ツールとしての迷走神経刺激は、絶滅の学習のための関連経路の可塑性を誘導するために

本手順の全体的な目的は、迷走神経を刺激することで条件付けられた恐怖の消去を促進することです。まず、迷走神経に電流を供給するための電極を作製します。次に、これらの電極を迷走神経の中頸部付近に植え込み、回復期間を経てヘッドキャップを装着します。その後、動物に聴覚恐怖条件付けを行い、迷走神経刺激または擬似刺激を伴う消去訓練を実施します。

最終ステップは、条件付け恐怖の発現をテストし、条件付けによるすくみ反応の減少を評価することです。最終的に、迷走神経刺激は消去ネットワークに可塑性を誘導することで、消去学習を促進するために用いられます。全身投与などの既存の手法と比較したこの技術の主な利点は、治療のタイミングを精密に制御できることであり、これにより、進行中の行動と対にしたネットワーク特異的な神経伝達物質の放出を達成することが可能です。

この手法は、感情的な学習と記憶の分野における重要な疑問、特にエピネフリンやグルココルチコイドなどのストレスホルモンの放出が長期記憶の固定にどのように影響するかを解明するのに役立ちます。この技術の応用範囲は、不安症やトラウマ関連疾患の治療に用いられる曝露療法や、依存症からのリハビリテーションにまで及びます。さらに、迷走神経刺激は、脳卒中や外傷性脳損傷後の運動学習など、シナプス可塑性における他の学習モデルにも適用可能です。

準備として、針を用いて穿孔ツールを作成し、マイクロレナインチューブを4 cm、ドリルベッドにスリップさせます。次に、針ドリルを使用して、2 mm間隔で正方形の四隅となるように4つの穴を開けます。穴の縁にバリがなく、きれいに開いている必要があります。

次に、穴の間でチューブを縦方向に切断します。次に、縫合糸を使用して、カフを迷走神経の両側に固定するためのリギングを作成します。チューブと糸が三角形になるように、プラスチックから約2cm離れたところで縫合糸を互いに結び、各縫合糸の長さを結び目から約8cm伸ばしておきます。

次に、絶縁された7芯の白金イリジウム線を70 millimeterのセグメントに切断します。続いて、ジュエリー用トーチを用いて、電線の一端から約1centimeterの絶縁材を取り除きます。

次に、炎を用いて、露出している白金イリジウム線を溶かします。この手法を用いて、露出した7本の白金イリジウム線をまとめて1本のより強固な線にし、融合させた線分の一端とは反対側の端を溶かして球状にします。絶縁体の剥離を最小限に抑えながら、白金イリジウム線を溶かして小さな球状にしてください。

次に、ネジ山のあるプラスチック製のカフの切断端を水平面に沿ってテープで固定します。この際、ネジ山をきつく引き、カフを伸ばした状態にしてください。ピンセットを使用して、準備したワイヤーの露出端を右下の穴に通し、カフの中央まで引き寄せます。その後、ワイヤーを右上の穴に通し、カフの上にループ状に折り返します。

続けて、ワイヤーを右上の穴に再度通し、ぐいっと引っ張ってワイヤーを締め、しっかりと固定されていることを確認します。カフの溝に配置されるワイヤー部分は絶縁されておらず、一方でカフ外の下端にあるワイヤー部分は絶縁されたままであることが極めて重要です。これにより、供給される電流が迷走神経にのみ流れるようになります。次に、絶縁されていない端をカフの内側から右下の穴に通します。

ループを完成させるため、カフの左側にワイヤーを配置します。ワイヤーの端をカフに固定せず、先ほどと同様の方法で配置してください。ワイヤーの被覆のない端を金ピンにはんだ付けします。はんだを冷却した後、再度溶かして接続が確実であることを確認してください。

必要に応じてはんだを追加してください。次に、各入力部位のVNS入力部位用ヘッドキャップのコネクタを準備します。26 AWG銅線の30 mmのセグメント2本の端部の被覆を剥き、バラの金ピンの細い端を切り落としてから、以下の手順に従って各ペアの電線をピンにはんだ付けします。

電線の切りっぱなしの端を、コネクタの2つのフラックス端子にハンダ付けします。これによりコネクタが完成します。定位固定装置で動物の手術準備を整えた後、メスを用いて頭蓋骨上の皮膚を切開し、ラムダ点とブレグマ点（bgma）を露出させます。

鈍端鑷子を用いて、切開部位から耳前の左側を経て頸部左側まで皮下トンネルを作成します。この経路はカフ用となります。次に、メスを用いてアンカースクリュー用の小さな始動穴を2か所開けます。

これらの穴を正中線上に直接配置しないでください。次に、ピンセットとドライバーを使用して、ボーンスクリューを2本打ち込みます。この際、スクリューの下にアクリル樹脂を充填するためのスペースを確保してください。その後、スクリューの下およびスクリュー間の空間をアクリル樹脂で充填します。アクリル樹脂が周囲の組織に付着しないように注意し、スクリューの間には多めにアクリル樹脂を塗布してください。

次に、印の付いたワイヤーが印のないワイヤーよりも吻側に来るようにインプラントを保持します。そして、素早くインプラントをアクリル樹脂の中に配置します。金ピン、クラスプ領域、または入力部位にアクリル樹脂が付着しないように注意してください。

これを5分間乾燥させ、実体顕微鏡下での作業に備えます。下顎骨と鎖骨のちょうど中間にある左頸静脈の上に小さな切開を加えます。鈍的剥離を用いて、筋肉まで切開部位を広げます。

胸骨乳様筋、胸骨舌骨筋、および肩甲舌骨筋を露出させます。続いて、筋肉間の溝に沿って鈍的に剥離し、総頸動脈を探します。頸動脈を含む鞘の中には、迷走神経も含まれています。

ハサミを用いて鞘を慎重に切開し、迷走神経を5 mmの長さで露出させます。次に、頭部の切開部位から、リードとは反対側のカフ側面にある糸を使用して、カフを皮下トンネル経由で頸部の切開部位まで引き出します。ガラス製器具で神経をそっと持ち上げ、カフの糸を神経の下に押し込みます。

神経を擦らないように注意してください。カフの上側を動物の背側に向けてください。次に、神経をカフの中央に落とし、ヘッドキャップでカフを閉じます。

カフに接続されたピンを刺激入力部位のピンに取り付け、カフが適切に配置されていることを確認します。無呼吸を誘導します。テスト呼吸が一時的に停止し、心拍数も低下することを確認してください。

カフの位置を確認した後、アクリルを用いてピンを刺激入力部位に固定します。次に、手術部位を縫合し、動物にMarcaineおよび外用抗生物質を投与します。その後、個別に飼育し、5日間動物を回復させます。

テストを実施する前に、ビデオカメラによる監視下でオペラント条件付け装置を設置します。行動訓練の初日に、トーンを30秒間5回提示し、トーンに対する先天的な恐怖がないことを確認します。最初のトーン提示後、1日目と2日目にラットに恐怖条件付けを行います。

32分の1拍の音とともに、ランダムなタイミングで1秒間、0.5 mAの足電撃を与えます。音の提示間隔を3～5分として、1日あたり8回の音と電撃のペア提示を行います。3日目に、音と電撃の連合強度のテストを実施します。

トーンを単独で4回提示し、提示間隔は3〜5分とする。4日目と5日目に動物のフリージング行動を記録する。迷走神経刺激またはシャム刺激を用いて消去訓練を行う。

ラットを刺激装置に接続し、オペラント条件付け装置に配置します。150ミリ秒。各トーンの前に、迷走神経を30秒間刺激します。

3〜5分の間隔を空けて、刺激音のペアリングを4回行います。記載されたプロトコルに従い、オシロスコープを用いてVNSカフおよび入力部位の電気的な整合性を定期的に確認してください。ラットに対し、消去中の迷走神経刺激を伴う聴覚恐怖条件付けタスクのトレーニングを行いました。

消去相において条件刺激への非強化曝露回数が限定的であった動物では、条件恐怖の軽減は見られませんでした。対照的に、BNS投与ラットでは、延長消去訓練を受けた擬似投与動物に見られるのと同様に、フリージングの著しい減少が認められました。また、BNS投与動物では条件刺激の提示外においてもフリージング行動の減少が見られたことから、彼らの消去訓練がコンテキストに般化したことが示唆されました。

さらなる調査により、VNSと消去訓練を組み合わせることで、前頭前皮質辺縁下皮質（infralimbic cortex）と扁桃体基底外側核（basal lateral amygdala）の間の経路におけるメタ可塑性が変化することが示されました。条件づけの消去が不十分な麻酔下のシャム刺激動物において、前頭前皮質辺縁下皮質のバースト刺激を行うと、扁桃体基底外側核において誘発局所フィールド電位の長期抑圧（LTD）が誘導されました。

このシナプス抑制は、条件付け恐怖反応の顕著な消去を示した動物において消失しました。さらに、単一回の消去セッション中にVNSを投与することで、長期増強の誘導が促進されました。このビデオを視聴することで、行動訓練と併せてVNSを使用する方法について深く理解することができます。

VNSコンポーネントの作製と手術に習熟すれば、適切に行った場合に約3時間で完了できます。この手順を行う際は、電気的接続を確実に維持することが重要です。