タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます

次の実験の全体的な目標は、タンパク質の機能と変化したタンパク質発現の役割を効率的かつ厳密に制御された方法で研究することです。これは、抗体を適用して細胞が利用できる機能性タンパク質の量を減らすことで達成されます。これを達成するために、抗体はChariotという名前のペプチドに結合し、細胞膜を横切る通過を仲介します。

次に、目的の細胞構造を画像化し、3D再構築して、治療の効果を評価します。その結果、Chariotペプチドは、抗体干渉による核タンパク質の標的化に特に適していることが明らかになりました。この手法がRNA干渉などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、細胞内に注入された抗体がすぐに効果を発揮し、研究者が抗体の投与量を調整することで干渉の程度を厳密に制御できることです。

この方法は、多くの細胞タイプのタンパク質機能に関する洞察を得ることができますが、治療に非常に敏感でありながらChariotに非常によく耐える初代ニューロン培養のタンパク質を標的とする場合に特に興味深いものです。調製では、凍結乾燥されたChariotペプチド粉末を滅菌水に2マイクロリットルあたり2マイクログラムで再懸濁します。.チューブを慎重に軽くたたいて、粉末を溶液に混ぜます。

次に、小さな作業用アリコートを準備し、各反応に必要なマイクロリットルはわずか2マイクロリットルで、アリコートを摂氏20度で保存します。次に、トランスフェクション用の哺乳動物細胞を、抗生物質を含む半ミリリットルの培地を含む24ウェルプレートに播種して調製します。ニューロンを使用する場合は、中央の2列のみに低密度で細胞を播種します。

空の井戸は後で役立ちます。早く。培養されたニューロンは、数分以上インキュベーターから出てはいけません。

ニューロンが目的の発達段階に達するまで、週に2回、ニューロンの媒体の約4分の1から半分を交換します。非ニューロン培養は、細胞が50%のコンフルエントにあるときに使用すべきです。次の手順は、6つのテストと6つのコントロールサンプルについて示されています。

各貨物について、サンプルあたり1X PBSの50マイクロリットルで0.1〜2マイクログラムの希釈を準備します。あらかじめ結合した一次抗体と二次抗体の高分子複合体もカーゴとして使用できます。溶液を穏やかな渦で混合し、続いて短時間の遠心分離を行います。

次に、反応ごとに2マイクロリットルのChariotストック溶液を50マイクロリットルのPBSに希釈します。Chariotの自己会合を防ぐために、サンプルごとに別々のチューブを使用してください。次に、準備したタンパク質をChariot希釈液で組み合わせます。

組み合わせたタンパク質を混合して紡糸します。サンプルを室温で30分間インキュベートして、Chariotカーゴコンプレックスの形成を可能にします。最適なタンパク質ペプチドの量は、使用するカーゴと細胞の種類によって異なります。

したがって、この量は経験的に決定する必要があります。事前に、添加物を含まない増殖培地と、0.5ミリモルの塩化マグネシウムと塩化カルシウムを含む1X PBSを摂氏37度に予温します。さて、始めに、準備したChariotコンプレックスを100マイクロリットルの媒体で希釈します。

めっきしたセルから培地を取り出し、空のウェルに移して再利用します。次に、500マイクロリットルの予熱した1X PBS、カルシウム、塩化マグネシウム溶液で細胞を穏やかに洗浄します。Chariot複合体を運ぶ培地を細胞に塗布し、プレートを穏やかに揺さぶって溶液が均一に分布するようにします。

細胞を素早くインキュベーターに戻し、1時間待ってから先に進めます。ニューロンの場合、1時間のインキュベーション後、保存した培地をウェルに移します。他のすべての細胞については、血清を最終濃度10%まで追加培養ニューロンは、培地の温度やpHの変化などに非常に敏感です。

したがって、これらの細胞は洗浄し、予め温めた溶液で穏やかにトランスフェクションし、できるだけ早くインキュベーターに戻す必要があります。インキュベーションは、トランスフェクトされたカーゴと細胞の種類に応じて、必要な限り継続します。インキュベーション後、通常どおり、その後の分析のために細胞を処理します。

固定プロトコルとライブイメージングは、どちらもこの技術と互換性があります。63倍レンズを搭載したレーザー走査型顕微鏡を用いて、約0.25〜0.5ミクロンの距離で撮影することで、漂白を避けながら十分なディテールのZスタックを得ることができます。正確な層距離は、再構築する構造物のサイズによって異なり、個別に決定する必要があります。

イメージの再構築を行うには、ImarisでLSMファイルを開きます。このソフトウェアでは、エスケープボタンを使用して選択とナビゲートを切り替えます。また、Controlキーを押しながら複数のオブジェクトを選択することもできます。

ディスプレイ調整を使用して、各チャンネルに移動し、最も明るい構造が彩度に達するまでコントラストを調整します。この調整はサーフェスの構造には影響しませんが、画像のしきい値を設定するのに役立ちます。再構築するオブジェクトが異なるファイルに含まれている場合は、[スライスの編集と追加] 機能を使用して、対応するファイルを結合します。

次に、[Add New Surfaces] アイコンをクリックし、[Segment only a Region of Interest] を選択します。次に、選択ボックスの余白を調整して、目的のオブジェクトに合わせます。長方形の形状と傾きを調整して、必要なすべての構造がボックス内に収まるまで

選択は、Z平面全体を通じて各画像で調整する必要があります。不要なオブジェクトは後で削除できます。次に、適切なチャネルを選択します。

続行するには、しきい値処理ツールを使用して、対象の構造を再構築します。表面積の詳細レベル、つまり球の直径は、再構築する構造物と一致するように設定する必要があります。信号の特性に応じて、絶対強度または局所コントラストのいずれかを使用できます。

一般に、ローカルコントラストは拡散信号に適しています。このシグナルの特性により、局所的な造影剤を使用して核内のタンパク質を再構築します。いずれにせよ、設定は対象の信号または構造ごとに個別に調整する必要があります。

画面下部の緑色の矢印をクリックして、再構築を完了します。次に、鉛筆ツールを使用してオブジェクトをさらに調整します。再構成を元の信号と慎重に比較し、必要に応じて画像を傾けて表面をカットおよび除去し、カットツールがその目的を正確に果たせるようにします。

次に、各サーフェスの体積、面積、強度を測定するには、[統計情報]、[詳細統計]、および [平均値] を選択します。必要に応じて、対応するサーフェスの[色]タブを選択し、選択したオプションを[ベース]から[統計コード]に変更することで、色分けされた統計を生成できます。スナップショットの撮影ツールを使用すると、公開用の写真を撮ることができます。

同じ領域内の複数のオブジェクトを再構築する場合は、Store Parameters 関数を使用して情報を保存できます。HEK293細胞で発現したSimiateは、Chariotペプチドによって細胞内にシャトルされたSimiate抗体によって特異的に検出されました。Simiate抗体集合体は、適用後、体細胞と核に入り、黄色の矢印で示すようにFLAG-Simiateと特異的に共局在します。

用量依存的に、Simiate抗体はHEK293細胞に大量のアポトーシスを誘導しましたが、対照抗体は効果がありませんでした。ニューロン細胞が毒性作用に非常に敏感であることから、この手法は初代海馬培養に適用されましたが、模擬細胞、未処理細胞、および戦車処理された細胞を比較すると、ニューロンの生存率に影響がありませんでした。同じ適用スキームに従って、ヤギ抗モルモットAlexa568抗体集合体は、体細胞および核に発生する細胞の約83%でさまざまな程度で見られました。

これらの観察結果は、HEK293細胞の結果と一致する3D解析によってさらに裏付けられました。したがって、Chariot法は、解離した初代海馬ニューロンをトランスフェクションするためにうまく使用できます。一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば3〜6時間で完了します。

Chariotと目的のタンパク質の複雑な形成には約40分かかります。これらの複合体で細胞をトランスフェクションするには、70分かかり、貨物のサイズと特性に応じてさらに1〜4時間かかります。この手順に続いて、タンパク質の機能をより詳細に解析するために、ライブイメージングおよび運動アッセイ、解析および電気生理学的記録などの他の方法を実施することができる。