ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法インビトロ感受性試験

次の手順の全体的な目標は、ダルババンシンの最小阻害濃度を決定することです。これを行うために、Dalbavancinに固有の主要なステップに焦点を当てたブロス微量希釈法を使用します。ダルババンシンのストックおよび中間希釈はDMSOで行われ、最終希釈はポリソルベートを添加した調整済みMueller Hintonブロスで陽イオン中で行われます。

希釈液を96ウェルプレートに分注し、標準化された細菌懸濁液を接種します。次に、プレートを16〜24時間インキュベートし、細菌の増殖を阻害するために必要なダルババンシンの最小量を決定するために検査します。この標準化された方法への順守は、臨床分離物と、ここに示すように、品質管理分離物ダルババンシンは、グラム陽性菌によって引き起こされる急性細菌性皮膚および皮膚構造感染症の治療のためにFDAによって承認された半合成リポ糖ペプチド抗菌剤です。

この方法は、標準化されたブロス、プラスチックへの薬剤の付着を軽減するためにポリソルベート80にストック溶液を調製するためのDMSOの使用を含む、ダッシンのためのマイクロ希釈感受性法を説明していますこの方法の視覚的なデモンストレーションは有用です。ストックおよびMICプレート溶液の調製ステップは、ほとんどの抗菌剤と比較して一般的ではありません。これらのステップはリポ糖ペプチド剤に特有のものであり、再現性のある正確なMIC結果を得るためには、従うべき重要なステップです。

この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるGina Fisherです。以下の手順を実行する際には、バイオセーフティレベル2と一致する適切な安全対策を利用する必要があることに注意してください。まず、適切な量のダルババンシンを計量して、1ミリリットルあたり800マイクログラムの原液を調製します。

滅菌ガラスまたはプラスチックチューブにNEAT DMSOを適量加え、粉末をチューブに移してボルテックスします。次に。800マイクログラム/ミリリットルのDALBAVANCIN原液を使用して、カラム1から4に示すように、最終MICプレート濃度の100倍を調製します。これらは中間濃度と呼ばれます。

準備される総量は、MICパネルの数によって異なります。最後に、カチオン未調整のミューラーヒンテンブロス(C-A-M-H-Bとしても知られる)に0.004%P 80を添加した中濃度を1〜100に希釈します。結果として得られるダルババンシンとP 80の使用濃度は、最終濃度の2倍です。

接種物の添加は、滅菌チップ付きのマルチチャンネルピペットを使用して1〜2希釈になるため、ダルババンシンの各希釈液の50マイクロリットルを96ウェル滅菌マイクロ希釈パネルの適切なウェルに分注します。MICプレートフォーマットでは、プレートごとに8つの無眼をテストできます。パネルをすぐに使用しない場合は、プラスチックフィルムを貼って密封し、ビニール袋に入れて、必要になるまで摂氏マイナス60度以上の非霜取り冷凍庫に保管してください。

このデモンストレーションでは、作りたてのプレート1枚を接種します。接種物を調製するには、18〜24時間の血液オーガーまたは他の非選択的オーガープレートからいくつかの十分に分離されたコロニーを選択します。ここでは、品質管理のアリアとEPHIのカルス株が使用されています。

滅菌綿棒で各コロニーの上部に触れ、その一部を1〜5ミリリットルのC-A-M-H-Bまたは生理食塩水を含むチューブに移します。濁度が準備から15〜30分以内に0.5マクファーランド標準に一致するまで移し続け、接種物をC-A-M-H-Bで100に希釈して、ミリリットルあたり10〜5CFUの5倍の最終濃度に到達します。許容範囲は、ミリリットルあたり10〜5CFUの2〜8倍です。

すぐに滅菌チップ付きのマルチチャンネルピペットを使用して、最終的な接種物の50マイクロリットルをここでMICパネルプレートの各適切なウェルに移します。4つの列に2つの分離株のそれぞれを接種し、分離株ごとに合計4回の反復を行います。次に、純度チェックを行うには、ピペットを使用して、ポジティブ成長コントロールの溶液の1〜10マイクロリットルを非選択的寒天に移します(5%の羊の血液を含む崩壊の大豆寒天を試すなど

滅菌ループを使用して、溶液をプレートの表面に広げます。プレートを90度回転させ、再度縞模様を通して、接種物が均等に分布していることを確認します。プレートに蓋をして脇に置きます。

コロニーカウントの準備として、シングルチャネルピペットを使用して、成長制御ウェル内の溶液の10マイクロリットルを生理食塩水混合物の10ミリリットルに移し、次に100マイクロリットルを適切な非選択的農業培地に移します、例えば、滅菌ループを使用して5%羊の血液でトアイ大豆寒天培地を試してみてください、全体の農業表面に溶液を広げます。このプロセスを異なる方向に2回繰り返して、接種物が均一に分布するようにします。次に、プラスチック容器に最大4枚のMICパネルを積み重ね、トップパネルが蓋でしっかりと密閉されていることを確認します。

次に、湿らせたペーパータオルをプラスチック容器の中に入れ、接種後30分以内に蓋でしっかりと閉じます。MICパネル、コロニーカウントプレート、および純度チェックプレートを、周囲空気インキュベーター内で摂氏35度またはマイナス2度で16〜20時間インキュベートします。翌日、肉眼で検出したウェル内の細菌増殖を完全に阻害する最低濃度として、最小阻害濃度を読み取ります。

コロニーカウントプレート上のコロニー数を決定します。カウントされた数値に希釈係数を掛けます。例えば、50コロニー×希釈係数10,000は、5×10に10を5倍して1ミリリットル当たりの5番目のCFUに等しい。

許容範囲は20〜80コロニーであり、これは1mlあたり10〜5番目のコロニー形成単位の2〜8倍に相当します。接種物の濃度は、正確な結果を得るために感受性試験を制御するための重要な変数です。最後に、純度プレートを確認します。

すべてのコロニーが接種物として使用されるコロニーと類似している場合、それは純粋と見なすことができます。他のコロニーが存在する場合は、MICパネルに汚染物質が存在する可能性があるため、テストを繰り返す必要があります。DALは、MICの結果と、ここに示すようにagri希釈法を用いて得られた結果と比較した。

ダルベバンのアグリMICの結果は、通常、ブロスよりも2〜8倍高くなります。マイクロ希釈、MIC結果。このコントラストバンコマイシンは、ブロスとアグリ法による結果をもたらします。

したがって、ダルババンシンダルババンシンブロスの試験には、農薬希釈は推奨されません。微量希釈MICの場合、品質管理の結果は、ここに示すように予想される範囲内にあるはずです。SS品質管理生物であるA TCC 2 9 2 1 3は、0.06マイクログラム/ミリリットルの非常に明確なモーダルMICを持ち、メソッドのばらつきの良い指標となっています。

得られた結果が品質管理微生物の予想範囲外であるか、範囲の下限または上限のいずれかに傾向がある場合は、メソッドのさらなる検証が必要です。品質管理生物、ダルババンシン、地域の抗菌薬サーベイランスプログラムからのMICデータを使用した方法の検証に加えて、ここに示すように、Dal b Anson MICは、2011年から2013年にヨーロッパと米国で収集された分離株の結果は、SIUの99.9%と連鎖球菌の100%に対して1ミリリットルあたり0.25マイクログラム未満でした。これらの監視データに基づくと、ブドウ球菌および連鎖球菌のダルババンシンMICの結果が0.12マイクログラム/ミリリットルを超えることはまれであることは明らかです。.

より高い数値が見られる場合は、テストを繰り返すか、検証のために参照ラボに送る必要があります。DMSOでのストック希釈液の調製と、最終MICウェルの0.002%の濃度でブロス希釈液にP 80を添加することは、正確で再現性のあるダルババンシンMICの結果を得るための重要なステップです いつものように、しかし特に細菌耐性開発のこの領域では、正確な抗菌剤感受性の結果は、臨床医が適切な治療法を選択するために重要です。