TiOを使用して水性環境中のタンパク質や細胞を光パターニング

本実験の全体的な目的は、二酸化チタンの光触媒活性を利用して、細胞培養スキャフォールドの表面修飾を行うことです。まず、ガラスカバースリップ上に二酸化チタンの薄層を堆積させ、次いでオクタデシルシランでコーティングすることで、表面全体を疎水化します。第二のステップとして、血清アルブミンを含む細胞培養培地に浸漬し、基板をブロッキングします。

アルブミンが表面に吸着し、細胞接着が起こらない状態になります。次に、サンプルをコラーゲンを含む水溶液に移し、集光したUV光を用いて表面に照射します。これにより、コラーゲン分子が光照射領域に選択的に吸着し、その領域が細胞接着可能な状態になります。

このプロセスを繰り返すことで、複数のタンパク質や細胞タイプをパターニングすることが可能です。本ビデオでは、UV照射によりPC 12細胞の接着領域を選択的に修飾する方法を示します。この手法のアイデアは、二酸化チタンの光触媒が、光照射によって表面の有機汚染物質を除去する自浄作用を持つガラス窓として商業的に応用されていることに気づいた際に得られたものであり、本手順を共同で推進する大学院生を私の研究室で募集しています。

まず、サンプルの正しい面が上を向いていることを確実にできるよう、ダイヤモンドスクライバーを用いてカバーガラスに番号を記入します。次に、カバーガラスをまず流動的な2回蒸留水で洗浄し、続いてピラニア溶液に10分間浸漬します。10分後、カバーガラスを2回蒸留水で8回すすぎ、窒素気流下で乾燥させます。

次に、酸化チタンターゲットを高周波スパッタリング装置にセットし、洗浄済みのカバーガラスをポリアミドテープでサンプルホルダーに固定します。サンプルホルダーをスパッタリング室に入れ、圧力が2.0 × 10⁻⁴ Paに達するまで室内の空気を排気します。続いて、室内にアルゴンガスを導入し、シャッターを閉じたまま堆積圧力を4.0 mTorrに設定します。RF出力を70 Wまで徐々に上昇させます。

次に、シャッターを開け、厚さ120から150 nanometersの膜を得るために15分間スパッタリングを行います。まず、ガラスビーカーとピンセットをオーブンにて120 °Cで30分間乾燥させます。次に、カバーガラスをプラズマ反応器に入れ、表面の親水性を高めるため、酸素流量100 standard cubic centimeters per minute、出力200 wattsの条件で、二酸化チタン表面を酸素プラズマで5分間処理します。

その後、サンプルを取り出して二回蒸留水に浸し、表面が超親水性であることを確認した後、窒素気流下で表面を十分に乾燥させます。次に、サンプル、乾燥させたビーカー、およびピンセットを窒素充填グローブバッグに入れ、トルエンに溶解させた1 mMのoctadecyltrichlorethane溶液を調製します。サンプルを室温で1時間この溶液に浸し、酸化チタンの上に自己組織化単分子膜を形成させます。

次に、トルエン、アセトン、エタノールでサンプルを洗浄し、フォスフォー分子を除去します。最後に、2回蒸留水で5分間ずつ洗浄します。その後、新鮮な2回蒸留水でサンプルを4回すすぎ、窒素気流下で表面を乾燥させます。

コート済みのカバーガラスを70% ethanolに5分間浸して滅菌します。次に、サンプルを滅菌済みの2回蒸留水で2回洗浄します。その後、サンプルを35 mmディッシュに入れ、PC 12成長培地を2 mL加えます。

待機している間に、培地中の血清アルブミンがカバーガラスの表面に吸着するよう、サンプルを37 °CのCO2緩衝インキュベーター内で少なくとも3時間インキュベートします。まずアークランプを点灯させて、倒立蛍光顕微鏡をセットアップします。次にUVフィルターキューブを挿入し、対物レンズを20倍のものに回転させます。

UV強度計を用いて光強度を測定し、200 joules per square centimeterの線量となる照射時間を算出します。次に、ステージマイクロメーターを使用して、視野絞りを調整し、照射領域の直径を200 micronsに設定します。3時間のインキュベーション後、カバーガラスを覆っている培地に3.0 mg/mLのType four collagenを200 µL添加します。

次に、35 mmディッシュを顕微鏡ステージに移し、スクラッチマークを用いて顕微鏡の焦点を試料表面に合わせます。カバースリップの一領域に、200 J/cm²の線量でUV光を照射します。その後、培地をNGF含有・Type IV collagen非含有の新鮮な増殖培地 2 mLに交換し、試料をインキュベーターに戻します。

NGFで分化させた培養PC 12細胞を15 mLコニカルチューブに回収し、150 ×gで4分間遠心分離します。その後、上清を吸引し、1 mLの増殖培地を加えます。ヘモサイトメーターを用いて、ピペッティングで穏やかに細胞を再懸濁します。

細胞密度を計測し、3.0 × 10⁵ 個の細胞を、修飾済みカバーガラスを入れた 35 mm ディッシュに播種します。XC2修飾表面で1〜2日間培養した後、37 °C、5% CO2 インキュベーター内でさらに1〜2日間インキュベートします。顕微鏡を用いて、細胞がカバーガラスのUV照射領域のみに接着し、増殖していることを確認します。

次に、表面パターニング用に設定した顕微鏡を用い、Ⅳ型コラーゲンを67 µL、細胞を培養したディッシュに添加し、コラーゲンの最終濃度を100 µg/mLにします。ディッシュを顕微鏡ステージに載せ、照射領域を現在の細胞位置に隣接するように配置します。カバースリップに200 J/cm²の線量でUV光を照射します。

照射後、培地をコラーゲンを含まないものに交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。なお、1つのサンプルの処理は30分以内に完了させるようにしてください。これは、スパッタ法で堆積させた二酸化チタン膜の断面走査電子顕微鏡画像です。観察の結果、膜厚は約150 nanometersと推定されました。

また、ここで注目すべき点は、堆積した二酸化チタン薄膜の平坦性である。原子間力顕微鏡によるさらなる解析の結果、表面の二乗平均平方根粗さはわずか0.2 nanometersであることが明らかになった。IV型コラーゲンおよびその溶液は、レーザーによってアルブミンが除去されたUV照射領域に優先的に吸着する。

このアプローチの汎用性を実証するため、フィブリンなどの他のタンパク質も同じ手法を用いてパターニングされています。ここでは、カバーガラス上のXC 2パターニング領域および、そのすぐ隣の点線で定義された領域で細胞が成長しています。このカバーガラスは、最近in situでUV照射され、type IV collagenでコーティングされました。

その後5日間で、細胞が増殖および遊走し、新たにコーティングされた領域を覆います。ここで提示した手順を用いることで、培養下の細胞を任意に操作することが可能となり、さらに、複数種類の細胞をパターニングして精巧な共培養システムを構築できる可能性があります。