動機付け行動の分子基質を研究するために齧歯類の脳マイクロインジェクション

この手順の全体的な目標は、カニューレとマイクロインジェクターを正確に製造し、マイクロインジェクションを適切に実行することです。これは、最初に適切な長さのカニューレを製造することによって達成されます。2番目のステップは、マイクロインジェクターを切断して組み立てることです。

次に、マイクロインジェクション用のマイクロインジェクター、チューブ、ポンプを準備します。最後のステップは、マイクロインジェクションを完了し、拡散期間を経過させることです。最終的に、マイクロインジェクションは、目的の脳領域に試薬を正確に注入するために使用されます適切な取り扱いを示します。

マイクロインジェクションには、私の研究室の学生であるライアン・ポーランドが参加します。一般的に、この方法に不慣れな人は、特別な注意を払う必要があり、適切なカニューレの配置とマイクロインジェクションの位置を確保するためにすべての手順に細心の注意を払う必要があるため、苦労します。最初にカニューレを準備するには、先端の細いペンを使用してテープに15ミリメートルの基準線を引きます。

次に、15ミリメートルのセクションをチューブに鋭利な油性マーカーで順番にマーキングするためのガイドとして使用します。次に、回転工具のゆっくりと回転するカットオフディスクにカニューレチューブを触れて、カニューレチューブをノッチします。マークされたポイントで、カニューレを180度回転させ、チューブの反対側にノッチを付けます。

チューブを完全に切断しないでください。閉塞につながる可能性があるためです。その後、チューブを鋭く曲げて15mmのセクションに分割します。次に、カニューレの両端を親指と人差し指の間のカットオフディスクに対して垂直に保持します。

カニューレチューブの先端をカットオフディスクの表面に接触させながら回転させると、先端が鈍くなります。その後、カニューレの両端を26ゲージの斜めの針で巻き取り、すべてのバリが取り除かれ、カニューレが遮られていないことを確認します。オブチュレータークランプを準備するには、中程度の重量のまっすぐな止血剤で約半分の長さの1つのカニューレを準備し、カニューレがベンチに対して垂直になるように、ロックされた止血剤をベンチに置きます。

次に、ベーターワイヤーの一方の端をカニューレに送り込み、ベンチに到達します。オブチュレーターとベンチの間の接触を維持しながら、30度の角度に達するまで指でつまんでワイヤーを曲げます。その後、カニューレからワイヤーを取り外し、小さな斜めカッターで曲げから2.5ミリメートルの余分な部分を切り取ります。

この手順では、マイクロインジェクターチューブの一方の端を、ロックされたまっすぐな止血剤で垂直に保持します。チューブに張力をかけたまま止血器をねじり、少なくとも1回は止血器にしっかりと巻き付けます。次に、マイクロインジェクターチューブの反対側の緩い端から32ミリメートルを測定し、2番目の止血器でこのポイントを垂直につかみます。

チューブが切れるまで張力を保ちながら、チューブを前後に曲げます。次に、マイクロインジェクターチューブを検査して、両端がまっすぐで、内径が遮られていないことを確認します。巻尺に5ミリメートルの基準線を引き、油性マーカーを使用してカニューレチューブの5ミリメートルセクションに順番に印を付けます。

次に、カニューレチューブをマークされたポイントでゆっくりと回転するカットオフディスクに触れて、チューブにノッチを付けます。次に、マイクロインジェクターカラーチューブを鋭く曲げて、5mmのセクションに分割します。片方のカラーを各マイクロインジェクターチューブの端から約2cmのところにスライドさせます。

マイクロインジェクターチューブの片方の端から5mmのところに少量の瞬間接着剤を塗布します。次に、カラーを瞬間接着剤ビーズの上にスライドさせて、マイクロインジェクションチューブの端から1mmになるようにします。その後、襟の両端を接着剤で覆います。

次に、滅菌水で満たされた1ミリリットルの注射器に26ゲージの針を取り付けます。そして、マイクロインジェクターのプラスチックチューブの8センチメートルの部分を針にスライドさせ、その後、プラスチックチューブのもう一方の端を乾燥したマイクロインジェクターのカラー端にスライドさせた後、チューブに穴を開けないように注意してください。このステップ C.In、特許をテストするために水入りシリンジプランジャーを押し、完成したマイクロインジェクターをカラーの反対側の端から15ミリメートルで95度曲げます。

次に、プラスチックチューブを70センチメートルにカットし、マイクロインジェクターカラーにスライドさせます。マイクロインジェクション用のポンプを準備するには、マイクロインジェクション針の必要な注入速度の直径とチューブ上の目標注入量を設定します。次に、ポンプモードをボリュームに設定して、正確なボリュームが自動的に配信されるようにします。

次に、ポンプのバックストップを調整して、シリンジを注入量に加えて0.2マイクロリットルまで充填できるようにします。次に、ガスタイトシリンジの先端を小さなホエイボートに含まれる滅菌水に入れ、プランジャーを静かに羽ばたかせて内部ワイヤーを均一に潤滑します。プランジャーをポンプのバックストップに引っ張って、マイクロインジェクション針に水を入れます。

次のスライド。1ミリリットルの滅菌水充填シリンジに取り付けられた26ゲージの針にマイクロインジェクターに接続されているPE 20チューブ。マイクロインジェクターに滅菌水を噴霧し、噴霧パターンと距離を検査します。

次に、滅菌したマイクロインジェクターを滅菌フィールドに置きます。チューブを針からスライドさせて外し、針で損傷した部分の下のチューブを直立させたまま切断して、水が滴り落ちないようにします。次に、マイクロインジェクターシリンジプランジャーを少し前方に押して針の端に液滴を作り、水で満たされたPE20チューブを針にスライドさせます。

その後、プランジャーを完全に前方に押してサンプルロードの準備をし、マイクロインジェクターに微量のエタノールが残っていないことを確認します。マイクロインジェクターの先端に形成された水滴にクリーンラボワイプで数回触れて、セッティングに漏れがないか確認してください。次に、シリンジプランジャーを0.2マイクロリットル引き戻して、滅菌水とPE 20チューブと注入する溶液との間に気泡を作ります。

その後、マイクロインジェクターを注入する試薬に入れ、シリンジプランジャーをバックストップにゆっくりと引きます。動物を注射する準備をするには、ラットの胸を実験者の胸に当てます。カニューレの周りをベタジンに浸した綿のアプリケーターで清掃します。

ヘッドキャップをベタジンで3回綿棒で拭き、次にエタノールで2回綿棒で拭きます。次に、充填されたマイクロインジェクターをカニューレに入れます。マイクロインジェクションポンプのスタートを押し、気泡の動きを監視します。

注入が完了したら、マイクロインジェクターをカニューレから取り外し、オブチュレーターと交換します。この図は、微量注入ウイルスによる側坐核星状細胞領域のトランスフェクションを示しており、この図は、側坐核で過剰発現した導入遺伝子を活性化することにより、ラットがエタノールを自己投与する動機が低下したことを示しています。CNOの全身投与による恐怖のコアアストロサイトサイトの活性化は、ビヒクルCNOと比較して、禁欲後にエタノールを自己投与するラットの動機を有意に低下させました。これは、恐怖ではなくGFPを発現していた同様に訓練されたコホートでは効果がありませんでした一度習得した。

この技術により、カスタマイズされた脳マイクロインジェクションの器具が可能になり、実験手順の柔軟性がさらに高まります。この手順を試みる際には、目的の効果を達成するためには、正確なマイクロインジェクションの位置が不可欠であることを覚えておくことが重要です。