質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮
July 23rd, 2015
このプロトコルは、組織や腫瘍からECMタンパク質を濃縮し、ECM濃縮調製物を脱グリコシル化してペプチドに消化し、質量分析によってそれらのタンパク質組成を分析する手順を説明しています。
この手順の全体的な目標は、質量分析によって組織からの細胞外マトリックスの組成を特徴付けることです。これは、最初に選択した組織を完全に均質化するまで破壊することによって達成されます。第2のステップでは、組織を脱細胞化して細胞外マトリックスタンパク質を濃縮すると同時に、細胞内成分を枯渇させます。
次に、ECMに富んだタンパク質サンプルを最終ステップで変性させ、変性させたECMに富んだタンパク質サンプルをデクリコシル化してペプチドに消化します。ウェスタン血液分析は、脱細胞化とECMタンパク質濃縮の品質を監視するために使用されます。最終的には、ペプチドの質量分析による分析により、その特定の組織に対するECMの組成の特性評価が可能になります。
この方法は、正常組織の細胞外マトリックスの組成に関する洞察を得ることができますが、がんなどの疾患組織などの他のシステムにも適用できます。まず、テキストプロトコルに示されているように、すべてのバッファを準備します。表1、プロテアーゼ阻害剤の添加を含む。
次に、500マイクロリットルの緩衝液C中の100ミリグラムの組織を組織ホモジナイザーで破壊し、均一な懸濁液が得られるまで。ホモジネートをチューブローテーターに移し、摂氏4度のパイプに10〜20マイクロリットルのサンプルをチューブに入れ、全組織抽出物または出発物質フラッシュとしてラベル付けしました。サンプルを液体窒素で凍結し、マイナス80°Cで保存します。
次に、ホモジネートを16,000倍Gで摂氏4度で20分間遠心分離します。上清をきれいなチューブに集め、細胞質またはC画分としてラベル付けします。フラッシュ。Cフラクションを凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。
そこにピペットがあります。ペレットを400マイクロリットルのバッファーダブルに懸濁し、次いでチューブローテーター上で摂氏4度で20分間インキュベートする。次に、サンプルを遠心分離し、上清を捨てて最初に核タンパク質を抽出します。
ペレットを150マイクロリットルのバッファーNに再懸濁し、チューブローテーターで摂氏4度で30分間インキュベートします。次に、サンプルを遠心分離し、上清をきれいなチューブに集めます。遠心融合後、バッファーNでインキュベーションを繰り返します。
上清を結合し、核画分またはN画分としてラベル付けします。フラッシュ。Nフラクションを凍結して、摂氏マイナス80度で保存します。100マイクロリットルのバッファーMを加えて再投与し、ペレットを懸濁します。
次に、チューブローテーター上でサンプルを摂氏4度で30分間インキュベートしてから、遠心分離します。上清をきれいなチューブに集め、メンブレンまたはMフラクションフラッシュとしてラベル付けします。Mフラクションを凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。
激しくピペッティングしてペレットを200マイクロリットルの緩衝CSに懸濁し、次いでサンプルをチューブローテーター上で30分間インキュベートする。室温で、サンプルを室温で30分間遠心分離し、上清をきれいなチューブに集めて、細胞骨格画分またはCS画分として標識します。これで、ペレットが著しく小さくなるはずです。
ペレットを150マイクロリットルのバッファーC.サンプルをチューブローテーターに移し、摂氏4度で20分間インキュベートします。摂氏4度で20分間遠心分離し、上清を回収します。次に、上清を、細胞骨格画分またはCS画分としてすでに標識されているチューブ内のCSバッファーからの上清と組み合わせます。フラッシュ。
CSフラクションを凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。ペレットを洗浄します。500マイクロリットルのPBSに懸濁し、次いでチューブローテーター上で摂氏4度で5分間インキュベートする。
チューブを遠心分離し、上清を捨てます。合計3回洗います。ECM濃縮ペレットを得るには、実験のウェスタンブロックQC分析のためにECMフラクションのごく一部を保存します。
フラクションを液体窒素で急速凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。消化を開始します。まず、ECM濃縮ペレットを8モル尿素に再懸濁し、Dihi 3エトールの溶液を水に加えて、最終濃度を10ミリモルにします。
チューブをインキュベーターに移し、1400RPMで摂氏37度で2時間振とうします。次に、サンプルを室温に冷却し、再構成したイオタアセトアミドの溶液を水に加え、最終濃度25ミリモルにします。混合物を暗闇で30分間インキュベートします。
室温で、100ミリモルの重炭酸アンモニウムで2モル尿素濃度に希釈し、次にP PGA F.サンプルをインキュベーターに移し、1400RPMで2時間振とうします。摂氏37度で、エンドプロテアーゼを加え、混合物にスライスCをスライスし、摂氏37度で1400RPMで2時間振とうします。次に、トリプシンを追加し、摂氏37度で一晩1400RPMで振とうします。
濁った溶液は、トリプシンの2番目のデリクワッドで一晩の消化後に明確になり、さらに2時間振ってトリプシンピペット50%triフルオロ酢酸を混合物に不活性化し、pHが2未満になるまで1マイクロリットルの増分で混合します。pH紙に1マイクロリットルのペプチド溶液を見つけて、pHをモニターします。溶液を室温で5分間遠心分離します。
最後に、上清を清潔で保持力の低いチューブに集めます。ECMペプチド溶液はマイナス20°Cで保存してください。ミラーリング肺組織の脱細胞化によるウェスタンブロットは、中間画分中のASIN、β、1、actin GA、dh、およびヒストンなどの細胞内成分の抽出を示しています。
これらの成分はECM画分からほぼ完全に存在しませんが、わずかなヒストン汚染が残っています。対照的に、コラーゲン1はECM画分で高濃度ですが、他の画分では検出されないため、抽出の中間ステップでコラーゲンが失われないことが示唆されます。同様の結果は、ヒト記憶がんでも得られました。
異種移植コラーゲン1は、ECM画分で有意に濃縮され、CS画分の損失はわずかでした。ECM画分には、その発生後も残留アクチン汚染が残っていました。この手法は、生物学者や臨床医が正常組織と疾患組織の細胞外マトリックスの複雑さを探求する道を開きました。
概要
このプロトコルは、組織から細胞外マトリックス（ECM）タンパク質を濃縮し、質量分析を用いてその組成を分析する方法を概説しています。このプロセスには、組織の破壊、脱細胞化、および詳細な分析のためのその後のペプチド消化が含まれます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生化学
- 質量分析
背景
- ECMの組成を理解することは、組織の機能と病理学の洞察に不可欠です。
- この方法は、正常組織と病変組織（がんを含む）の両方に適用できます。
- 質量分析は、複雑なタンパク質混合物を分析するための強力なツールを提供します。
- 脱細胞化は、細胞成分を除去することでECMタンパク質を単離するのに役立ちます。
研究の目的
- 様々な組織からのECMのタンパク質組成を特徴づける。
- 健康と疾患におけるECMの役割の理解を深める。
- ECMタンパク質分析のための信頼性の高いプロトコルを開発する。
使用した方法
- ECMタンパク質を濃縮するための組織の均質化と脱細胞化。
- 細胞分画を分離するための連続遠心分離。
- 質量分析のための特定の酵素を使用したペプチド消化。
- ECM濃縮の品質を確認するためのウェスタンブロッティング。
主な結果
- コラーゲンはECM分画で著しく濃縮され、効果的な単離を示しています。
- 脱細胞化プロセス中に細胞内成分はほぼ完全に除去されました。
- 質量分析によって詳細なECMタンパク質プロファイルが明らかになりました。
- 結果は、がん組織を含む様々な組織タイプで一貫していました。
結論
- このプロトコルはECMタンパク質を成功裏に単離し、特徴づけます。
- この方法は研究目的のために様々な組織に適用できます。
- 得られた洞察は、疾患メカニズムにおけるECMの役割の理解に貢献できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular matrix (ECM) composition enables target validation and biomarker discovery in fibrosis, cancer, and cardiovascular diseases. This method supports mechanistic de-risking by isolating disease-relevant ECM proteins for downstream mass spectrometry analysis. It provides predictive confidence in target selection by linking ECM remodeling to pathological mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ECM protein composition to validate therapeutic targets in disease-associated remodeling.
- Operational Value: Depletes intracellular contaminants to improve target specificity and reduce false positives in target validation assays.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates ECM-enriched peptide samples suitable for quantitative mass spectrometry-based screening of ECM modulators.
- Operational Value: Standardizes ECM isolation across tissue types, improving assay reproducibility and cross-platform comparability.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Supports disease-relevant system modeling by enabling ECM profiling in normal and tumorigenic tissues.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating ECM changes with disease progression in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, providing ECM-specific molecular insights that inform early target prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating ECM fractions to clarify disease-associated matrix composition and pathway involvement.
- Screening: Enables assay-ready ECM peptide preparations for screening compounds that modulate ECM deposition or degradation.
- Analytics: Generates quantitative peptide readouts via mass spectrometry to compare ECM composition across experimental conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by enabling ECM biomarker profiling in disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable ECM isolation platform applicable across multiple disease areas and tissue types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in ECM-mediated signaling.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized decellularization and digestion workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of ECM targets before costly preclinical investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on disease-specific ECM remodeling signatures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, protein biochemistry, and mass spectrometry sample preparation.
- Depends on access to centrifuges, tube rotators, incubators, and low-retention tubes for peptide recovery.
- Necessitates standardization of buffer conditions and incubation times across laboratories for consistent ECM enrichment.
- Requires adaptation of buffer volumes and enzymatic digestion parameters for varying tissue densities and collagen content.
- Limited by potential co-isolation of highly abundant ECM proteins that may mask lower-abundance regulators in mass spectrometry detection.
