Name: ポリマー/フラーレンナノ粒子の光増感を実施ブレンドと光線力学療法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 学ぶポリマー/フラーレンナノ粒子の製造法と光線力学療法への応用。沈殿法で作られた導電性ポリマーナノ粒子を用い、がん細胞での活性酸素種生成と治療効果を評価する革新的ながん治療アプローチです。

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著者は、この研究に対する財政的支援に対して、全米科学財団(NSF)がCAREER賞(CBET-0746210)および賞CBET-1159500を通じて感謝しています。細胞培養にご協力いただいたTurkson先生(ハワイ大学がんセンター)とAltomare先生(Univ. of Central Florida College of Medicine)に感謝いたします。

1.培養細胞株<ol><li>解凍TE 71（マウス胸腺上皮細胞）、MDA-MB-231（ヒト乳癌細胞）、A549（ヒト肺癌細胞）及びOVCAR3（ヒト卵巣癌細胞）未満で2分間温水に寒剤バイアルを保持することにより。 106×gで6分間のそれぞれの細胞株および遠心分離機に、10％FBSを補充した10ミリリットルDMEM培地を追加します。 </li><li>サスペンションを吸引除去し、ペレットに3ミリリットルのメディアを追加します。適切に数回ピペッティングして細胞を混ぜます。この細胞溶液をT75フラスコにおいて10％FBSを補充した7 mlのDMEM培地を温め事前に加え、37℃で95％空気/ 5％CO 2の加湿雰囲気中でフラスコを保ちます。継代0として、このフラスコにラベルを付けます。 </li><li>細胞の密集度が80％に達すると、10分間、0.05％トリプシンでそれらをインキュベートすることによって細胞を収穫。培地の等量を添加することによりトリプシンを中和します。遠心106×gで6分間、このソリューション。サスペンションを削除し、それに3ミリリットルに新鮮な培地を追加します。ミックスWELリットルと7ミリリットル培地を含む培養フラスコに少量（100μl）を転送します。インキュベーター内で培養フラスコをインキュベートします。継代1としてフラスコにラベルを付けます。 </li><li>通路11または12まで培養細胞株。 </li></ol>ナノ粒子の作製2。 <ol><li> 〜10 -6 M（調整）希釈していないMEH-PPV原液の調製<ol><li>バイアル中の分子量（平均Mn）は150,000-250,000 /モルと3 mlのテトラヒドロフラン（THF）に1mgのポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]（MEH-PPV）を追加。ホットプレート上で80℃で加熱しながら2時間混合物を攪拌します。 </li><li> 0.2μmのシリンジフィルターを使用して、新しいバイアル中の上記溶液をフィルタリングします。 「希釈されていないMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。ステップ2.1.3と2.1.4で説明したように、この溶液は濃度の微調整後のナノ粒子製剤に関与することになります。 </li><li> 3ミリリットルのTHFに希釈されていないMEH-PPVストック溶液50μlを追加。 「希釈したMEH-PPV原液」として、このソリューションにラベルを付けます。 1cmの石英キュベットに移し、UV-VIS分光法により495 nmの吸光度を測定します。 </li><li>希釈したMEH-PPV原液の吸光度が0.17以上である場合には、一度に1ミリリットルをより多くのTHFを加えることで希釈されていないMEH-PPVの原液を希釈し、495 nmで測定された吸光度がであるまで、ステップ2.1.3を繰り返し0.13から0.17の範囲です。 </li><li>以下に示すようにランベルト・ベールの法則を用いて、希釈したMEH-PPVストック溶液のモル濃度を計算します。ここでは0.15吸光度プロトコルの残りの一例として使用されている（ すなわち、観察された吸光度に基づいて、次のすべての計算を調整する）、使用MEH-PPVの吸光係数が10 7 M -1 cm -1で、使用するパスの長さがあります1センチメートル。 A =εxbxc（式1） （ε - モル吸光係数、A - 吸光度、B - 経路長、C - 溶液の濃度） 0。15 = 10 7 M -1 cm -1で×1センチXC（式2） C = 1.5×10 -8 M（式3） 次のように希釈されていないMEH-PPVストック溶液の濃度を見つけるために、この濃度を使用します。 M 1、V 1 = M 2、V 2（式4） X 3050μlの0.15×10 -7 M = M 2×50μlの（式5） M 2 = 9.15×10 -7 M（式6） これは「調整希釈していないMEH-PPV原液」の濃度です。 </li></ol></li><li>調整希釈していないMEH-PPV原液にMEH-PPVの質量を計算します<ol><li>セクション2.1.4で得られたモル濃度は10 6グラム/モルであるMEH-PPVの分子量（M w）を用いて、以下のように調整し、未希釈ストック溶液1mlにMEH-PPVの質量を算出します。 M = N / V（N - 。ノーモル、V - Lでボリューム）（式7） このように、1ml中のMEH-PPVの質量はウント調整しますiluted原液は9.15×10 -4 gです。 </li></ol></li><li> MEH-PPVでブレンドPCBM <ol><li> PCBMは、50重量％のPCBMの質量に対して定義されたMEH-PPVの溶液を、ドープされた50重量％にするためにストックMEH-PPVの溶液に添加されるフェニル-C 61 -酪酸メチルエステル（PCBM）の質量を計算しますMEH-PPVの（ すなわち、MEH-PPVの半分質量）。 2.2節で得られたMEH-PPVの重量を使用することにより。 MEH-PPV×100％= 50重量％のPCBMのPCBM / 9.15×10 -4グラムの質量（式8） PCBM = 4.57×10 -4グラムの質量（式9） </li><li>バイアル中に1mgのPCBMを計量し、500μlのTHFを加えます。 910.88グラム/モルとしてPCBMの分子量を用いて、この溶液にPCBMの濃度を算出します PCBMのモル濃度の溶液= 0.001グラム/（* 500μlの910.88グラム/モル）（式10） PCBMの溶液のモル濃度= 2.19×10 -9モル/μlの（式11） </li><li> PCBM溶液の体積を計算すると、調整に追加するために必要MEを原液PCBMは、ステップ2.3.2において算出モル濃度を用いて、THF中MEH-PPVの溶液をドープした50重量％を得るために、H-PPV原液 / 910.88 GX PCBM×1モル1μL/ 2.19×10 -9モル= 229μlの（式12）の4.57×10 -4グラム 調整希釈していないMEH-PPVストック溶液1mlにPCBM溶液を229μl加え、よく混ぜます。 </li></ol></li><li>再沈殿法によるナノ粒子の作製<ol><li>転送、それに接続された針で1mlシリンジにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1ml。 </li><li>急速1,200rpmで攪拌​​しながら脱イオン水4mlにブレンドされたMEH-PPV / PCBM溶液1mlを注入します。注射直後に攪拌を停止します。さらに処理することなく、これらのナノ粒子を使用してください。 </li></ol></li></ol>イメージングのためのナノ粒子を有する細胞株の3インキュベーション注：すべての画像化実験は、35mmのペトリ皿に完成しました。 <ol><li> nanopartiの取り込み細胞株におけるクル<ol><li> 12 継代まで培養細胞株。 35ミリメートルのペトリ皿中の12 番目の継代培養細胞で。 24時間後に細胞を40％コンフルエントとなるように35ミリメートルのペトリ皿に添加した細胞の濃度を調整します。 </li><li>この段階では、ペトリ皿から、10％FBSを補充したDMEM培地を除去回1×DPBSで細胞を洗浄し、ペトリ皿に2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加えます。 </li><li> 24時間後、ペトリ皿からDMEM /ナノ粒子懸濁物を除去し、1×DPBSで3回細胞を洗浄します。その後、10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。 </li></ol></li><li> ROSの検出<ol><li>ペトリ皿、細胞株当たり6、文化A549およびOVCAR3細胞株セクション3.1.1で説明したように。ラベルペトリ皿は、 表1に示します 。 </li><li> 表1に示すように、ペトリ皿の3つに2ミリリットルのDMEMにナノ粒子懸濁液100μlを加え、24時間インキュベートします。 、光用量を投与された24時間後に細胞を洗浄し、HBSSで細胞を懸濁しますペトリ皿（ハンクス液）のための無料メディアを染めます。 </li><li> 15分間のソーラーシミュレータのランプをウォームアップ。 UV光をフィルタリングするために、ランプの前にUVフィルターを置きます。ペトリ皿の表面で0.5日（50ミリワット/ cm 2）での強度を得るためにランプ電力を調整することにより、基準太陽電池を有するランプを較正します。この特定の設定では、その状態は、ランプに供給される218 Wの電力で達成されました。 </li><li>以下の計算に示すように、180 J / cm 2の光投与量になる60分のためにランプ（蓋オープン）の下でペトリ皿を置きます： 50 mWの/ cmで2×3600秒/千= 180 J / cm 2の</li><li> HBSSを取り外し、洗浄することなく、さらにペトリ皿に、10％FBSを補充した2ミリリットルDMEM培地を追加します。別の2時間細胞をインキュベートします。 </li><li>陽性対照のために30分間、100μMの過酸化水素（H 2 O 2）で細胞をインキュベートします。 </li><li> 37℃で30分間の色素で細胞を培養することによって、ROS検出試薬の最終濃度5μMですべてのペトリ皿で​​細胞を染色。 </li><li> 10分間、4％パラホルムアルデヒドを用いてインキュベートすることによって細胞を固定します。 DPBSで二回洗浄します。 2分間の色素とインキュベートすることにより、300 nMのDAPIで細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。 </li></ol></li><li> PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死<ol><li> 5ペトリ皿で​​培養それぞれの細胞株。残りの2ペトリ皿は対照試料となりながら、これらのペトリ皿のうち3つは実験のためになります。 Eなどのナノ粒子を用いた実験のために3ペトリ皿をインキュベートセクション3.1.2でxplained。対照サンプルは、ナノ粒子とともにインキュベートしていません。 </li><li> 24時間インキュベートした後ステップ3.2.3に従ってください。 </li><li>ランプ（蓋オープン）の下で3実験ペトリ皿を置き、20分、40分で1分および60分で1で1を削除します。これは、60、120及び180の光用量J / cm 2であり、それぞれ（セクション3.2.4で計算）に曝露された三つの試料が得られます。次に、制御ペトリ皿の一つに180 J / cm 2の光投与量を管理します。これは、ナノ粒子が存在しない場合に適用される光線量とコントロールです。残りのコントロールサンプル（無ナノ粒子及び適用されていない光線量）に光線量を適用しないでください。 </li><li> 10％FBSを補充したDMEM培地でHBSSを交換し、4時間インキュベーターでペトリ皿を保ちます。 </li><li> 15分間の色素で細胞をインキュベートすることにより実験的およびアネキシンV FITC20μlのと対照ペトリ皿で​​細胞を染色。 DPBSで二回洗浄します。 Cを染色2分間の色素を用いてインキュベートすることにより300 nmのDAPIと同様に300 nmのPI（ヨウ化プロピジウム）でells。 DPBSで二回洗浄します。そして、撮像のためにDPBSで細胞を維持します。 </li></ol></li></ol>ナノ粒子の4固有細胞毒性<ol><li> 96ウェルプレート中の細胞培養を数えます<ol><li>培地を除去し、10分間、0.05％トリプシンで細胞をインキュベートしたDPBSで細胞を2回洗浄することにより培養フラスコから細胞を収穫します。得られた細胞溶液に、10％FBSを補充した2 mlのDMEM培地を加えます。一重に細胞クラスターを分離するために、適切に解決策を混ぜます。 </li><li> 100μlの細胞懸濁液を取り、10％FBSを補充した900μlのDMEM培地に加えます。よく混ぜます。血球計数器上にこの懸濁液10μlを置きます。血球計数器を用いて細胞をカウントし4.1.1 4×10 5細胞/ mlで細胞懸濁液の濃度を調整します。 </li><li> 0時間とラベル5 96ウェルプレートを取り、24時間R、48時間、72時間および96時間。 表2に示すようなウェル/ 2,500細胞を播種、ウェルに5×10 4細胞 / mlの細胞液（TE 71およびA549）の50μLを追加します。 OVCAR3およびMDA-MB-231細胞株について、同じ手順を実行します。 </li><li> 24時間後、1×DPBSでウェルを洗浄し、 表2に示すようにウェル中にナノ粒子の濃度の増加の50μLを加える。へ2.4.2からDMEMに20、100、及びナノ粒子懸濁液180μLを添加することにより、種々のナノ粒子の濃度を準備それぞれ0.4×10 -4 mg / mlで、2.0×10 -4 mg / mlで、3.6×10 -4 mg / mlの、ナノ粒子の濃度を生じる2 mlの最終容積を得ます。各細胞株は、ナノ粒子の各濃度について三つ組を有します。 </li></ol></li><li>暗所での細胞生存率を測定します<ol><li>すぐにナノ粒子を添加した後、0時間プレートに10μlのMTTを追加します。ホルマザンcryst 4時間プレートをインキュベートALSを形成します。ウェルに50μlの可溶化溶液を追加します。ホルマザン結晶を溶解するために6時間プレートをインキュベートします。 </li><li>マイクロプレートリーダーで570 nmの吸光度を記録することによって、0時間プレートの細胞生存率を測定します。 </li><li> 24時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子を各ウェル後24時間のインキュベーションに50μlのメディアを追加。 4.2.1と4.2.2で説明したように、MTTを加え、プレートをお読みください。 </li><li> 48時間、72時間、および96時間のプレートの場合、1×DPBSで細胞を洗浄し、ナノ粒子と24時間のインキュベーション後にウェルに50μlのメディアを追加。残りの期間のために細胞をインキュベートします。 </li><li> 4.2.5 4.2.1と4.2.2で説明したように）特定の時点での細胞生存率を測定します。 </li><li> （n = 3）で3回完全な実験を繰り返します</li></ol></li></ol> 5. PDT後細胞生存率を測定<ol><li>細胞を計数し、96ウェルプレートで培養します。 <ol><li> 9のセットにラベルを付けますTE 71 + A549プレート及びOVCAR3 + MDA-MB-231プレートの両方について、表3に示すように、6ウェルプレート、。 4.1.3に示すように、プレートのレイアウトは同じです。 </li><li>セクション4.1.2 の表2に示したのと同様のレイアウトでセクション4.1で説明したように96ウェルプレートをシード。 </li><li> 4.1.4で説明したように24時間後にプレートにナノ粒子を追加します。 </li><li>ナノ粒子を添加した後の24時間は、1×DPBSで細胞を洗浄し、各ウェルに50μlのHBSSを追加します。 </li><li> 3.2.3で説明したようにそれぞれの光用量でプレートを照射します。 </li><li> 10％FBSを補充した50μlのDMEM培地でHBSSを交換し、PDT後の各期間のプレートをインキュベート。 </li><li> 4.2.1及び4.2.2で説明したように各時間期間の後、細胞生存率を測定します。 </li></ol></li></ol> 6.蛍光顕微鏡<ol><li>ナノ粒子の取り込み<ol><li>顕微鏡Aのランプをオンにしますイメージングの前にNDレーザ30分。顕微鏡のステージ上で（セクション3.1で説明したように）固定された細胞を含むペトリ皿を置きます。 </li><li> 表4に示すように、フィルタを使用して、ナノ粒子およびDAPIからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子及びDAPI画像をオーバーレイ。 </li></ol></li><li> ROSの検出<ol><li> 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。顕微鏡のステージ上で（セクション3.2で説明したように）細胞を含むペトリ皿を置きます。 </li><li> 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、およびROS検出試薬からの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで試薬画像を検出位相差、ナノ粒子、DAPIおよびROSオーバーレイ。 </li></ol></li><li> PIおよびアネキシンV FITCによるアポトーシスおよび壊死<ol><li> 30分前に、イメージング顕微鏡のランプをオンにします。で説明したように細胞を含むペトリ皿（置きます顕微鏡のステージ上のセクション3.3）。 </li><li> 表4に示すようにフィルタを使用することにより、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITCからの蛍光を集める。ImageJソフトウェアで位相コントラスト、ナノ粒子、DAPI、PIおよびアネキシンV FITC画像をオーバーレイ。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

ナノ粒子を製造しながら、ナノ粒子の取り込みを達成するために、それはいくつかの重要な措置を維持するために必要でした。それは、この溶液の濃度は、形成されるナノ粒子のサイズを決定する上で重要な役割を果たしていることが観察されたように、THF中（50重量％のPCBMとブレンド）10 -6 M MEH-PPV溶液を、DI水に注入するように調製しました。濃度は、UV-VIS分光法により確認しました。プロトコルのステップでは、このソリューションが1よりもはるかに大きい吸光度注入の速度を有しているので、最初に第1のUV-Visスペクトルをとる前にMEH-PPV溶液（希釈していないMEH-PPV原液）を用意し希釈する必要があった2.1.3ことに注意してくださいまた、ナノ粒子のサイズを決定する際に重要な役割を果たし、激しくDI水を攪拌しながら、可能な限り速くなければなりません。ゆっくり注入は、大きなナノ粒子になります。また、撹拌をさらに凝集を回避するために、注射直後に停止する必要があります。注入しながら溶液を水では、ナノ粒子の大きさに影響を与える気泡形成を避けるために、溶液中に完全に針を挿入しながら、バイアルの内面の近くに針を維持する...

光線力学療法（PDT）は、光増感剤は、光増感剤は、活性酸素種（ROS）を生成する光に標的組織に投与し、露光時にされています。そのような一重項酸素及びスーパーオキシドなどのROS種は、酸化ストレス、細胞および組織1-4に続く構造的損傷を誘発することができます。これにより、アプリケーションが容易にこの方法が盛んに研究されており、臨床試験が行わ5,6をとっています 。しかし、そのような（縮小生物学的利用能および潜在的な急性毒性につながる）増感剤の暗い増感剤の毒性、光（による増感剤の非選択的分布に）患者の感受性、および疎水性のような重要な問題が残っています。 ここでは、製造およびPDTの次世代光増感としてフラーレンを配合したポリマーナノ粒子を行うインビトロ評価のための方法を報告しています。ナノ粒子の自己凝集によって形成されます半導体ポリマーMEH-PPV（ポリ[2-メトキシ-5-（2-エチルヘキシルオキシ）-1,4-フェニレンビニレン]）、これらの材料は、互換性の中に溶解させたフラーレンPCBM（フェニルC 61 -酪酸メチルエステル）と溶媒を急速に非相溶性溶媒（ 図1A）に注入されます。ホストポリマーとしてMEH-PPVの選択は、三重形成率の高さにつながる、高い吸光係数によって動機づけ、およびフラーレンPCBM 7への効率的かつ超高速充電およびエネルギー転送の両方されています。これらのプロパティは、PDT内の一重項酸素とスーパーオキシド形成の感作のために理想的です。 フラーレンは、実際には両方の分子とナノ粒子の形態8-13に 、PDTに適用されています。しかし、重度の細胞毒性がさらなる発展を妨げている12。ここでは、MEH-PPVのホストマトリックス中にフラーレンをカプセル化すると、その私PDTの増感材料に複合MEH-PPV / PCBMのナノ粒子の結果を得るためにすることを示します本質的に細胞傷害性ではないよ、ナノ粒子サイズおよび表面電荷、および前述の光物理的特性に起因する低光用量で利回りの高い効果的なPDT治療による癌細胞に対する特異性を示します。

<table><tbody><tr><td>ポリ[2-メトキシ-5-(2-エチルヘキシロキシ)-1,4-フェニレンジニレンジ](MEH-PPV)</td><td>シグマエイドリッチ</td><td>536512-1G</td><td>平均Mn&nbsp;150,000-250,000</td></tr><tr><td>[6,6]-フェニルC61&nbsp;酪酸メチルエステル(PCBM)</td><td>シグマAidrich</td><td>684449-500MG</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン(THF)</td><td>EMD</td><td>TX0284-6</td><td>Drisolv</td></tr><tr><td>1 mlシリンジ国立</td><td>科学会社</td><td>37510-1</td><td>MEH-PPV溶液</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィルターVWR</td><td>28145-495</td><td>25 mm、0.2 &microのろ過用;m、PTFE</td></tr><tr><td>1 mlシリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td>81320</td><td>MEH-PPV溶液を水に注入してナノ粒子を作るため</td></tr><tr><td>ダルベッコのイーグルスミディアム/ハムのF-12 50/50ミックスの改良型(DMEM)</td><td>コーニング(VWR)</td><td>45000-350</td><td></td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液(フェノールレッドなし)(HBSS)</td><td>品質生物学的(VWR)</td><td>10128-740</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、カルシウムとマグネシウムを含まない1倍(DPBS)</td><td>コーニング(VWR)</td><td>45000-436</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清、レギュラー(熱不活性化)(FBS)</td><td>コーニング(VWR)</td><td>45000-736</td><td></td></tr><tr><td>トリプシンEDTA 1x 0.25%</td><td>コーニング(VWR)</td><td>45000-664</td>トリ<td>プシン/ 2.21 mM EDTA、重炭酸ナトリウム、カルシウム、マグネシウムブタパルボウイルスを含まないHBSSで16</td></tr><tr><td>%パラホルムアルデヒドを試験しました</td><td>電子顕微鏡科学&nbsp;</td><td>15710</td><td>16%パラホルムアルデヒドは、PBS DAPIを添加して4%に希釈されます</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp;ビオチウム VWR</td><td>89139-054</td><td>核染色</td></tr><tr><td>5 ml ピペット</td><td>VWR</td><td>82050-478</td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 培養フラスコ</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td>細胞培養</td></tr>用 <tr><td>96 ウェルプレート</td><td>VWR</td><td>82050-771</td><td>MTT アッセイ用</td></tr><tr><td>ベント付き組織培養皿</td><td>グライナー バイオワン (VWR)</td> <td>82050-538</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>分子プローブ</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>アネキシン V FITC</td> ア<td>ポトーシス用</td><td>Invitrogen</td><td>A13199</td> 色素</tr><tr><td>Celltiter 96 non-R 1000 アッセイ</td><td>プロメガ (VWR)</td><td><a href="https://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?catalog_number=PAG4000">PAG4000</a></td><td>MTT</td></tr><tr><td>CellROX グリーン試薬、酸化ストレス検出用</td><td>Invitrogen</td><td>C10444</td><td>ROS用検出</td></tr><tr><td>紫外可視分光器</td><td>Agilent 8453</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光器</td><td>NanoLog HoribaJobin Yvon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>動的光散乱</td><td>PD2000DLS、精密検出器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>NuAir DH オートフロー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss Axioskop2</td><td></td><td>63X 油浸対物レンズ</td></tr><tr><td>エピルミネッセンス顕微鏡</td><td>オリンパス IX71</td><td></td><td>60X 水浸対物レンズ、Andor Zyla sCMOSカメラ</td></tr><tr><td>ソーラーシミュレータ</td><td>ニューポート 67005 オリエルインスツルメンツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リファレンス 太陽電池</td><td>オリエル&nbsp;</td><td></td><td>VLSI規格 組み込まれている</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>BioTek Ex808</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Hausser Scientific Partnership</td><td>3200</td><td>細胞数カウント用</td></tr></tbody></table>

ポリマー/フラーレンナノ粒子の光増感を実施ブレンドと光線力学療法

Photodynamic Therapy with Blended Conducting Polymer/Fullerene Nanoparticle Photosensitizers

この記事では、フォトダイナミックセラピー(PDT)の次世代光増感剤として、フラーレンをブレンドした導電性ポリマーナノ粒子の作製と再現性のあるin-vitro評価の方法が報告されています。ナノ粒子は、半導体ポリマーMEH-PPV(ポリ[2-メトキシ-5-(2-エチルヘキシロキシ)-1,4-フェニレンジビニレン])とフラーレンPCBM(フェニル-C61-酪酸メチルエステル)との非適合溶媒の存在下での疎水性相互作用によって形成されます。MEH-PPVは、高い吸光係数を備えているため、トリプレット形成率が高く、フラーレンPCBMへの電荷とエネルギーの効率的な移動につながります。後者のプロセスは、フラーレン支援トリプレットおよびラジカル形成、およびMEH-PPVの超高速不活性化を通じてPDTシステムの効率を向上させます。今回報告した結果は、このナノ粒子PDT感作系が非常に効果的であり、がん細胞株に対して予想外の特異性を示すことを示しています。

取り込みおよびナノ粒子の本質的な細胞傷害性 50重量％ブレンドMEH-PPV / PCBMのナノ粒子は、TE 71、MDA-MB-231、A549及びOVCAR3細胞株と共にインキュベートしました。 PCBMブレンドレベルは、共役ポリマーとフラーレン14の間の理想的な電荷およびエネルギー伝達特性を与えることが示されている50重量％のPCBMとして選ば ​​れました。ナノ粒子の取り込みの蛍光画像は、 図1Bに示されています。細胞は、ナノ粒子の取り込みを確実にするために、ナノ粒子と24時間インキュベートしました。次いで、細胞を画像化する前に、4％パラホルムアルデヒドで固定し、細胞および核の位置を検出するためにDAPIで染色しました。画像十分に分離された細胞のために40％の集密度を維持しました。対応する位相コントラスト画像と蛍光画像をA549及びOVCAR3癌細胞株によるナノ粒子の優先的な取り込みがあることを示しています。検出可能な蛍光は、TE 71の制御に見ることができませんそしてMDA-MB-231癌細胞株、制限された取り込みを...

このプロトコルは、フラーレンとブレンドされた導電性ポリマーナノ粒子の製造方法を説明しています。これらのナノ粒子は、光線力学療法(PDT)の次世代光増感剤としての可能性について調査されました。

In this article a method for the fabrication and reproducible in-vitro evaluation of conducting polymer nanoparticles blended with fullerene as the next ...

本実験の総合的な目的は、がん治療における光力学的療法（PDT）に応用するための次世代光増感剤を開発することです。これは、水分散性の導電性高分子ナノ粒子を作製するために、沈殿法による製造方法を適応させることで達成されます。第二のステップとして、これらのナノ粒子をin vitroでがん細胞とインキュベートし、続いて光照射を行うことで、PDTに寄与する活性ラジカルである活性酸素種（ROS）を生成させます。次に、定量アッセイと定性的なイメージングを用いて治療効果を評価し、細胞集団における生存細胞とTED（治療効果による死滅）細胞の割合を決定します。その結果、ここではOAR threeでモデル化した卵巣がんなどの悪性がん細胞は、本研究で報告したナノ粒子光増感剤を豊富に取り込み、in vitroにおいてPDT治療が非常に有効であることが示されました。この場合、PDTの有効性は、各細胞株に取り込まれたナノ粒子の量と直接的に相関しています。化学療法、放射線療法、手術などの既存の方法に対する本手法の主な利点は、治療を疾患部位に特異的に標的化でき、副作用を軽減できることです。使用した活性物質はin vitroで細胞毒性を示さず、さらなる開発によって、ナノ材料システムをtDCS部位に対してより特異的なものにすることが可能です。テキストプロトコルに記載されている通り、細胞株の培養およびM-E-H-P-P-Vストック溶液の調製から本手順を開始してください。希釈していないM-E-H-P-P-Vストック溶液50 µLを、3 mLのTETRAHEDRANまたはTHFに加えてください。この溶液に「希釈済みM-E-H-P-P-Vストック溶液」とラベルを貼り、1 cmの石英キュベットに転移させ、紫外可視分光光度計を用いて495 nmにおける吸光度を測定します。希釈済みM-E-H-P-P-Vストック溶液の吸光度が0.17より高い場合は、未希釈のM-E-H-P-P-Vストック溶液にTHFを1 mLずつ追加して希釈し、495 nmでの吸光度が0.13から0.17の範囲になるまで調整します。次に、混合M-E-H-P-P-V-P-C-B-M溶液1 mLを、針を装着した1 mLシリンジに迅速に転移させ、沈殿法によりナノ粒子を調製します。混合したM-E-H-P-P-V-P-C-V-M溶液1 mLを、1200 RPMで撹拌している脱イオン水4 mLに注入し、注入直後に撹拌を停止させます。これらのナノ粒子をさらに処理することなく、ナノ粒子と共にインキュベートした細胞に対してPDTを実施します。まず、テキストプロトコルに従って96ウェルプレートにラベルを貼ります。培地を除去し、細胞をDPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で2回洗浄して、培養フラスコから細胞を回収します。次に、0.05% tryinを用いて細胞を10分間処理し、得られた細胞溶液に10%胎児牛血清（FBS）を添加したDMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）2 mLを加えます。溶液を適切に混合し、細胞塊を単一細胞に分散させます。細胞懸濁液100 µLを分取し、10% FBS添加DMEM 900 µLに加えて十分に混合した後、この懸濁液10 µLを血球計数計に滴下します。ヘモサイトメーターを用いて細胞数を計測し、細胞懸濁液の濃度を1mLあたり50,000個に調整します。次に、細胞溶液を50µLずつウェルに分注して96ウェルプレートに播種し、1ウェルあたり2,500個の細胞を播種します。続いて、調製したナノ粒子懸濁液をDMEMに2100µLおよび180µLずつ加え、最終容量を2mLとして、異なる濃度のナノ粒子溶液を調製します。24時間後、ウェルを1回 X-D-P-B-S で洗浄し、濃度を段階的に高めたナノ粒子を50 microlitersずつ各ウェルに添加します。各細胞株について、ナノ粒子の各濃度につき3つの繰り返し（トリプリケート）を設けます。ナノ粒子の添加から24時間後まで培養します。細胞を1x DPBSで洗浄し、各ウェルに50 µLのハンクス平衡塩溶液（HBSS）を加えます。細胞に照射するため、ソーラーシミュレーターのランプを15分間予熱します。ランプの前方にUVフィルターを設置し、紫外線を除去します。リファレンス用太陽電池を用いてランプを校正し、96ウェルプレートの表面で0.5 sunの強度が得られるようにランプ出力を調整します。この条件は、ランプに218 Wの電力を供給することで達成されました。蓋を開けた状態で96ウェルプレートをランプの下に配置し、細胞を60分間照射します。これにより、照射後の光量密度は180 J/cm²となります。HBSSを10% FBSを添加したDMEM 50 µLに交換し、光力学療法後のそれぞれの時間分、プレートをインキュベートします。各時間経過後、10 µLのMTTをウェルに添加して細胞生存率を測定します。結晶が形成されるまで、プレートを4時間インキュベートします。その後、50 µLの溶解液をウェルに添加し、プレートを6時間インキュベートします。結晶を溶解させます。マイクロプレートリーダーを用いて570ナノメートルの吸光度を測定し、ナノ粒子の固有の細胞毒性を評価するために細胞生存率を測定します。ナノ粒子の取り込み量を測定するため、PDTを適用せずに96ウェルプレートを読み取ります。PDT後に生成されたROSの検出およびPDT後のアポトーシス・壊死の検出。まず、イメージングの30分前に、顕微鏡のランプとレーザーを点灯させます。固定した細胞を含むペトリ皿を顕微鏡のステージ上に置きます。ナノ粒子からの蛍光を回収します。RROS検出試薬にはプロピジウムヨードを使用します。Image Jを用いて、位相差画像と蛍光画像にXIN five fitsiおよびDPIをオーバーレイさせます。異なる細胞株とナノ粒子をインキュベートした後の代表的な解析結果をここに示します。Ocar three細胞株が最も高い取り込みを示し、次いで5 49およびMDA MB 2 31の順となりました。TE 71ではナノ粒子の蛍光は認められませんでした。これらの細胞株を暗所で保持した際の細胞生存率の測定結果を、こちらの棒グラフに示します。いずれの細胞株においても、96時間まで細胞死はほとんど認められませんでした。ROS検出試薬によって検出されたROSの生成を、3つの細胞株についてここに示します。これが対照サンプルです。ナノ粒子および光照射の両方がないため、緑色蛍光は認められません。しかし、PDT直後に細胞にナノ粒子と光照射の両方を投与すると、R os検出試薬による明るい緑色蛍光が観察されます。DT後の細胞生存率を、さまざまなナノ粒子投与量における棒グラフでここに示します。生細胞・死細胞二重染色の実験結果をここに示します。高光量照射ではCAR3細胞株が壊死を起こすのに対し、低光量照射では細胞がアポトーシスによる死に至ることが分かります。このビデオを視聴することで、光力学療法に基づく疾患治療に適用するための複合導電性高分子ナノ粒子の作製方法について、十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

光線力学療法(PDT)は、肺がん治療のための非侵襲的かつ非外科的な方法です。光増感剤は腫瘍組織に選択的に蓄積し、酸素と適切な波長の光の存在下で腫瘍細胞死を引き起こします。このプロトコルビデオでは、PDTベースの方法を使用して、肺がん細胞の潜在的な光増感剤の光毒性の可能性を評価します。...

In vitro光毒性アッセイ:肺がん細胞における光増感剤の光毒性の可能性を評価するためのPDTベースの方法

有機色素分子とオレイン酸でコーティングされたアップコンバーティングナノ粒子は水溶性ではありません。このプロトコルは、有機色素分子の移動と、粒子を最初の疎水性溶媒から水へのアップコンバートを可能にする「プラグアンドプレイ」方法を説明しています。...

「プラグアンドプレイ」両親媒性ポリマー、有機染料及びアップコンバーティングナノ粒子を含む水分散性Nanoassembliesを作成する方法を

有機半導体ポリマーの使用に基づく、可視光によるin-vitro細胞培養の電気的活動の刺激方法が説明されています。...

生細胞共役ポリマーにより電気的活動の光制御

電気活性ポリマーからなるナノ粒子の合成と調製のためのプロトコールが提示されます。...

電気活性ポリマーナノ粒子出展光熱プロパティ

光線力学療法(PDT)は、肺がん治療の代替選択肢です。PDTの治療効果を高めるために、化学療法と組み合わせた肺がん標的ナノ粒子が開発されました。調製されたナノ粒子を用いたPDTのin vitroおよびin...

肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

光線力学療法 (PDT) は、ジベレリン光増感剤 (PS) 目に見える光した後アポトーシス誘導へのインキュベーションを含む医療処置です。PS 培養と光治療パラメーターの差異を検討するために使用可能性があります PDT をシミュレートするように設計の in vitro PDT...

体外光線力学的治療へのアプローチ

薬剤耐性カン ジダ・アルビカンス の発生率の増加は、世界中で深刻な健康問題です。抗菌光線力学療法(aPDT)は、薬剤耐性真菌感染症と戦うための戦略を提供するかもしれない。本プロトコールは、多剤耐性 C.アルビカン ス株に対するローズベンガル媒介性aPDT有効性を インビトロで記載する。...

カンジダ・アルビカンスを阻害するローズベンガル媒介光線力学療法

ここでは、2次元HeLa細胞培養と光増感剤としての椎体を使用する in vitro...

2D細胞培養モデルにおけるベルテポルフィン細胞毒性を高めるための自作発光ダイオードベースの光線力学治療装置

このプロトコルは、光応答性プロドラッグ色素ナノアセンブリの作製および特性評価を記載する。光照射セットアップを含む、光トリガー分解によるナノ粒子からの薬物放出の方法論が明示的に説明されています。光照射後にナノ粒子から放出された薬物は、ヒト結腸直腸腫瘍細胞に対して優れた抗増殖効果を示した。...

プロドラッグ色素ナノアセンブリの容易な調製と光活性化

この記事では、プラズモン光熱療法の光学特性を再現する腫瘍組織ファントムを調製するためのプロトコルを紹介します。ファントムの調製、光熱評価、および治療パラメータを評価するための光熱温度測定に基づく開発された数値モデルの検証について詳しく説明し、予備試験のための in vivo...

プラズモニック光熱がん治療:光熱温度分布を可視化するためのナノ粒子包埋腫瘍組織模倣ファントム

学ぶポリマー/フラーレンナノ粒子の製造法と光線力学療法への応用。沈殿法で作られた導電性ポリマーナノ粒子を用い、がん細胞での活性酸素種生成と治療効果を評価する革新的ながん治療アプローチです。

ポリマー/フラーレンナノ粒子の光増感を実施ブレンドと光線力学療法

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