバッチを決定し、将来の使用のために予約。 カニューレ挿入手順は、トレーニングを必要とします。門脈と自信を持ってになるために、いくつかの動物の使用を計画カニューレ挿入手順。実践では、成功した挿管を容易に達成され、手続きは、一人で扱うことができます。重い動...

nanotoxicology研究の分野は、ナノ粒子の生物学的効果を特徴づけることを目的とします。 in vivoでの調査に基づいて、毒性試験は、最も正確な方法のまま。しかし、その使用は、コスト、労力と時間の要件1によって制限されます。その試験した条件の数を拡張する-代替案としては、in vitroアッセイであるため、そのシンプルさとインビトロ試験プラットフォーム2 に高スループットの開発の可能性を使用されています。ほとんどnanotoxicological研究は、不死化細胞株を用いたin vitro アッセイを用いて実施されます。しかし、in vivoでの毒性効果3に、これらの実験結果の外挿に関する懸念があります。実際には、不死化細胞株の特性は、それらが由来した組織、 例えば、遺伝的形質転換4、鍵の形態学的特徴の劣化が著しく異なる可能性が5、携帯極性6などの炎症性メディエーター7の調節などの機能変化の損失。 クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、肝臓の類洞の壁の内側を覆うことにより、血液と直接接触しています。細網内皮系（RES）の一環として、これらのマクロファージは、ナノ粒子を循環、したがってのキャプチャを担当している、ナノ粒子の毒性を研究するために非常に適したモデルを構成している。 インビボ 8 in vitroでのナノ粒子に曝露されクッパー細胞に関連する炎症反応の9研究が他の場所で公開されています。クッパー細胞はまた、アルコール性肝疾患10、肝線維症11またはウイルス性肝炎12のような肝疾患の病因に関与しています。これは、INV、単離されたクッパー細胞は、細胞メカニズムを説明するための有用な洞察を提供することが報告されました肝臓破壊13,14にolved。 いくつかの方法は、クッパー細胞を単離し、精製することが報告されています。細胞の単離は、機械的または酵素的解離15から生じ得ます。コラゲナーゼ消化は高クッパー細胞収率16につながるながら、クッパー細胞の機能的完全性を保存することの利点を示しています。複雑さとコストが異なる多くの実験的なアプローチは、他の肝細胞集団からのクッパー細胞を分離するために使用されています。例えば、クッパー細胞の純度は、イムノ17、フロー電気泳動18、選択的接着16によって、またはそれらのサイズおよび密度に応じてセルを選択し、遠心技術16、によって達成することができます。これらの方法の組み合わせは、人口16の純度を高めるように選択することができます。それは、ほとんどのアプリケーションと利用可能なequipmenに依存するようにクッパー細胞の単離のための理想的な方法についての合意はありませんが、T。しかし、ナノ粒子の毒性試験の場合には、単純さとクッパー細胞の機能維持に関連付けられた技術の高い収率は、このアプリケーションのために最も適していると思われました。 ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。この方法は、Smedsrød らが開発した独自プロトコルから変更されました。16は、ラット肝細胞の単離のために設計されています。ほとんどの研究が報告され、ラットの肝臓のクッパー細胞の単離を記載しています。ここで、我々は、高い収率及び純度で、マウス肝臓のクッパー細胞を単離する方法を記載します。マウスの使用は、実験のコストを削減し、いくつかの肝臓の処理は、ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞を大量に得ることができます。 以下のプロトコルは、クッパー細胞を官能基化カーボンナノチューブ（Fと共にインキュベートしました</em&gt;の-CNTs）。 CNTの固有の物理化学的特性-直径比と大きな表面積、即ち高い長さ、治療および診断目的のためのベクターとしてのCNTの興味深い候補を行いました。しかし、懸念は、カーボンナノチューブ19の毒性に関して提起されており、in vitro試験で 、新しいの開発は、CNTの生物学的効果の理解を高めることを目指しています。クッパー細胞における毒性は、細胞膜の構造的完全性の欠如に関連しています。これは、上清中に細胞から細胞質酵素LDHの損失によって測定されます。この方法の原理は、従って、任意の放出されたLDHを除去し、セル20に残っているものを測定することです。上清中のカーボンナノチューブの存在は、アッセイ21に干渉するので、これは上清中に放出されたLDHの測定に優先して行われます。 我々は、このシンプルでコスト効率のクッパー細胞の単離メトの使用を提案していますdは、機能クッパー細胞の数が多いを単離します。これは、関連する主要なマクロファージモデルでは、ナノ粒子の範囲の毒性のスクリーニングを可能にします。

<table><tbody><tr><td>Euthatal(ペントバルビタールナトリウム)</td><td>Merial</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1マウス</td><td>Charles River&nbsp;&nbsp;</td><td>-</td><td>マウスの体重は35〜45gの範囲で変化する必要があります。体重が急速に増加する(例:7週齢の雄CD1マウスの体重が35gを超える)ため、雄のCD1マウスの使用をお勧めします。また、高齢の動物の配送を手配するために、事前に動物の供給業者に連絡することをお勧めします。あるいは、動物を家に閉じ込めて、希望の体重にすることもできます。&nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS(Ca2+ およびMg2+ フリー、重炭酸塩を含む)&nbsp;&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>14175-053</td><td>HBSSは&nbsp;Ca2+無料。&nbsp;</td></tr><tr><td>エチレングリコール四酢酸(EGTA)四ナトリウム塩&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;&nbsp;</td><td>E8145&nbsp;&nbsp;</td><td>EDTAも使用できますが、EGTAにはCa2+ 選択的にキレート化する利点があります。</td></tr><tr><td>HEPES(1メートル)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>15630-056&nbsp;</td><td>100ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼIV型&nbsp;</td><td>ワージントン&nbsp;</td><td>CSL-4&nbsp;</td><td>コラゲナーゼの異なるバッチをテストするか、少なくとも製品が肝細胞の分離に適している必要があることをサプライヤーに言及することをお勧めします&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;低グルコースDMEM&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;&nbsp;</td><td>D5523&nbsp;</td><td>500ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI(ピルビン酸ナトリウムとグルタマックスを含む)&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>〒12633-012&nbsp;</td><td>500ミリリットル</td></tr><tr><td>ペニシリン/ステプトマイシン&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>15140-122</td><td>100 ml</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清&nbsp;</td><td>ファーストリンク&nbsp;&nbsp;</td><td>60-00-850&nbsp;</td><td>500ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>T8154&nbsp;</td><td>100ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>シリカ被覆粒子溶液(パーコール)</td><td>GEホールトケア&nbsp;&nbsp;</td><td>〒17-0891-02&nbsp;</td><td>percoll&reg;は非常に安定しており、数年間保管することができます&nbsp;</td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>10010-023</td><td>500ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>10x リン酸緩衝生理食塩水&nbsp;&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>70011-036</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド&nbsp;</td><td>フィッシャー&nbsp;</td><td>D/4120/PB08&nbsp;</td><td>500ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>LDHキット(CytoTox 96)&nbsp;</td><td>プロメガ&nbsp;</td><td>G1781&nbsp;</td><td>光から保護してください&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEMフェノールレッドフリー</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;&nbsp;</td><td>31053-028&nbsp;</td><td>500ミリリットル&nbsp;</td></tr><tr><td>F4/80抗体 (Alexa 488)</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA497A488</td><td>希釈しないでください、フローサイトメトリーにきちんと使用</td></tr><tr><td>蛍光ビーズ</td><td>Sigma</td><td>L2778</td><td>ラテックスビーズ、アミン変性ポリスチレン、蛍光赤 1 ml</td></tr><tr><td>材料会社名</td><td>&nbsp;</td><td>カタログ番号&nbsp;</td><td>コメント/説明&nbsp;</td></tr><tr><td>蝶採血セット(23 G / 305 mm長チューブ)&nbsp;&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>367288</tr><tr><td>シリンジフィルター (0.22 &mu;m ブルーリム)&nbsp;</td><td>ミニサート&nbsp;</td><td>16534-K&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離チューブ(50mlブルーキャップ)&nbsp;</td><td>BDバイオサイエンス、ファルコン&nbsp;</td><td>35 2070年&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ(90×15mm)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;&nbsp;</td><td>BSN 101VR20&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>100 &mu;mセルストレーナー&nbsp;&nbsp;</td><td>BD&nbsp;&nbsp;</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ&nbsp;</td><td>ワトソン・マーロウ&nbsp;</td><td>SciQ 300&nbsp;&nbsp;</td><td>各使用の前後に、滅菌PBSと70%エタノールでチューブをすすぎます。</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング&nbsp;&nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルプレート&nbsp;</td><td>コーニング&nbsp;&nbsp;</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td>FLUOstar Omega</td><td></td></tr><tr><td>Serrefine 鉗子</td><td>Hammacher GmbH&nbsp;</td><td>Art.Nr.HSE 004-35 / Cat.Nr.221-0051</td><td>セレフィーン鉗子は、灌流処置中に鉗子を保持することなく、23G針でカニューレされた血管をクランプすることを可能にします。URL: (http://www.hammacher.de/Laboratory-Products/Clamps-forceps/Serrefines/HSE-004-35-Serrefine::25126.html)&nbsp;</td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ</td><td>BD Biosciences, Falcon&nbsp;</td><td></td><td></td>352052</tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.5 ml)</td><td>Elkay</td><td>&nbsp; 000-MICR-150</td><td></td></tr><tr><td>Cell scraper</td><td>BD Biosciences, Falcon</td><td>353086</td><td>24ウェルプレートの細胞を掻き取るために、ハサミで刃の四肢を切断します。</td></tr><tr><td>試薬会社の名称</td><td>&nbsp;</td><td>カタログ番号&nbsp;</td><td>コメント/説明&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;EGTA®(エチレングリコール四酢酸)/HBSS(ハンクス平衡塩溶液)液&nbsp;</td><td></td><td></td><td>0.5 mM EGTAおよび25 mM HEPESを含むHBSS。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに50mlを準備します。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ溶液&nbsp;</td><td></td><td></td><td>100 UI/ml、15 mM HEPES、および 1% ペニクリン/ストレプタマイシン (v/v) のコラゲナーゼ IV 型を含む DMEM 低グルコース。pHを7.4に調整します。灌流する肝臓ごとに100mlを準備します。コラゲナーゼを追加した後、使用前に溶液を30分間温めることをお勧めします。これにより、コラゲナーゼ活性を最適にすることができます。</td></tr><tr><td>Kupffer細胞単離培地&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI含有、1%非必須アミノ酸(v / v)、1%グルタマックス&reg;(v / v)および1%ペニクリン/ストレプトマイシン(v / v)。肝臓1〜3個分に少なくとも100mlを準備します。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Kupffer細胞培養培地&nbsp;</td><td></td><td></td><td>10%のウシ胎児血清、1%の非必須アミノ酸(v / v)、1%グルタマックスを含むRPMI&reg;(v / v)および1%ペニクリン/ストレプタマイシン(v / v)。肝臓1〜3個分に少なくとも100mlを準備します。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>SIP(等張コーティングされたシリカ粒子の溶液)</td><td></td><td></td><td>1.7 mlの10x Phosphate Buffered Saline&nbsp;と15.3 mlのPercoll&reg;を混合して、17mLのSIPを取得します。</td></tr><tr><td>25%SIPソリューション&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 mlのSIPと15 mlの1xリン酸緩衝生理食塩水を混合します&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>50%SIPソリューション&nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mLのSIPと10 mLの1x Phosphate Buffered Salineを混合します&nbsp;</td></tr><tr><td>0.9% Triton X-100</td>PBS/BSA溶液<td></td>を含む溶解緩衝DMEM<td></td><td></td>培地</tr><tr><td>新鮮なリン酸緩衝生理食塩水pH 7.4を1%ウシ血清アルブミンと共に調製します。&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

Kupffer Cell Isolation for Nanoparticle Toxicity Testing

インビトロ nanotoxicological研究の大多数は、その実用性のための不死化細胞株を使用しています。しかし、不死化細胞株または初代細胞中でのナノ粒子の毒性試験からの結果は、in vitroアッセイのための一次細胞の使用を拡張する必要性を強調し、不一致を示しています。このプロトコルは、マウス肝臓マクロファージの単離、というクッパー細胞、およびナノ粒子の毒性を研究するためのそれらの使用が記載されています。クッパー細胞は、体内で最も豊富なマクロファージ集団であり、循環するナノ粒子の取り込みを担う細網内皮系（RES）の一部を構成します。ここで報告されたクッパー細胞の単離方法は、密度勾配上で精製し、2段階灌流法に基づいています。コラゲナーゼ消化および密度遠心分離に基づく方法は、Smedsrød らによって開発されたオリジナルのプロトコルから適合されています。ラット肝細胞のために設計さisolationおよび高い収率を提供し、クッパー細胞の高純度（&gt; 95％）（14×10 6マウス当たりの細胞まで）。この分離方法は、洗練された、または高価な装置を必要とし、したがって、複雑さと細胞収量の間の理想的な妥協点を表していません。重いマウス（35〜45グラム）の使用は、単離方法の収率を向上させるだけでなく、非常に門脈カニュレーションの手順を容易にします。 -CNTs F官能基化カーボンナノチューブの毒性は、変性されたLDHアッセイにより、このモデルで測定しました。この方法は、F -CNTsとのインキュベーション後のクッパー細胞膜の構造的完全性の欠如を測定することによって、細胞の生存率を評価します。 F -CNTsにより誘発される毒性は、単離されたクッパー細胞は、ナノ粒子の毒性試験のために有用であることを強調し、このアッセイを使用して、一貫して測定することができます。 nanotoxicologyの全体的な理解は、臨床の翻訳よりEFFIためのナノ粒子の選択を行うこと、そのようなモデルから利益を得ることができますcient。

非精製実質細胞の数が一致したと（17単離を行った）は、マウスあたり10 6 8〜14×細胞の範囲でした。各マウスの単離は、16から28をプレートウェルに十分でした。トリパンブルー染色によって細胞生存率は、細胞生存率〜95％を示しました。クッパー細胞は、その不完全な接着形態（ 図4A）に関連し、37℃でのインキュベーションの30分以内に丸い形状を示しました。 4時間インキュベーションし、その後に、細胞を広げ、細胞クラスターを形成するために開始しました。 クッパー細胞は、その後、それらの純度および食作用活性を確認するために特徴付けました。細胞は、クッパー細胞の純度を証明するために、F4 / 80抗体で染色しました。フローサイトメトリー分析は、95％（ 図4B）の上にクッパー細胞の純度を示しました。細胞は、大きな粒子を取り込む能力を確認するために、1ミクロン蛍光ビーズ、メッキ後12時間、インキュベートしました。股関節を示したフローサイトメトリー分析Tクッパー細胞の85％以上が1ミクロンビーズ（ <s...

肝臓マクロファージは、Kupffer細胞と名付けられ、循環するナノ粒子の捕捉に関与しています。ここでは、Kupffer細胞単離のための高い細胞純度と高収率の方法について説明します。ここでは、修飾LDHアッセイを使用して、Kupffer細胞のカーボンナノチューブによって誘発される毒性を測定します。

The large majority of in vitro nanotoxicological studies have used immortalized cell lines for their practicality. However, results from nanoparticle ...

本実験の全体的な目的は、ナノ粒子の毒性を研究するために、マウスのクッパー細胞を大量に単離・精製することです。これは、HBSS溶液とコラーゲン溶液を用いてマウスの肝臓を灌流し、肝組織を緩やかに消化させることで達成されます。次に、密度勾配遠心分離および選択的接着によって肝細胞を精製し、精製されたクッパー細胞の培養物を得ます。次に、細胞用カップの純度および酸性特性を確認するために、フローサイトメトリー分析を行います。その結果、機能化カーボンナノチューブの毒性を細胞用カップで測定できることが示されました。修飾されたL-D-H-S-Aに基づき、このモデルがナノ粒子毒性試験に適用可能であることが支持されます。本日ご紹介する手法は、最近開発された薬剤キャリアの毒性評価など、ナノ毒性学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。使用される不死化細胞株の多くは、由来組織とは著しく異なる特性を示すため、この点は非常に重要です。本手法を視覚的に実演することは極めて重要です。この手法を適切に実施できれば、高収量かつ高純度なke細胞を得ることができ、それらをモデルとして、さまざまなナノ粒子の毒性スクリーニングに活用することが可能になります。付属のテキストプロトコルの材料・試薬表に記載されているすべての試薬を freshly preparing したあと、E-G-T-A-H-B-S-S溶液とコラゲナーゼ溶液を40 °Cで30分間温め、70% ethanolでポンプのフレキシブルチューブを洗浄します。次に、40 mLのE-G-T-A-H-B-S-S溶液をウォーターバスに浸した遠心チューブに注ぎ、あらかじめ温めておいたE-G-T-A-H-B-S-Sでポンプのフレキシブルチューブを洗浄します。CD-1マウスを安楽死させた後、テキストプロトコルに従って腹部の毛を剃り、70% ethanolで腹部表面を消毒します。足指をつねって麻酔状態を確認します。腹腔を切開し、腸管を腹部の左側へ寄せ、門脈と下大静脈を露出させます。E-G-T-A-H-B-S-S溶液を用いて、ポンプを1〜3 mL/minの速度で開始します。23Gのバタフライ針で門脈にカニュレーションを行い、カニュレーションした門脈部位をクランプし、マウスの開腹した腹部表面でサイン鉗子を反転させます。灌流開始から30秒以内に肝臓が蒼白になるはずです。肝臓内に過度な圧力がかからないよう、下大静脈の下部を速やかに切開し、灌流開始後1分間かけて流速を徐々に7 mL/minまで上げます。遠心チューブ内のEGTA-HBSS溶液が5 mL未満になった時点で、コラーゲンA溶液を40〜50 mL添加し、その後30秒かけて流速を徐々に10 mL/minまで上げます。ピンセットを使用して下大静脈を10〜32秒間隔で周期的に圧迫し、肝臓を膨張させます。これにより、細胞の解離が改善され、コラゲナーゼによる灌流時間を短縮できます。遠心チューブ内のコラゲナーゼ溶液が10 mL未満になったら、さらに40〜50 mLの予熱したコラゲナーゼ溶液をチューブに加えます。70～80 mLの灌流後、ピンセットを用いて表面に軽く圧力をかけます。凹みができれば、肝細胞が解離したことを示しています。腹腔内から肝臓を1塊として取り出し、細胞分離用培地を20～30 mL含む遠心チューブに入れます。肝細胞を最大3時間まで氷上に保持し、細胞の精製効率を高めるために最大3つの肝臓をまとめて精製に使用します。灌流した肝臓1つを、15 mLの細胞分離用培地を入れたペトリ皿に配置し、鋏またはピンセットを用いて操作します。グリソン鞘を破裂させ、すべての肝細胞を培地中に放出させます。溶液を100 µmのセルストレーナーでろ過し、遠心チューブに回収します。次に、細胞懸濁液を4°Cで50 g、2分間遠心分離します。実質細胞はペレットに、非実質細胞は上清に回収されます。上清を清潔な遠心チューブに回収し、50 gで2分間遠心分離します。この回収と遠心分離の手順を計4回繰り返します。次に遠心分離を行います。1,350 gで15分間遠心分離し、上清を回収します。非実質細胞をペレット化させるため、上清を捨て、ペレットを10 mLのKupffer細胞分離用培地に再懸濁します。この非実質細胞溶液を、前述のプロトコルに従って調製した不連続25%・50%等張勾配に加え、加速および減速をかけずに850 gで15分間遠心分離します。10 mLのセラロジカルピペットを用い、25% SIP分画内の25%・50% SIP界面付近に濁って現れる濃縮Kupffer細胞分画を約12 mL吸引します。細胞を、細胞分離用培地を35～40 mL含む遠心チューブに移して穏やかに混ぜ、1,350 ×g、4 °Cで遠心して細胞をペレット化します。上清を捨て、5～10 mLの予熱した培地を用いて細胞を再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントし、トリパンブルー染色で生存率を測定します。精製した非実質細胞を、1ウェルあたり5 × 10⁵ cellsの密度で24ウェルプレートに播種します。細胞を37°C、5%二酸化炭素条件下で30分間インキュベートします。その後、培地をゆっくりと除去します。あらかじめ温めておいたHBSSを用いて細胞を洗浄し、1ウェルあたり500 µLの新鮮で温めた細胞培養用培地と置換します。ナノ粒子で処理する前に、細胞を37°Cに戻し、少なくとも4時間置いて細胞を接着させます。本文のプロトコルに従って、C4/cellsの純度と食細胞活性を評価し、機能化カーボンナノチューブ（fCNTs）と共にインキュベートした後、上清を捨て、1ウェルあたり200 µLの溶解バッファーを加えます。37°Cで30〜60分間インキュベートし、激しくピペッティングした後、溶解したC4/cellsをマイクロ遠心チューブに回収します。次に、20,000 gで10分間遠心分離し、細胞に取り込まれたfcn tsを含む細胞デブリを沈殿させます。上清をマイクロ遠心チューブに回収し、-20 °Cで保存します。あるいは、50 µLを96ウェルプレートに移し、乳酸脱水素酵素キットの基質ミックス溶液を等量加えます。50 µLの溶解バッファーと50 µLの基質ミックス溶液を含むブランクウェルを3連で含めます。その後、プレートを密閉し、室温で15分間インキュベートしてから、50 µLの停止液を加えます。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて490 nmで吸光度を測定し、以下の式を用いて細胞生存率（%）を算出します。この図は、精製された非実質細胞数が、マウス1匹あたり8×10⁶から14×10⁶個の範囲にあることを示しています。青色の染色は、約95%の細胞生存率を示しました。接着した細胞は、インキュベーションから30分以内に円形となり、4時間後には、ここで見られるように細胞が伸展し、クラスターが形成され始めました。細胞の純度を実証するためにF4/80抗体で染色を行い、フローサイトメトリーで測定した結果、純度は95%以上であった。さらに、培養12時間後のフローサイトメトリー分析では、1 µmの蛍光ビーズを取り込む能力により、細胞の85%が食作用能を有していることが示された。しかし、培養72時間後にはこの数値は低下し、食作用能を持つ細胞は40%のみであることがここで示されている。機能化カーボンナノチューブと共に24時間および72時間インキュベートした細胞は、未処理の細胞と比較して同様の形態を示しました。対照的に、陽性対照として使用した10% DMSOでインキュベートした細胞は、修飾LDHアッセイの解析の結果、壊死した形態を示しました。10% DMSOで24時間および72時間処理した細胞は、比較して高い毒性を示しました。一方、fctsは、細胞を50 µg/mLで72時間曝露させた場合にのみ、わずかではあるが有意な細胞生存率の低下を誘発しました。この方法に従い、他の細胞ベースのSCおよびあらゆる種類のナノ粒子を、単離したke細胞を用いて試験することが可能です。これにより、動物の使用を最小限に抑えつつ、信頼性の高いデータを収集することが可能になります。この手法が、ナノテクノロジー心理学分野の研究者が、ますます開発が進んでいる多くの有望なナノキャリアの安全性を screening するための道を切り拓く一助となることを期待しています。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ラット肝細胞の初代培養からマクロファージを取得するための新しい方法が記載されている。このメソッドは、プラスチック製の皿に選択的付着によって培養フラスコ及び精製の揺れが続く文化におけるマクロファージの増殖を、利用しています。この手法は、効率的に複雑な装置やスキルがなくても肝臓のマクロファージを提供します。...

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

ここで、我々は、肺に先天性免疫細胞を常駐し、無水物ナノ粒子との共培養に応答して活性化を検討しているマウスの肺胞マクロファージを採取するためのプロトコルについて説明します。...

マウス肺胞マクロファージを採取し、無水物ナノ粒子により誘導される細胞活性化を評価する

このビデオでは、マウスの肝臓からKupffer細胞または肝臓マクロファージを分離する方法を示します。肝臓に消化溶液を灌流し、続いて密度勾配分離を行います。単離された接着性Kupffer細胞は、さらなる分析に使用できます。...

マウスクッパー細胞の単離と培養

このビデオは、選択的増殖のためのヒト肝臓組織からのナチュラルキラー細胞またはNK細胞を含むリンパ球の単離を示しています。酵素的および機械的消化とそれに続く密度勾配分離により、NK細胞を含むリンパ球の単離が促進されます。収集されたリンパ球は、NK細胞の選択的増殖にさらに使用できます。...

選択的増殖のための肝臓組織からのナチュラルキラー細胞単離

フローサイトメトリーによる免疫細胞の亜集団と定義されたナノ粒子の相互作用の解析。...

フローサイトメトリーによる一次免疫細胞亜集団との蛍光ナノ粒子の相互作用を検出

ウランの酸化銅ナノ粒子による微量元素の除去<em&gt;その場での</em&gt;回復ブリード水と細胞生存率への影響

同じドナーからヒト肝細胞と非実質肝細胞を分離する技術が説明されています。さまざまな肝細胞タイプが、機能的な肝臓モデルと組織工学の基礎を構築します。この新しい方法は、肝細胞を高収量で生存率で単離することを目的としています。...

初代ヒト肝細胞と非実質肝細胞の対応する主な集団の単離のためのプロトコル

Microglia(脳の免疫細胞)は、ナノ粒子が神経毒性にどのように影響するかを決定するための代理バイオセンサーとして使用されます。ナノ粒子に対するミクログリアの応答と、活性化されたミクログリアからの上清への視床下部ニューロンの曝露をアッセイして神経毒性を決定するために設計された一連の実験について説明します。...

ナノ粒子神経毒性を決定するために、代理バイオセンサーとしてミクログリア

この手順は、急性または長期の反復用量レジーム上のナノ物質暴露に関連する遺伝子毒性有害性のより生理学的に関連する評価を提供することができるインビトロで高度な3D肝培養物を開発するために使用されるように確立された。...

長期ナノ材料暴露後のインビトロ遺伝子毒性試験のための高度な3D肝モデル

本論文は、三重陰性乳癌の同種マウスモデルからの原発性癌関連線維芽細胞の単離と培養と、腫瘍微小環境を標的とするように設計された新規ナノ粒子の前臨床試験への応用を目的とする。...

標的ナノ粒子の研究のための乳癌の同質性マウスモデルからの原発癌関連線維芽細胞の分離

ここでは、定常状態の末梢血から単核球を単離した単核球を用いてヒト自家肝スフェロイドを作製する非遺伝的方法を紹介します。...

肝疾患研究のための末梢血からのヒト肝スフェロイド

学ぶマウス肝臓からのクッパー細胞単離法と密度遠心分離による精製技術。ナノ粒子毒性評価のための高純度細胞培養モデルを確立し、フローサイトメトリーで純度を確認する方法です。

ナノ粒子の毒性試験のためのクッパー細胞の単離

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