脈絡叢上皮細胞の繊毛運動の観測エクスビボ

次の実験の全体的な目標は、脈絡叢上皮細胞であるセリアex vivoの動きを分析することです。これは、まずマウスの胚または子犬から脳を切除して脈絡叢組織を分離することによって達成されます。毛様体運動は、微分干渉コントラスト法(DIC顕微鏡法)によって視覚化され、その後、毛様体先端のデジタル動画を取得して、毛様体先端の位置を手動で追跡します。

最終的に、セリアの再構成された先端の動きは、その動きのパターンに基づいて分類され、定量化されます。この方法は、発生中にセリアの死亡率がどのように制御されているか、移動パターンは時間の経過とともにどのように変化するかなど、細胞生物学の主要な質問に答えるのに役立ちます。これらの技術の範囲の意味は、経路生理学的分析と診断でした。

シリア関連疾患は、キネティック・シリアに関する私たちの基本的な理解にはまだ拍車がかかっています。70%エタノールをすすぎた新生児マウスを、頭を氷冷リーボビッツL15に入れ、斬首直後に滅菌10センチメートルの皿に中程度に置くことから始めます。次に、時計メーカーの鉗子を使用して、頭蓋骨から頭皮を取り除きます。

次に、縦縫合糸に沿って頭蓋骨を中央部ごとに切り開いて脳を露出させ、続いて脳神経を切断して臓器全体を採取します。分離された脳を、背側を上にして、新鮮な氷、冷たい媒体で満たされた新しい皿に移し、皿を実体顕微鏡の下に置きます。次に、嗅球が3時の位置にくるように組織を向け、時計メーカーの鉗子で脳を優しくつかみます。

一方、細かい解剖鉗子を使用して、大脳半球と大脳幹をつなぐ大脳プーンを切断します。ディオンセファロンをつまんで半球をさらに分離し、切断面を上に向けて置き、続いてアフィア層を引っ張って海馬の外側に付着した側脳室脈絡叢を取り除きます。脈絡叢が分離されたら、組織を新鮮な媒体が入った35ミリメートルのガラス底皿に移し、安楽死から25〜60分以内に組織に重りを置いて静かに所定の位置に保持し、対物レンズの焦点を目で調整することにより、脈絡叢上皮細胞セリアのライブイメージングを開始します。

中心と焦点がクラ照明に合うようにコンデンサーを調整します。次に、適切な光学素子を光路に挿入して、DIC光学系に適合します。DICプリズムを動かして、画像の表面構造がはっきりと認識できる位置に画像のコントラストを調整します。

次に、光路をビデオカメラに切り替えて、光のパワーを上げます。NDフィルターを取り外して、観察フィールドとフォーカスを調整し、ビデオカメラの時間分解能を200ヘルツに、露光時間を0.1ミリ秒に設定して、目的のイメージング期間にします。次に、画像スタックが取得された後に画像を取得すると、各単一フレームにセリアの鮮明な画像が表示され、各繊毛の鼓動パターンを手動で追跡します。

マウスポインタを使用して、各フレームの毛様体先端の位置をマークします。次に、適切なソフトウェアを使用して、軌道データを分析し、軌道を前後または目視による回転の2つのモードのいずれかに分類します。この式を使用して、複数の毛様体拍動サイクルの毛様体拍動周波数を計算します。

同じ細胞上の他のセリアが各繊毛の動きを妨げる可能性があるためです。次に、1つのセル内の毛様体鼓動軸の角度均一性を分析します。前後の軌道では、セリアの先端の位置を直線に合わせ、シータを線がX軸に対して作る角度として定義します。

回転軌道の場合、楕円の主軸がx軸に対して行う角度としてシータを定義する楕円に位置を合わせます。最後に、各軌道を定量的に説明するために、軌道をシータで回転させ、軌道のアスペクト比を x 軸と y 軸に沿った分布の幅の比として定義します。この最初のクリップでは、高速ビデオ顕微鏡で画像化された生後2日目のマウスの子犬のセリアを含む脈絡叢上皮細胞の上面図が示されています。脈絡叢組織の不規則な表面により、焦点が合っていない平面と焦点が合っていない平面の両方で見えます。

この2つ目のクリップでは、前の動画の四角い部分を拡大して表示し、個々の繊毛が示す回転運動や前後の動きを詳しく観察することができます。ここでは、映画の記録から再構成された代表的な毛様体先端運動の軌跡を、グラフにプロットされた先端位置のx座標とy座標の時間経過とともに示しています。これらのグラフの 2 つの座標間の位相シフトを示すために、x 座標と Y 座標を正規化して重ね合わせました。

運動性CLIAはライブイメージングで容易に認識できますが、この方法で非運動性CLIAを特定することは容易ではありません。この困難を克服するために、走査型電子顕微鏡は、cliaの運動性に関係なく、CLIAの全体像を取得するために不可欠です。この手順を試行する際は、サンプルの鮮度が保たれ、シリアの運動性が維持されるように、十分に迅速に解剖を行うことを忘れないでください。

このビデオを見れば、ウイルス性シリアルで組織サンプルを調製する方法や、CX vivoの死亡率をモニタリングおよび定量する方法を十分に理解できるはずです。