Name: タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学ぶ 抗体干渉法によるタンパク質機能解析と発現制御。Chariotペプチドを用いて海馬ニューロンに抗体を導入し、三次元再構成で細胞構造を評価する革新的な手法です。

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提示作業はカナダ衛生研究所からの資金部でサポートされていた/ RDにカナダのパートナーシッププログラムの脆弱X研究財団、RD、大学エアランゲン・ニュルンベルクのInterdisziplinäresZentrumのエリーゼklinische Forschungにジェロームルジューン財団はRDとしますドイツ学術協会からRD及びREへ。著者らは、pCMV5-FLAGベクターを利用可能にするために、細胞培養の維持と技術支援のためのイングリッド・ゼンガーだけでなく、教授M.ウェグナーに感謝したいです。著者はさらに、特にビデオ撮影で役立つサポートのためナジャシュローダーに感謝したいです。

1.在庫ソリューション<ol><li> /μlの終濃度2μgに滅菌H 2 O中で凍結乾燥アクティブモチーフ粉末を再懸濁します。混合するために慎重にタップします。 </li><li> （ 例えば、12μlのそれぞれは、2μlの反応ごとに必要とされる）少量のアリコートを調製し、-20℃で保管してください。 </li></ol>細胞の調製<ol><li>抗生物質を含む500μlの増殖培地中で24ウェルプレートに、このようなHEK293細胞または一次ニューロンなどの哺乳動物細胞をシード。 注：ニューロンを使用する場合は、低密度で細胞を播種すると、24ウェルプレートの2つだけ真ん中の行を使用します。各ウェルは、このように、インキュベーション（ステップ4.2）の間にメディアを保有する空の相手を持つことになります。ニューロンを取り扱う際は、常に細胞が数分以上インキュベーターの外に保たれていないことを確認してください。 </li><li>細胞アプリなるまで培養に適切な条件で細胞が（、加湿5％CO 2、37℃）。 50％コンフルエント。 注：ニューロンを使用する場合は、 文化希望の発達段階までの細胞が到達したアプリを変更されています。二回培地の百分の25から50週。ミディアム：Neurobasal培地（1×B27、5 mMのL-グルタミンおよび1×ペニシリンおよびストレプトマイシンを含む; REF 16と比較）。 </li></ol> 3.チャリオット複合体形成<ol><li>反応あたり、50μlのPBSで、それぞれPOIまたは対応する抗体ならびに対照タンパク質、または対照抗体の0.1〜2μgのを薄めます。 注：技術はまた予め結合一次および二次抗体からなる高分子複合体と連携（CP「代表的な結果」、 図1）。混合し、スピン。 </li><li>各サンプルについて、チャリオットの自己会合を避けるために、別々のチューブを使用して50μlのPBSで2μlのチャリオットストック溶液を希釈します。混合し、スピン。 </li><li>ピペットでチャリオット希釈に希釈したPOIまたは抗体（ステップ3.1）を転送ティン。混合し、スピン。 </li><li>室温で30分間混合物をインキュベート（チャリオット-POIの複合体が形成されます）。 </li></ol>細胞のトランスフェクション4。 <ol><li> 100μlの予め温めた成長培地（37℃、無添加）でチャリオット錯体（ステップ3.4）に希釈します。培地を除去し、予め温めた1×PBSを用いて細胞を1回洗浄します。 注：ニューロンを使用する場合は、メディアを破棄することはありません、それが再利用されます。 37°Cで保管してください。洗浄には、0.5のMgCl 2とのCaCl 2を含むPBSを使用しています。 提案：プレート（ステップ4.5）をインキュベートしながら、空のウェルに培地を維持します。 </li><li>細胞へのチャリオット複雑なソリューション（ステップ4.1）を適用し、溶液の均一な分布を確実にするために、細胞を穏やかに揺すります。 1時間の標準的な条件（ステップ2.2）の下で細胞を増殖させます。 10％の最終濃度に血清を加えます。ニューロンを使用する場合、 ステップ4.1からメディアを追加します。 1〜2時間以上細胞を増殖させます。 注記：最適なインキュベーション時間は、貨物の大きさと性質に依存し、経験的に調整される必要があり得ます。次の提案は、ガイドラインとして役立ち得る：ペプチドに関して、1時間で通常は十分である、タンパク質1-2時間、抗体2時間、および抗体4時間と神経細胞のトランスフェクションのために、推奨されています。 </li><li>いつものように、分析のためのプロセス細胞。ご注意：技術は、固定プロトコルだけでなく、ライブイメージングを用いた実験と互換性があります。 </li></ol> 5.イメージング<ol><li>レーザ走査顕微鏡を使用して、約0.25〜0.5ミクロンの距離を用いて細胞および/または対象の細胞区画のZスタックを取ります。正確な層の距離を再構成する構造体の大きさに依存し、個別に決定する必要があります。 </li></ol> 6.復興<ol><li>次の手順では、Oをクリックすることで、複数のオブジェクトを選択するために選択して移動し、CNTRを切り替えるには、Escキー底を使用nはそれらとシフトキーは、オブジェクト（CPを。6.10ステップ）を切断します。 </li><li> IMARISでLSM-ファイルを開きます。 </li><li>明るい構造が飽和状態に達するまで、各チャンネルの表示調整を使用して、画像をコントラスト。この調整は、表面の構造に影響を与えないだろう、それが唯一の画像を閾値に実験者を支援するために提供していますのでご注意ください。 </li><li>新しいサーフェスを追加アイコンをクリックします。ウィザードが開きます。 </li><li>選択：セグメント関心の領域のみ。次のステップに進みます。 </li><li>興味のある対象物に合わせて選択ボックスの余白を調整します。画像は、3次元を持っており、選択は同様にz平面で調整する必要があることをことを心に留めておいてください。選択ボックスの長方形の形状を適切に関心のオブジェクトと一致していなければならない場合は、オブジェクトをオンおよび/または必要なすべての構造が埋め込まれるまでボックスを拡大。望ましくないオブジェクトは、（CP。ステップ6.10）に、後に除去することができます。進みます。 </li><li>適切なCHを選択annel。表面積の詳細レベルや球の直径は、再構成されている構造と一致するように設定する必要があります。信号特性に応じて、絶対強度または局所的なコントラストのいずれかを使用することができます。一般的に、局所的なコントラストは、拡散信号のためのより良い動作します。いずれの場合も、設定がそれぞれ、各注目信号または構造のために個別に調整する必要があります。 </li><li>しきい値処理ツールを用いて、関心の構造を再構築します。 </li><li>緑の矢印の下のをクリックして再構築を完了します。 </li><li>カットし、必要に応じて表面を除去するために、鉛筆ツールを使って、別の目的を調整します。所望の物体を切断するために、画像を、従って、南北方向に切断傾斜することのみが可能です。 </li><li>統計、詳細な統計情報、および平均値を選択することで、ボリューム、面積と各サーフェスの強度の測定値を得ます。 </li><li> （CP。 図2E色分けされた統計情報を観察するには（オプションの手順） </strong&gt;およびF）は 、対応する表面の色]タブを選択し、代わりに「基本」の「統計符号化」をマークします。いくつかのオプションが表示されます。 </li></ol>

<ol><li>Santoro, M. R., Bray, S. M., Warren, S. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSantoro%2C+MR+%22Annual+Review+of+Pathology%3A+Mechanisms+of+Disease%22">Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease</a>. Abbas, A. K., Galli, S. J., Howley, P. M. 7, Annual Review. 219-245 (2012).</li>
<li>Jiang, T. F., Chen, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+two+lysosome+degradation+pathways+of+alpha-synuclein+in+Parkinson%27s+disease%3A+potential+therapeutic+targets%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Bull%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of two lysosome degradation pathways of alpha-synuclein in Parkinson's disease: potential therapeutic targets?</a> Neurosci Bull. 28, 649-657 (2012).</li>
<li>Howlett, D. R., Richardson, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+APP+transgenic+mice%3A+a+model+of+Alzheimer%27s+disease+or+simply+overexpression+of+APP%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">The pathology of APP transgenic mice: a model of Alzheimer's disease or simply overexpression of APP?</a> Histol Histopathol. 24, 83-100 (2009).</li>
<li>Carlson, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Modification+of+the+Phenotypes+Produced+by+Amyloid+Precursor+Protein+Overexpression+in+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic Modification of the Phenotypes Produced by Amyloid Precursor Protein Overexpression in Transgenic Mice.</a> Human molecular genetics. 6, 1951-1959 (1997).</li>
<li>Jiao, X. F., Wang, Z., Kiledjian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+mRNA-secapping+regulator+implicated+in+X-linked+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an mRNA-secapping regulator implicated in X-linked mental retardation.</a> Mol. Cell. 24, 713-722 (2006).</li>
<li>Fukami, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+member+of+a+gene+family+on+Xp22.3%2C+VCX-A%2C+is+deleted+in+patients+with+X-linked+nonspecific+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A member of a gene family on Xp22.3, VCX-A, is deleted in patients with X-linked nonspecific mental retardation.</a> Am. J. Med. Genet. 67, 563-573 (2000).</li>
<li>Van Esch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+VCX-A+due+to+NAHR+plays+a+major+role+in+the+occurrence+of+mental+retardation+in+patients+with+X-linked+ichthyosis%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Deletion of VCX-A due to NAHR plays a major role in the occurrence of mental retardation in patients with X-linked ichthyosis.</a> Human molecular genetics. 14, 1795-1803 (2005).</li>
<li>Sebat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strong+association+of+de+novo+copy+number+mutations+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Strong association of de novo copy number mutations with autism.</a> Science. 316, 445-449 (2007).</li>
<li>Tartaglia, G. G., Pechmann, S., Dobson, C. M., Vendruscolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+edge%3A+a+link+between+gene+expression+levels+and+aggregation+rates+of+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Life on the edge: a link between gene expression levels and aggregation rates of human proteins.</a> Trends Biochem Sci. 32, 204-206 (2007).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473, 337-342 (2011).</li>
<li>Uchino, K., Ochiya, T., Takeshita, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+therapeutics+and+applications+of+microRNAs+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Jpn+J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">RNAi therapeutics and applications of microRNAs in cancer treatment.</a> Jpn J Clin Oncol. 43, 596-607 (2013).</li>
<li>Li, T., Wu, M., Zhu, Y. Y., Chen, J., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNA+interference-based+therapeutics+and+application+of+multi-target+small+interfering+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acid+Ther%22%5BJournal%5D)">Development of RNA interference-based therapeutics and application of multi-target small interfering RNAs.</a> Nucleic Acid Ther. 24, 302-312 (2014).</li>
<li>DeVincenzo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise%2C+pitfalls+and+progress+of+RNA-interference-based+antiviral+therapy+for+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Antivir+Ther%22%5BJournal%5D)">The promise, pitfalls and progress of RNA-interference-based antiviral therapy for respiratory viruses.</a> Antivir Ther. 17, 213-225 (2012).</li>
<li>Fellmann, C., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+RNA+interference+rules+for+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable RNA interference rules for silencing.</a> Nat Cell Biol. 16, 10-18 (2014).</li>
<li>Morris, M. C., Depollier, J., Mery, J., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peptide+carrier+for+the+delivery+of+biologically+active+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A peptide carrier for the delivery of biologically active proteins into mammalian cells.</a> Nat Biotechnol. 19, 1173-1176 (2001).</li>
<li>Derlig, K., Gießl, A., Brandstätter, J. H., Enz, R., Dahlhaus, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Characterisation+of+Simiate%2C+a+Novel+Protein+Linked+to+the+Fragile+X+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Identification and Characterisation of Simiate, a Novel Protein Linked to the Fragile X Syndrome.</a> PLoS One. 8, e83007(2013).</li>
<li>Derlig, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simiate+is+an+Actin+binding+protein+involved+in+filopodia+dynamics+and+arborisation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Simiate is an Actin binding protein involved in filopodia dynamics and arborisation of neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Loudet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-covalent+delivery+of+proteins+into+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Org+Biomol+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-covalent delivery of proteins into mammalian cells.</a> Org Biomol Chem. 6, 4516-4522 (2008).</li>
<li>Nagel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+microspheres+as+protein+transduction+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Polymeric microspheres as protein transduction reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 13, 1543-1551 (2014).</li>
<li>Selim, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-osteoactivin+antibody+inhibits+osteoblast+differentiation+and+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Eukaryot+Gene+Expr%22%5BJournal%5D)">Anti-osteoactivin antibody inhibits osteoblast differentiation and function in vitro.</a> Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 13, 265-275 (2003).</li>
<li>Jain, A., Brady-Kalnay, S. M., Bellamkonda, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Rho+GTPase+activity+alleviates+chondroitin+sulfate+proteoglycan-dependent+inhibition+of+neurite+extension%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Modulation of Rho GTPase activity alleviates chondroitin sulfate proteoglycan-dependent inhibition of neurite extension.</a> J Neurosci Res. 77, 299-307 (2004).</li>
<li>Watanabe, S., Wakasugi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+function+of+human+neuroglobin+is+correlated+with+its+guanine+nucleotide+dissociation+inhibitor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective function of human neuroglobin is correlated with its guanine nucleotide dissociation inhibitor activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 369, 695-700 (2008).</li>
<li>Eguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+nuclear+localization+signal+for+nuclear+transport+of+DNA-encapsulating+particles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Optimization of nuclear localization signal for nuclear transport of DNA-encapsulating particles.</a> J Control Release. 104, 507-519 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、用量駆動方法で細胞機能を制御するタンパク質の発現レベルの有意性を研究するためのプロトコルを提示します。説明されたプロトコルは、従って、細胞レベルでのタンパク質の機能の詳細な研究を促進する、海馬神経細胞を含む様々な哺乳類細胞型におけるタンパク質発現の微調整操作を可能にします。 RNA干渉は、ランドマークをダウンレギュレートするために、周知の戦略を示しているが、その欠点（CP 14）を有しています。だけでなく、高度に特異的かつ効率的な配列の同定は、コストと時間がかかるだけでなく、細胞内の転写産物の生合成は、有毒なRNA構築物の蓄積、核輸出機械の過負荷と同様に飽和するので、予測できない結果を引き起こす可能性がありすることができます内因性RNAiの処理システムは、オフターゲット効果または非効率をもたらすことができます。また、外因性のRNAiベクターの高い量が案内を誘導することができますpecific効果だけでなく、細胞の恒常性を乱します。 抗体は、他の一方で、即時細胞プロセスの研究を、彼らは、セルを入...

すべての生物が独自の開発を指揮するだけでなく、環境シグナルに反応するためのタンパク質発現の厳密な制御が不可欠です。したがって、機構の多くは、正確にアプリケーションによってコードされる各タンパク質の発現量を調節するために進化の過程で発明されました。 2万遺伝子は、その寿命の任意の時点で任意の真核生物の細胞内に存在します。タンパク質生産のさまざまな段階で行われて、調節機構は、翻訳後タンパク質修飾、輸送及び劣化の方向に取り扱うクロマチン構造、転写およびRNAの管理の範囲です。 基礎となる分子機械と変化したタ​​ンパク質の発現レベルの機能不全は、癌や知的障害などの多様な疾患と関連していることは驚くべきことではありません。実際、神経発達および哺乳動物の脳機能の優れた複雑さを見て、センシタンパク質の発現の変化にこれらの高度なシステムのtivityは、脆弱X症候群（FXS）のようないくつかのよく知られている知的アルツハイマー病やパーキンソン病（ADおよびPD）などの赤字だけでなく、自閉症スペクトラム障害（ASD）となって現れます。後者の疾患は、単一の翻訳調節タンパク質、FMRP（脆弱X精神遅滞タンパク質）1-4の損失に起因する種々のタンパク質の大規模な誤発現によって特徴付けられます。また、変数の充電に影響を与える染色体再配列は、点突然変異が認知障害のある患者で同定されなかった一方で連結されたタンパク質A（VCXA）、5をキャッピングするmRNAを変更することにより、mRNAの安定性および翻訳を管理するタンパク質が、最近では、知的障害と関連しているxは今のところ6、7、観察された精神的な障害が変更されたVCXA式とその標的proteの調節不全の発現に由来することを示唆していますイン。これらの知見と一致して、遺伝子のデノボコピー数の変動がASDに関連しているかどうかを調査する研究では、新規遺伝子重複および欠失は、このように上昇または低下したタンパク質の発現レベルが引き起こす可能性があるという考えを支持し、ASD 8のための重要な危険因子である確立しました知的障害。 注目すべきことに、最近の研究は、さらに、所定のタンパク質の発現量を正確にほとんど安全マージン9と高タンパク質量の結果としての凝集を防止するように調節されるという証拠を提供しました。したがって、小さな増分は、ADおよびPD 9のような疾患を誘発するのに十分であることが提案されています。タンパク質の発現制御に貢献する分子機械の様々なこれらの知見に照らして、複雑なレギュレーション方式を示唆しているが、5,000以上の哺乳動物遺伝子の発現レベルを調査する研究が10ということを実証しました性質がより倹約スキームを好ん：タンパク質の細胞存在量は、主に翻訳10のレベルで調節されることが示された、このようにRNAの可用性の管理は、主に微調整タンパク質発現に役立つことを説明します。 目的のタンパク質の用量を学ぶ（ランドマーク）は、したがってのみタンパク質の内因性機能の理解に重要なだけでなく、多くの疾患の調査と治療法の開発にではありません。このように、最後の数十年は、POIの投与量を操作するためにRNA干渉を用いて、いくつかの戦略の進歩を見てきました。 RNA干渉は、広くタンパク質機能を研究するために使用され、さらには癌または眼疾患を治療するだけでなく、患者11から13に抗ウイルス療法を追求するために臨床試験に適用されているが、いくつかの困難が不可能な戦略をレンダリングする可能性があります発生する可能性があります。例えば、相同性によってノックダウンを駆動シード配列は、comparaありますしたがって、オフターゲット効果を促進し、BLE短いです。高効率の配列はまれであり、（14に概説されている）オプションの数千人の中から発見される必要があるので、右の配列を同定することは、時間とコストがかかることができますが、結果はまだ失望してもよいです。 別の戦略は、直接抗体によるPOIを標的とすることです。ここでは、細胞タンパク質の利用可能性を減らすために（アクティブモチーフ社製）タンパク質担体チャリオットの使用を説明し、3次元再構成の雇用はノックダウンを以下のタンパク質の機能を研究します。 チャリオット、自身2.8 kDaのペプチドの活性モチーフは、哺乳動物細胞15の膜を横切ってシャトルペプチド、タンパク質および抗体に使用されます。チャリオット-POIの複合体がエンドソーム-INDに細胞内に内在化されるところ疎水性相互作用を利用した非共有結合した高分子複合体を形成することによりPOIを有するペプチド会合し、ependent方法。重要なことには、チャリオットは往復タンパク質の細胞内局在に影響を与えない、また細胞毒性効果を発揮するか、積荷15の生物学的活性に影響を与えることもないことが示されました。

<table><tbody><tr><td>チャリオ</td>ット<td>アクティブモチーフ</td><td>30025</td><td>ストア-20°C;C</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life technologies</td><td>21103-049</td><td>ウォームアップ 37 >1x</td></tr><tr><td>B27</td><td>Lifeテクノロジー</td>を使用する前のC <td></td><td>17504044-20°Cで保管します。C</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>25030-149</td> -<td>20 °C;C</td></tr><tr><td>ペニシリンおよびストレプトマイシン</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>15140-122</td> は <td>-20 °C で保管されています。C</td></tr><tr><td>Imaris ソフトウェア</td><td>Bitplane</td><td>n.a.</td><td>高価だが、比類のない</td></tr><tr><td>レーザー走査型顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>n.a.</td><td></td></tr></tbody></table>

タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます

Studying Protein Function and the Role of Altered Protein Expression by Antibody Interference and Three-dimensional Reconstructions

タンパク質発現の厳格な管理は、生きているすべての生物に不可欠なだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質の機能を調査するための重要な戦略だけではありません。したがって、最近の研究は、RNAおよび抗体干渉を含む哺乳動物細胞系、あるいは動物モデルにおいて、タンパク質の発現を標的とするさまざまなツールを発明しました。最初の戦略は、過去20年間に多くの注目を集めているが、細胞膜を横切って細胞に抗体貨物の転位を媒介するペプチドは、はるかに少ない関心を得ました。この公報では、抗体の干渉実験を行うために、ヒト胚性腎細胞ならびに初代海馬ニューロンにおけるチャリオットという名前のペプチドキャリアを利用し、さらにタンパク質の機能を解析する際に3次元再構成の適用を説明するためにどのように詳細なプロトコルを提供します。我々の調査結果は、チャリオットはparticula、おそらく、その核局在化シグナルによるものであることを示唆していますRLY相馬と核内に存在するタンパク質を標的とするためによく適しています。初代海馬培養にチャリオットを適用する際に注目すべき、試薬は驚くほどよく解離したニューロンによって受け入れられるようになりました。

以下の段落では、チャリオット試薬と抗体の干渉を用いて、POI（16、17を参照してください詳細についてはSimiate、）の機能的ノックダウンを示す典型的な結果が提示されています。所見はSimiateの減少発現は転写活性を損ない、および、用量依存的に、高い抗体量（&gt; 1μgの抗体）が適用されている場合は99％以上の死亡率で最高潮に達する、アポトーシスを誘導することを実証している（これらの発見は、以前に掲載されました16）。ここでは、詳細に使用される技術とプロトコルを提供し、さらに一次培養物中で解離海馬ニューロンをトランスフェクトするために使用することができる方法チャリオット試薬実証します。 これらの抗体は、処置の間に機能的なままである場合、チャリオットのペプチドは、特に、抗体の効率的なシャトリングを可能とするかどうかを調べるために、我々は、FLAGを発現しHEK293細胞で24時間-Simiate、その後チャリオットを利用する細胞はrbαSimiate-gtαrbAl...

タンパク質発現の制御は、生きているすべての生物にとって不可欠であるだけでなく、細胞モデルにおけるタンパク質機能を調査するための重要な戦略でもあります。提示されたプロトコルは、初代海馬ニューロンを含む哺乳類細胞における抗体干渉の適用を示し、タンパク質機能の研究における三次元再構成の使用を示しています。

A strict management of protein expression is not only essential to every organism alive, but also an important strategy to investigate protein functions ...

本実験の全般的な目的は、タンパク質の機能およびタンパク質発現の変化が果たす役割を、効率的かつ厳密に制御された方法で研究することです。これは、抗体を適用して細胞内で利用可能な機能性タンパク質の量を減少させることで達成されます。これを実現するために、抗体は細胞膜の通過を媒介するChariotと呼ばれるペプチドに結合されています。次に、処置の効果を評価するために、目的の細胞構造のイメージングと3D再構築を行います。その結果、Chariotペプチドは、抗体干渉によって核タンパク質を標的とするのに特に適していることが明らかになりました。RNA干渉のような既存の手法に対するこの技術の主な利点は、細胞内に輸送された抗体が即座に効果を発揮すること、および抗体投与量を調整することで研究者が干渉の程度を厳密に制御できることです。この手法は多くの細胞種におけるタンパク質機能の知見を得るのに有効ですが、特に一次神経細胞培養における標的タンパク質への適用において有用です。一次神経細胞は処理に対して非常に敏感ですが、Chariotへの耐性は非常に高いためです。準備として、凍結乾燥したChariotペプチド粉末を滅菌水に溶解し、濃度を2 µg/µLに調製します。チューブを軽く叩いて、粉末を完全に溶解させてください。次に、小さな分注サンプルを準備します。各反応に必要な量はわずか2 µLです。これらの分注サンプルを20 °Cで保存してください。続いて、抗生物質を含む0.5 mLの培地を用いて24ウェルプレートに細胞を播種し、トランスフェクション用の哺乳類細胞を準備します。ニューロンを使用する場合は、中央の2列にのみ、低密度で細胞を播種してください。空のウェルは後で使用します。迅速に作業してください。培養ニューロンをインキュベーターの外に出しておく時間は、数分以内に留める必要があります。ニューロンが目的の発達段階に達するまで、週に2回、培地の約4分の1から2分の1を交換します。非ニューロン培養では、細胞が50%コンフルエントに達した時に使用してください。以下の手順は、6つのテストサンプルおよび6つのコントロールサンプルについて示しています。各カーゴについて、サンプルあたり50 µLの1X PBSで0.1〜2 µgに希釈した溶液を調製します。あらかじめ結合させた一次抗体および二次抗体の高分子複合体もカーゴとして使用可能です。溶液を緩やかなボルテックスで混合し、その後、短時間遠心分離を行います。次に、各反応につき、2 µLのChariotストック溶液を50 µLのPBSで希釈します。Chariotの自己会合を防ぐため、サンプルごとに個別のチューブを使用してください。ここで、調製したタンパク質をChariot希釈液に加えます。混合したタンパク質をミキシングし、遠心分離します。Chariotカーゴ複合体を形成させるため、サンプルを室温で30分間インキュベートします。最適なタンパク質ペプチド量は、使用するカーゴおよび細胞型によって異なります。したがって、この量は経験的に決定する必要があります。あらかじめ、添加物を加えなかった増殖培地と、0.5 millimolar の塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムを含む 1X PBS を 37 degrees Celsius に予熱しておきます。それでは、まず、調製した Chariot complex を 100 microliters の培地で希釈します。プレートに播種した細胞から培地を除去し、再利用のために空のウェルに移します。次に、あらかじめ温めておいた1X PBS（塩化カルシウム、塩化マグネシウム含有溶液）500 microlitersで細胞を穏やかに洗浄します。Chariot複合体を含む培地を細胞に添加し、溶液が均一に行き渡るようにプレートを穏やかに揺らします。速やかに細胞をインキュベーターに戻し、次へ進む前に1時間待機します。ニューロンの場合、1時間のインキュベーション後、保存しておいた培地をウェルに移します。その他のすべての細胞については、最終濃度が10%になるように血清を添加します。培養ニューロンは、培地の温度やpHの変化などに対して非常に敏感です。したがって、これらの細胞は、あらかじめ温めておいた溶液を用いて穏やかに洗浄およびトランスフェクションを行い、速やかにインキュベーターに戻す必要があります。トランスフェクションした貨物および細胞の種類に応じて、必要な時間だけインキュベーションを継続してください。インキュベーション後、通常の手順で細胞を処理し、その後の解析に進みます。固定プロトコルとライブイメージングは、いずれも本手法と併用可能です。63倍レンズを備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用い、退色を避けつつ十分な詳細度を持つZスタック画像を得るために、約0.25から0.5 micronの間隔で撮影を行います。正確な層間距離は、再構築する構造のサイズによって異なるため、個別に決定する必要があります。画像の再構成を行うため、ImarisでLSMファイルを開きます。このソフトウェアでは、Escapeボタンを使用して「選択（Select）」と「ナビゲート（Navigate）」を切り替えます。また、Controlキーを押しながら操作することで、複数のオブジェクトを選択できます。ディスプレイ調整（Display Adjustment）を使用して、各チャネルに入り、最も明るい構造が飽和状態になるまでコントラストを調整します。この調整はサーフェス構築に影響を与えませんが、画像の閾値設定（thresholding）に役立ちます。再構築するオブジェクトが異なるファイルに分かれている場合は、「スライスの編集と追加（Edit and Add Slices）」機能を使用して、対応するファイルを統合してください。次に、「Add New Surfaces」アイコンをクリックし、「Segment only a Region of Interest」を選択します。次に、関心領域に合うように選択ボックスのマージンを調整します。必要な構造がすべてボックス内に収まるまで、長方形の形状と傾きを調整してください。Z平面全体を通じて、各画像で選択範囲を調整する必要があります。不要なオブジェクトは後で削除できます。次に、適切なチャネルを選択してください。次に、閾値設定ツールを使用して、目的の構造を再構成します。表面積の詳細レベル（球径）は、再構成する構造に合わせて設定してください。信号特性に応じて、絶対強度または局所コントラストのいずれかを使用できます。一般的に、拡散したシグナルにはローカルコントラストの方が適しています。このシグナルの特性により、核内のタンパク質を再構成するためにローカルコントラストが使用されます。いずれの場合でも、設定は対象となる各シグナルや構造に合わせて個別に調整する必要があります。画面下部の緑色の矢印をクリックして再構成を完了させます。次に、ペンシルツールを使用してオブジェクトをさらに調整してください。再構成された像と元の信号を注意深く比較し、カットツールが正確に機能するように、必要に応じて画像を傾けて表面をカットし除去してください。次に、[Statistics]、[Detailed statistics]、[Average Values]を選択し、各表面の体積、面積、および強度を測定します。必要に応じて、該当する表面の[Color]タブを選択し、オプションを[Base]から[Statistic Coded]に変更することで、色分けされた統計情報を生成できます。[Take Snapshot]ツールを使用すると、出版用の画像を保存できます。同一領域内の複数のオブジェクトを再構築する場合、「Store Parameters」機能を使用して情報を保存できます。HEK293細胞で発現したSimiateは、Chariotペプチドによって細胞内に輸送されたSimiate抗体によって特異的に検出されました。Simiate抗体アセンブリは、適用後に細胞体および核へ進入し、黄色い矢印で示されるようにFLAG-Simiateと特異的に共局在します。Simiate抗体は用量依存的にHEK293細胞に大規模なアポトーシスを誘導しましたが、対照抗体では効果が見られませんでした。神経細胞は毒性影響に非常に敏感であるため、この手法を初代海馬培養細胞に適用したところ、mock（擬似処理）または未処理の細胞とChariot処理した細胞を比較して、ニューロンの生存率に影響はありませんでした。同様の適用スキームに従い、goat anti-guinea pig Alexa568抗体アセンブリが約83%の細胞で観察され、それらは細胞体および核にさまざまな程度で認められました。これらの観察結果は、HEK293細胞の結果と一致する3D解析によってさらに裏付けられました。したがって、Chariot法は、解離させた一次海馬ニューロンのトランスフェクションに有効に利用できます。習熟すれば、適切に行うことでこの手法は3〜6時間で完了させることが可能です。Chariotと目的タンパク質の複合体形成には、約40分かかります。これらの複合体を細胞にトランスフェクションするには、70分、さらにカーゴのサイズや特性に応じて1〜4時間かかります。この手順の後、ライブイメージング、運動能アッセイ、分析、電気生理学的記録など、タンパク質の機能をより詳細に解析するための他の手法を実施することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

以上のタンパク質の半分以上は、電子顕微鏡像および三次元再構成の両方に挑戦している小タンパク質（分子量&lt;200 kDa）のである。最適化されたネガティブ染色は、高いコントラストと異なる生理学的条件下で小さな非対称のタンパク質または複合体の比較的高い解像度（〜1 nm）の画像を得るため、堅牢かつ高スループットのプロトコルである。...

最適化された負の染色：電子顕微鏡による小型·非対称蛋白質構造を調べるためのハイスループットプロトコル

Bio3D-webを用いたタンパク質配列 - 構造 - 動態関係のオンライン調査のためのプロトコールを提示する。...

Bio3D-webとのタンパク質配列構造ダイナミクスの関係の研究

ここでは、2 つの抗体を用いたタンパク質間相互作用研究手法を提示: 蛍光抗体法と免役沈降法。これらのテクニックは、蛋白質、細胞のシグナル伝達経路の新規成分の探索と理解蛋白質の原動力の間の物理的な相互作用を研究するために適しています。<br...

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糖タンパク質 x 線結晶構造解析および生物物理学的手法によって、免疫グロブリンフォールドのキャラクタリゼーション

ここでアセンブリと biolayer 干渉計 (結合) による炭疽菌毒素の分解を監視するためのプロトコルを提案する.次のアセンブリ/分解バイオ...

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質量分析 (MS) は、高分子アセンブリのダイナミクスと構造調査のための重要なツールとして浮上しています。ここでは、我々 はタンパク質複合体形成とリガンドを尋問する MS ・ ベース ・...

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ここでは、小角 x 線散乱 (SAXS) を高分子の構造を表す低解像度の封筒に情報を取得する利用できる方法を提案します。X 線結晶構造解析や核磁気共鳴などの高分解能構造技術と組み合わせて使用すると、小角はマルチ...

小角 x 線散乱による溶液中の高分子の構造研究

構造的に関連蛋白質はよく明確な生物学的機能を発揮します。キメラ蛋白質を作成するためにこれらの蛋白質の相当領域の交換は、彼らの機能の相違に責任がある重大な蛋白質の領域を識別するために革新的なアプローチを構成します。...

キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定

本プロトコルは、ヒトの健康に重要な役割を果たす2つのモデルタンパク質の構造および動態を調査するための方法を記載する。この技術は、ベンチトップの生物物理学的特性評価と中性子スピンエコー分光法を組み合わせて、タンパク質のドメイン間運動に関連する時間と長さのスケールでのダイナミクスにアクセスします。...

中性子スピンエコー分光法 による タンパク質ダイナミクスの研究

このプロトコルでは、従来のGFP/mCherryタグアプローチでは検出が困難な少量のタンパク質や翻訳後修飾のライブイメージングを可能にするために、カスタマイズされた抗体ベースの蛍光標識とショウ ジョウバエ...

蛍光抗体注入によるショウジョウバエの生きた胚における低存在量タンパク質と翻訳後修飾の可視化

ここでは、化学プローブと質量分析を使用して、天然細胞および組織からの疾患特異的タンパク質間相互作用の捕捉と同定を可能にするプロトコルを提示します。得られた相互作用データセットは、専用のWebベースのプラットフォームを介して分析され、動的なネットワーク機能不全と疾患に関連する経路の変化を明らかにします。...

疾患における機能不全タンパク質間相互作用のマッピング

学ぶ 抗体干渉法によるタンパク質機能解析と発現制御。Chariotペプチドを用いて海馬ニューロンに抗体を導入し、三次元再構成で細胞構造を評価する革新的な手法です。

タンパク質機能および抗体干渉によるタンパク質発現の変化の役割と三次元再構成を学びます

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