Name: 振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ 振動圧力潅流装置を用いたラット肝臓の脱細胞化手法。動脈潅流により均一かつ迅速な脱細胞化を実現し、組織工学や再生医療におけるスキャフォールド作成に応用可能です。

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/ 0365レッグ号のO;動物は、実験医学（FEM、シャリテ、ベルリン、ドイツ）のための施設で維持し、全ての実験プロトコルが見直され、健康と地方事務のステートオフィス（LAGeSo、ベルリン、ドイツによって承認されました。 11）。 1.肝臓の収穫<ol><li>手術前の準備<ol><li>固定のためにコルク板を使用してください。プレートに医療ドレープを入れてください。 4針を使用して、術中の吸入麻酔のためのコルク板に吸入マスクを固定します。 </li></ol></li><li>ポータル静脈カニューレの前準備<ol><li>三方活栓に末梢静脈カテーテル（G 20）を接続します。静脈カテーテルは、約の長さで、斜めにカットされるべきです。 1.5センチメートル。 </li><li>デ空気リンゲル液を充填した10mLのシリンジを使用してシステム。ガス塞栓症が否定灌流脱細胞化に影響を与える可能性があるので、慎重に脱空気に非常に重要です。 </li></ol></li><li>談合動脈カニューレの<ol><li>蝶のカニューレを使用し、5mmの長さに針をカット。 5ミリメートルの針にし、瞬間接着剤で固定し、5cmの管（外径0.96ミリメートルID 0.58ミリメートル）を取り付け。大きなチューブにし、瞬間接着剤で固定し2センチ長い管（OD 0.61ミリメートルID 0.28ミリメートル）を挿入します。 </li><li>アバットメントとしてこの構造の上に別のチューブをスリップし、瞬間接着剤で固定します。デ空気リンゲル液を充填した5mLのシリンジを用い動脈カニューレ。 </li></ol></li><li>麻酔や鎮痛<ol><li> 1.5 L /分の流量で酸素3.5％イソフルランによる麻酔誘導チャンバー内のラットの麻酔を誘導します。 </li><li>動作中に安全な鎮痛を確保するために、腹腔内にメタミゾールた（100mg / kgの体重）及び低用量のケタミン/メデトミジン（10mg / kgの体重あたり0.1 mg）を注入します。 </li><li>外科麻酔法のその後のメンテナンスのための吸入マスクを介して1リットル/分の酸素中の1.5％イソフルランを供給する。 </li></ol></li><li>術前アレンジメント&lt;オール&gt; <li>電気せん断機で自由に腹部を剃ります。消毒用の70％エタノールで腹部に剃毛切開部位を湿ら。 </li><li> 、準備されたプレート上に仰臥位で動物を置き吸入マスクにヘッドを挿入し、医療テープとピンと手足を固定します。ガーゼ湿布で過剰のエタノールや毛皮を削除します。 </li></ol></li><li>麻酔評価<ol><li>呼吸数を見て、麻酔の深さを評価します。麻酔は（40〜60呼吸/分）十分な深思わ場合には、鎮痛は、両方の後肢の足の指の間の皮膚を挟ま手術用鉗子を使用して、つま先のピンチ反射をトリガーしようとすることで十分であるかどうかを確認してください。 </li></ol></li><li>腹部アプローチ<ol><li>膀胱上記尾腹壁に正中切開を行います。 V字状に両側肋骨のアーチには、この点からカット。振動板に切断しないように注意してください。胸の上にカット腹壁を引き出します。 </li&gt; <li> 、オーバーホルトクランプで剣状突起を修正頭側に引き、ゴムバンドで固定します。腸を排出するために湿った綿棒を使用してください。濡れたガーゼ包帯で腸を包みます。また、濡れた包帯を持つすべての腹部のマージンをカバーしています。 </li></ol></li><li>肝臓の準備<ol><li>鎌状靭帯を解剖。頭側振動板のドームの下で内側と左肝葉を保持するために、湿ったガーゼの包帯を使用してください。肝十二指腸間膜および上部大網肝葉を公開します。 </li><li>ローブが携帯するまで慎重に上部大網葉に付着した靱帯を分析するために、2つのマイクロピンセットと春のはさみを使用してください。代わりに、内側と左葉を保持する、ガーゼ湿布の下ウェット綿棒を使って葉を移動します。 </li><li>上部の大網肝葉の動員後、左に胃を移動します。クランプで胃を修正して、マイクロピンセットと春のはさみとマイナー大網を分析。 </li><li>下omentumの複数形を動員L肝葉、モバイルであり、その後、その空洞内にバックローブを移動するまで。十二指腸を保持するために、バックハウスクランプを使用してください。ストレッチや肝十二指腸間膜を露出させるために左に十二指腸を移動します。延伸肝十二指腸間膜内の総胆管を取り囲みます。 </li><li>脂肪および膵臓組織からの胆管を解剖。胆管分岐部から胆管1.5センチカット。周囲の脂肪組織から門脈を分析。胃十二指腸静脈を露出させます。 </li><li>シルク6-0で二回、胃十二指腸静脈を結紮し、2合字間の静脈を分割。すべての動脈枝が明らかにされるまで、周囲の組織から腹腔動脈と総肝動脈を解剖。 </li><li>周囲の組織から胃十二指腸動脈を解放。互いに離れタイで、絹6-0で二回胃十二指腸動脈を結びます。 2合字の間に胃十二指腸動脈を解剖。 </li><li>脾動脈を解放周囲の組織から。互いに離れタイで、絹6-0で二回脾動脈を結びます。 2合字の間に脾動脈を解剖。 </li><li>周囲の組織からの左胃動脈を遊離。互いに離れタイで、絹6-0で二回、左胃動脈を結びます。 2合字間動脈を解剖。 </li><li>右腎と右横肝葉の間の下大静脈を囲みます。後腹膜腔からの静脈を解剖。腹腔動脈に従うことによって大動脈を露出させます。 </li><li>後腹膜脂肪組織を解剖。下大静脈に1ミリリットルの生理食塩水で千IEヘパリンを注入します。カニューレを撤回し、綿パッドで切開を閉じます。ヘパリンの全身的な効果のために1〜2分待ってください。 </li><li>ピンセットで大動脈を囲みます。大動脈を解剖し、ラットを放血。また、腎臓から遠位下大静脈を解剖。 </li></ol></li><li>門脈カニューレ挿入（セクション1.2で調製したカニューレを使用してください） <ol><li>遠位門脈魚口切開を行います。鉗子で切開を開き、門脈にカニューレを挿入。肝臓脱色するまで20ミリリットルリンゲル液で肝臓をフラッシュし、合字（絹6-0）でカニューレを固定します。 </li></ol></li><li>動脈カニューレ挿入（セクション1.3で調製したカニューレを使用してください） <ol><li>腹腔動脈上記の大動脈を解剖。後腹膜腔からの大動脈セグメントを解放します。大動脈パッチを生成するために、縦方向に大動脈セグメントをカットします。静的ホルダーに自作のカニューレを挿入します。 </li><li>カニューレを介して大動脈パッチをスリップする2ピンセットを使用してください。カニューレ上のシルク6-0と肝動脈を結紮し、突合せ部でパッチを修正。 </li></ol></li><li>肝外植<ol><li> 、絞りを開いた円形の切開を行い、周囲の構造から肝臓を分析。 </li></ol></li><li>ストレージ<ol><li> STO使用するまで350ミリリットルリンゲル液で満たされた500mlの滅菌槽内の肝臓再。 </li></ol></li></ol> 2.洗剤溶液<ol><li> 10％トリトンX-100の原液<ol><li> 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。 、100mlのトリトンX-100（99.9％）を追加します。トリトンX-100を溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。 </li></ol></li><li> 1％トリトンX-100 <ol><li>千ミリリットルボトルにストック溶液100ml（10％）を加えます。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1％トリトンX-100液をフィルタリングします。 </li></ol></li><li> 10％SDS原液<ol><li> 900ミリリットルの水ビデと千ミリリットルのボトルを埋めます。および66.99グラムのSDS（99.9％、密度0.67）を追加します。 SDSを溶解するために撹拌機を使用してください。水ビデでボトルを埋めます。千ミリリットルの全容量に達するまで。 </li></ol></li><li> 1％SDS <ol><li>千ミリリットルボットにストック溶液100ml（10％）を追加TLE。 900ミリリットルの水ビデを追加します。二回ボトルを振ります。滅菌フィルターを介して、1％SDS溶液をフィルタリングします。 </li></ol></li></ol> 3.脱細胞化<ol><li>潅流装置のセットアップ<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig1.jpg" /></li></ol> 図1：発振の圧力条件の下で選択的動脈、フォーラット肝臓の門脈灌流のための灌流装置のスキーム （Struecker ら 14から変更されました。）。 <ol><li>三方活栓および充填レベルを調節し、500ミリリットル0.9％NaClで反応器に充填するハイデルベルグの拡張子にドレインをリンクします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig2.jpg" /></li></ol> 図2：（4）門静脈アクセスを介して気泡トラップ（5）（2）または動脈を介して交流先端に灌流セットアップスキーム灌流チャンバーのリンク（1400センチメートル3）（1）セス（3）。気泡トラップは、（5）先端の閉塞（4）とベント（6）を装備する必要があります。ハイデル拡張（7）に気泡トラップ（5）を接続します。ポンプセグメント（8）にハイデルベルグの拡張子をリンクします。また、別のハイデルベルグ拡張（9）にポンプセグメント（8）を接続してください。界面活性剤溶液（10）のボトルに最後のハイデル拡張（9）を挿入します。 （または複数の灌流の場合には圧力分配器）灌流チャンバーに人工呼吸器（11）を接続します。原子炉流体を排出するために、廃棄ボトル（12）への流出を接続します。 <ol><li>ポンプ内にポンプセグメントを挿入します。 PBSでサイクルを埋めるためにポンプを起動し、気泡トラップの先端を閉じて、通気口を開きます。泡の底部がしっかりとPBS（2-3センチ）で覆われている場合には、通気孔を閉じて、気泡トラップの遠位端を開きます。 </li><li>肝臓のインストール<ol><li>関連リアクターアクセスに門脈カニューレの三方活栓をリンクします。 C言語動脈アクセスに動脈カニューレONNECT。全く空気がシステムに入らないことを保証するために注意してください。 </li></ol></li><li>振動の圧力条件の適用<ol><li> 15 BPMの周波数と26ミリバール（分4ミリバール、最大30ミリバール）の振幅と呼吸器を使用してください。圧力分布室に呼吸器を接続し、反応器に、チャンバを接続します。圧力アプリケーションを起動します。 </li></ol></li><li>脱細胞化プロトコル<ol><li> /分5ミリリットルの流量で灌流手順を実行します。 90分間、1％トリトンX-100と肝臓の灌流に脱細胞化を開始します。灌流チャンバーを一定の内側と灌流肝臓上記流体レベルを維持するために潅流装置の流出を介して廃棄物の流出を可能​​にします。 90分後、1％SDSに界面活性剤を変更します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig3.jpg" /> <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/53029/53029table1.jpg" /></li></ol></li></ol> &lt;P&gt; 図3：すべての実験グループの灌流プロトコル。

<ol><li>Struecker, B., Raschzok, N., Sauer, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+support+strategies%3A+cutting-edge+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver support strategies: cutting-edge technologies.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11, 166-176 (2014).</li>
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<li>Park, K. M., Woo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+decellularization+for+multi-organ+scaffolds+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+proceedings%22%5BJournal%5D)">Systemic decellularization for multi-organ scaffolds in rats.</a> Transplantation proceedings. 44, 1151-1154 (2012).</li>
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<li>Ren, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+decellularization+methods+in+the+development+of+a+whole-organ+decellularized+rat+liver+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold.</a> Liver Int. 33, 448-458 (2013).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+rat+liver+decellularization+by+arterial+perfusion+under+oscillating+pressure+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Improved rat liver decellularization by arterial perfusion under oscillating pressure conditions.</a> J Tissue Eng Regen Med. , (2014).</li>
<li>Struecker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porcine+Liver+Decellularization+Under+Oscillating+Pressure+Conditions%3A+A+Technical+Refinement+to+Improve+the+Homogeneity+of+the+Decellularization+Process%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+C%2C+Methods%22%5BJournal%5D)">Porcine Liver Decellularization Under Oscillating Pressure Conditions: A Technical Refinement to Improve the Homogeneity of the Decellularization Process.</a> Tissue engineering. Part C, Methods. , (2014).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ラット肝収穫と脱細胞化のための提示の技術を容易に再現可能であるが、考慮すべき特定の重要なステップがあります： それは血液凝固を活性化し、肝臓内の血栓形成につながる可能性があるため、肝臓収穫の準備中に、重度の出血を回避することが重要です。私どもの意見では、門脈を介して灌流の間、肝動脈を介して血液流入を回避するために、門脈のカニューレ挿入直前に腹部大動脈を切開することが有利です。肝臓は、カニューレを挿入し、明確に灌流された後、血餅形成は、もはや問題ではありません。 灌流円に気泡のエントリは、ガス塞栓症を防止するために避けなければならないので、潅流装置の肝臓収穫および輸送の後、潅流装置と肝臓の接続は、特に重要なステップです。これは、三方弁を事前入力することが有用である私PBSを灌流システムにバルブを接続する前に、直接注射器と細いカニューレを用いて、肝臓カニューレに接続されているのです。 灌流後に再チェックする必要がありますが、すべてのチューブコネクタ、三方弁とチューブが完全に接...

脱細胞化および再細胞化は、in vitro 1 における機能性、移植臓器の生成を可能にすることができます。器官からの細胞および抗原性物質（ 例えば 、DNA、α-GALエピトープ）を除去することにより、以下の非免疫原性細胞外マトリックス（ECM）を得ることができます。この行列は、臓器の三次元ミクロ解剖学を節約し、別の、おそらく異種起源2の細胞を用いた再増殖のための理想的なバイオマトリックスとして機能することができます。このように、脱細胞化ラット肝臓マトリックスは、ヒト肝細胞で再増殖することができます。このヒト化マイクロ肝臓疾患の研究のために（ 例えば 、先天性代謝性疾患、ウイルス性疾患または悪性腫瘍）または前臨床医薬品試験3のためのex vivoでのモデルとして役立つことができます。 ラット肝灌流脱細胞化するためのいくつかの異なるプロトコルは、すでに4-13を公開されています。すべてのプロトコルでは、decellular化は、カニューレを挿入し、門脈を介してアルカリイオン性または非イオン性界面活性剤の灌流によって達成されました。我々の知る限り、我々は門脈および/ ​​またはラットの肝動脈14を介して選択的灌流によりラット肝脱細胞化を報告する最初のグループでした。肝臓内の異なる血管系の選択的灌流を有効にすると、よりよい脱細胞化した結果を可能にして、さらに、細胞再生に重要な役割を果たしている可能性があります。 ここで詳細な研究では、肝臓は、振動圧力条件下で灌流を可能にする、カスタムメイドの独自の灌流装置で灌流しました。これらの圧力条件は、肝臓の生理的な呼吸器依存灌流を模倣する： その場で 、肝臓は動き、呼吸時の肝灌流に直接影響を与え、振動板のコピュラの下でハングアップします。インスピレーションは、具体的に最適化し、肝臓の振動板と絞りの低下につながります肝静脈流出が、一方、有効期限は、肝臓の上昇とポータル静脈流入15を最適化するために、腹腔内圧の低下につながります。 私たちの目的は、振動圧力条件は、ex vivoでの腹腔内条件を模倣することによって、ラット肝灌流脱細胞化の均一性に影響を与えるかどうかを評価することでした。脱細胞化プロセスの均一性は灌流脱細胞化で過小評価要因になることがあります。 ECMに肝臓の脱細胞化の原因の変更のために使用されるすべての知られている薬剤。他の領域がすでに完全に脱細胞化されているのに対し、乏しい灌流領域の細胞は、ECM内に残ります。残りの細胞を溶解するために、灌流期間または圧力が十分に灌流領域に複数の変化を引き起こし、上昇する必要があります。このように、脱細胞化のための界面活性剤は、臓器内に均一に分布されるべきです。

<table><tbody><tr><td colspan="4">自作の動脈カニューレ</td></tr><tr><td>&nbsp;Portex非滅菌ポリエチレンチューブ</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/100</td><td>0.28 mm ID 0.61 mm OD&</td></tr><tr><td>nbsp;Portex 非滅菌ポリエチレンチューブ</td><td>SIMS Portex</td><td>REF 800/110/200</td><td>0.58 mm ID 0.96 mm OD</td></tr><tr><td>Venodrop Safe butterfly catheter</td><td>Fresenius Kabi</td><td>3275851</td><td>21 G</td></tr><tr><td colspan="4">portal vein cannula</td></tr><tr><td>末梢静脈カテーテル</td><td>BD</td><td>393224</td><td>BD Venflon Pro 20G</td></tr><tr><td>三方活栓</td><td>鍛冶屋医療</td><td>888-101RE</td><td></td></tr><<tr>td colspan="4">手術</td></tr><tr><td>コットンスティック</td><td>Hecht-Assistent</td><td>4302</td><td></td></tr><tr><td>コットンパッド&nbsp;</td><td>紹興Zhengde外科ドレッシング</td><td>13H118-03</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ包帯</td><td>湖北海歌&nbsp;医療機器</td><td>14388&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp;リンガー溶液</td><td>フレゼニウスカビ</td><td>13 HKP022</td><td>1000 ml</td></tr><tr><td>10 mlシリンジ</td><td>ブラウン</td><td>4606108V</td><td>10 ml /ルアーソロ</td></tr>5 <tr><td>mlシリンジ</td><td>ブラウン</td><td>4606061V</td><td>5 ml /ルアーソロ</td></tr><tr><td>縫合糸(シルク6/0)</td><td>Resorba</td><td>H1F</td><td>LOT 105001.81</td></tr><tr><td>医療用ドレープ</td><td>紹興Zhengde外科ドレッシング</td><td>D0613011</td><td></td></tr><tr><td colspan =" 4">外科器具</td></tr><tr><td>ニードル</td><td>ホルダーGeuder</td><td>17570</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ鉗子</td><td>Inox-Electronic</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>マイクロはさみ</td>マー<td>ティン</td><td>11-740-11</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ鉗子</td><td>S&T&nbsp;</td><td></td><td></td>112314</tr><tr><td>クランプ</td><td>Aesculap</td><td>BH111R</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>FS T&nbsp;</td><td>14501-14</td><td></td></tr><tr><td>外科用鉗子</td><td>Aesculap</td><td>BD 557<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Decellularisation</td></tr><tr><td>Resmirator</td><td>Resmed</td><td>14.24.11.0004</td><td>SmartAIR ST</td></tr><tr><td>灌流装置</td><td>Charite、医療工学研究所</td><td>カスタムメイドデバイス</td><td>脱細胞化装置</td></tr><tr><td>蠕動ポンプismatec reglo ICC</td><td>IDEX</td><td>ISM4408&nbsp;</td><td>4チャンネル</td></tr><tr><td>ハイデルベルガーエクステンション75cm&nbsp;</td><td>フレゼニウス・カビ</td><td>2873</td><td>75 cm</td></tr><tr><td>MS/CA ポンプセグメント</td><td>IDEX</td><td>IS 3510&nbsp;</td><td>MS / CA /クリック&ゴー/ POM-C</td></tr><tr><td>CA 2ストッパーチューブ</td><td>Pharmed</td><td>BPT NSF-51</td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ&nbsp;</td><td></td><td>カスタムメイドアイテム</td><td></td></tr><tr><td>ルアーロックホースコネクター</td><td>Neolab</td><td>No. 02-1887</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">洗剤</td></tr><tr><td>SDSペレット</td><td>カール・ロス&nbsp;</td><td>CN30.4&nbsp;</td><td>2.5キロ</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>カール・ロス&nbsp;</td><td>3051.1&nbsp;</td><td>10リットル</td></tr><tr><td>PBSの&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>DPBS</td></tr><tr><td colspan="4">染色</td></tr><tr><td>Eosin 1%</td><td>Morphisto</td><td>10177</td><td></td></tr><tr><td>Mayer hematoxylin</td><td>AppliChem</td><td>A4840</td><td></td></tr><tr><td>gomori 染色</td><td>Morphisto</td><td>11104</td><td></td></tr><tr><td>AlcainBlue-PAS 染色</td><td>Morphisto</td><td>11388</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>365548</td><td></td></tr></tbody></table>

振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

実質臓器の脱細胞化と再細胞化は、in vitroでの機能的な臓器の生成を可能にする可能性があり、げっ歯類の肝脱細胞化のためのいくつかのプロトコルがすでに発表されています。私たちは、門脈や肝動脈を介した選択的灌流を可能にする独自の灌流装置を構築することにより、脱細胞化プロセスの改善を目指しました。さらに、振動する周辺圧力条件下で灌流を行うことで、脱細胞化の均一性を向上させることを目指しました。灌流脱細胞化の均質性は、これまで過小評価されてきた要因でした。脱細胞化中、灌流が不十分な臓器内の領域にはまだ細胞が含まれている可能性がありますが、灌流が良好な領域の細胞外マトリックス(ECM)はすでにアルカリ性洗剤の影響を受けている可能性があります。振動する圧力変化は、呼吸中に発生する腹腔内圧力変化を模倣して、肝臓内の微小灌流を最適化することができます。ここで紹介する研究では、脱細胞化ラットの肝臓マトリックスを組織学的染色、DNA含量分析、および腐食キャスティングによって分析しました。肝動脈を介した灌流は、門脈灌流よりも均質な結果を示しました。振動圧力条件の適用により、灌流脱細胞化の有効性が向上しました。肝臓を肝動脈を介して灌流し、振動圧力条件下で灌流した肝臓は、最良の結果を示しました。当社独自のデバイスを使用した肝臓採取、カニューレ挿入、灌流の提示された技術により、ラット肝臓の脱細胞化および再細胞化実験を改善するための高度な灌流セットアップが可能になります。

均一性、したがって異なる脱細胞化プロトコルの有効性を肉眼観察し、組織学的分析、及び脱細胞化肝臓行列内の残りのDNA含量の分析によって評価しました。また、腐食鋳造は脱細胞化後の肝臓の無傷のミクロ解剖学を視覚化するために実施しました。 肉眼検査脱細胞化の間に、肝臓は、携帯コンテンツの削除を示す、ルーセントとなります。門脈を介して灌流肝臓を脱細胞化中および後に肉眼で見える残っている細胞（白矢印）で、不均一な解明（従って、脱細胞化）を示しました。肝動脈を介して灌流肝臓は、より均質な脱細胞化の過程と目に見える残りの細胞を示しました。肝臓を振動圧力条件を適用して灌流した場合、残りの細胞は関係なく、灌流経路の、見えませんでした。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53029/53029fig4.jpg" /> 図4：圧力条件を振動することなく、ラット肝脱細胞化の肉眼結果 。左：肝動脈を介して脱細胞化ラ...

私たち独自のデバイスを使用した肝臓採取、カニューレ挿入、灌流のための提示された技術は、ラット肝臓の脱細胞化と再細胞化実験を改善するための洗練された灌流セットアップを可能にします。

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

本実験の全体的な目的は、ラット肝臓の灌流脱細胞化において、灌流ルートが均質性の最適化に果たす役割を評価することです。まず、新鮮に摘出されたラット肝臓の門脈と肝動脈にカニュレーションを行います。次に、門脈または肝動脈を選択的に灌流するため、肝臓を灌流装置に接続します。次に、呼吸中に発生する腹圧の変化を模倣するため、灌流チャンバーに振動圧の変化を加えます。肝臓の微小灌流を最適化することで、最終的に振動圧条件下で肝動脈を介して灌流された肝臓は、肉眼観察ならびに組織学的および生化学的分析によって評価される通り、より均一で迅速な脱細胞化を示します。門脈灌流脱細胞化などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、振動圧条件下での動脈灌流により、より均一な脱細胞化結果が得られることです。とはいえ、この手法を用いることで、より短時間で減速技術に関する知見を得ることが可能です。また、本手法は、再太陽光消毒実験、口腔外灌流セットアップ、臓器モデルなどの他のシステムにも適用できます。一般的に、赤色の肝臓の採取および動脈カニュレーションは困難を伴う場合があるため、この手法に不慣れな方は苦労することがあります。肝臓を採取する前に、外周G 20静脈カテーテルの1.5 cmの断片の先端を斜めにカットします。カテーテルを三方活栓に接続し、リンゲル液を満たした10 mLシリンジを使用してシステム内の空気を抜きます。次に、バタフライ針の針先を5 mmの長さにカットし、瞬間接着剤を用いて5 cmのチューブを針に固定します。2 cmの長さのチューブをより太いチューブに挿入し、このチューブも瞬間接着剤で固定します。この構造物の上にさらに別のチューブを被せ、接着剤で固定してアバットメントを作成します。次に、リンガー液を満たした5 mLのシリンジを使用して、新しく作製した動脈カニューレを洗浄し、採取のために肝臓を修復します。まず、麻酔をかけた成体ラットの横隔膜ドーム下にある内側および左肝葉を、濡らしたガーゼで保持します。このとき、肝十二指腸靭帯と上肝葉も露出させます。次に、2本のマイクロピンセットとスプリング鋏を用い、大網上葉に付着している靭帯を、葉が可動するまで慎重に剥離します。次に、内側葉と左葉を固定します。濡らした綿棒を使用して、葉をGREのコンプレス（圧迫部）の下へ、胃を動物の左側へと移動させます。胃をクランプで固定し、小網を剥離します。次に、肝臓の下葉または顎葉が可動的になるまで剥離し、バックハウスクランプを用いて十二指腸を保持しながら、葉を腔内に戻します。十二指腸を左側に移動させて肝十二指腸靭帯を露出させ、総胆管を囲みます。その後、脂肪組織および膵組織から胆管を剥離し、胆管分岐点から1.5 centimetersのところで胆管を切断します。周囲の脂肪組織からsal静脈を剥離し、胃十二指腸静脈を露出させます。次に、胃十二指腸静脈を6-0縫合糸で2箇所結紮し、2つの結節の間で静脈を切断します。腹腔動脈幹と総肝動脈を周囲の組織から剥離し、すべての動脈枝が露出するまで処置を続けます。すべての動脈の剥離が完了した後、右腎臓と肝臓右外葉の間で下大静脈を囲み、後腹膜腔から静脈を剥離します。腹腔動脈に沿って大動脈を露出させます。次に、後腹膜の脂肪組織を剥離し、腹腔動脈の上方で大動脈を囲みます。次に、生理食塩水1 mLに溶解した1000単位のヘパリンを下大静脈に注射します。切開部を脱脂綿で覆い、ヘパリンが効果を発揮するまで1〜2分間待ちます。その後、鉗子で大動脈を囲み、大動脈と下大静脈を腎臓から遠位に向かって剥離します。門脈カニューレを留置するには、門脈遠位端に魚口状の切開を加え、鉗子で切開部を開きます。次に、門脈にカニューレを挿入し、肝臓が脱色するまで20 millilitersのリンゲル液で肝臓をフラッシュします。シルク6-0結紮糸を用いてカニューレを固定します。動脈カニューレを留置するには、大動脈のセグメントを後腹膜腔から遊離できるまで、腹腔動脈の上方で大動脈を剥離します。大動脈セグメントを縦方向に切断して大動脈パッチを作成し、自作のカニューレを静的ホルダーに挿入します。次に、2本のピンセットを使用して大動脈パッチをカニューレに被せ、シルク6-0縫合糸を用いて肝動脈をカニューレ上で結紮します。脱細胞化を行うためにパッチを接合部に固定します。門脈カニューレの3方活栓を対応するリアクターアクセスに接続し、システム内に空気が入らないように注意しながら、動脈カニューレを動脈アクセスに接続します。次に、レスピレーターを圧力分配チャンバーに接続し、チャンバーをリアクターに接続します。加圧を開始します。その後、脱細胞化を開始します。1% Triton X 100を用いて、毎分5 mLの速度で肝臓を灌流します。灌流装置の流出路から廃液を排出させ、灌流チャンバー内の液面を一定に保ち、灌流中の肝臓が完全に浸るようにします。90分後、洗剤を1% SDSに変更します。門脈経由で灌流した肝臓は、均一な透明化を示し、脱細胞化が進みますが、プロセス中およびプロセス後に肉眼で確認できる残存細胞が見られます。一方、肝動脈経由で灌流した肝臓は、より均一な脱細胞化過程を示し、残存細胞がより少なくなります。振動圧条件下で灌流を行った場合、残存細胞は見られませんでした。これは灌流方法に関わらず同様でした。脱細胞化肝マトリックスの組織学的評価においても、特に肝動脈経由で灌流した肝臓において、肉眼的所見を裏付ける結果が得られました。振動圧条件下で灌流させたかどうかにかかわらず、残存細胞は観察されませんでした。しかし、門脈経由で灌流させた肝臓では、振動圧条件下で灌流させた場合であっても、残存細胞の領域が認められました。ただし、これらの条件下では、肝臓内の残存細胞量は減少しました。なお、脱細胞化条件に関わらず、肝臓の細胞外マトリックスは保存されていたことに留意してください。肝マトリックスの乾燥重量あたりのDNA量についても、天然の肝臓と比較して、すべての実験群で減少しました。ただし、統計的な有意差が認められたのは、振動圧条件下で灌流させた群のみでした。さらに、脱細胞化肝マトリックスの腐食鋳造により、灌流プロセス中における肝臓の微細解剖学的構造が保持されていることが確認されました。このビデオを視聴することで、再現性のある均一な脱細胞化を実現するための、赤色の肝臓の採取、カニューレ挿入、および灌流の方法を十分に理解できるはずです。Triton X 100およびSDSの使用は非常に危険である可能性があるため、本手順を行う際は手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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ラットポータル線維芽細胞の分離により、<em&gt;その場</em&gt;肝灌流

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ラット肝細胞の単離及び初代培養

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Subnormothermicのテクニック<em&gt;生体外</em&gt;肝臓ストレージ、評価のための灌流、およびマージナル肝移植片の修復

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Ex Vivo常温肝灌流の小さな動物モデル

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多パラメータ灌流制御による原発性ラット肝細胞の単離

プロトコルは、カスタマイズされた灌流バイオリアクター内のフラップ血管系を介したドデシル硫酸ナトリウム界面活性剤の灌流による血管化ブタフラップの外科的調達とその後の脱細胞化について説明しています。...

カスタマイズされた灌流バイオリアクターにおけるブタ血管化フラップの調達と灌流-脱細胞化

複合ラット後肢の手術手技と脱細胞化プロセスについて説明します。脱細胞化は、 ex vivo マシン灌流システムを介して低濃度ドデシル硫酸ナトリウムを使用して行われます。...

血管化複合同種移植のための 生体外 灌流ベースのバイオリアクターを用いたラット後肢の調達と脱細胞化

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このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

学ぶ 振動圧力潅流装置を用いたラット肝臓の脱細胞化手法。動脈潅流により均一かつ迅速な脱細胞化を実現し、組織工学や再生医療におけるスキャフォールド作成に応用可能です。

振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

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