脳組織における測定細胞外イオンの信号のための、二連と同心微小電極

この手順の全体的な目的は、脳組織の細胞外空間におけるイオンダイナミクスを検出および分析することです。イオンの一過性変化の測定は、ダブルバレル型または同心円筒型設計に基づいて作製可能なイオン選択性マイクロ電極を用いて行われます。最初のステップとして、実験用バス内でマイクロ電極の校正を行います。

次に、電極をマウス海馬の急性切片に刺入して記録を行い、伝達物質であるグルタミン酸またはグルタミン酸アゴニストを投与して細胞外イオンシフトを誘発させます。グルタミン酸が後シナプス棘のイオンチャネル型受容体に結合してそれを開口させると、細胞内へのナトリウムの流入と細胞外へのカリウムの流出が起こります。最終的に、これにより細胞外ナトリウムの減少と細胞外カリウムの増加が生じ、これをイオン選択性マイクロ電極で検出します。

本手法は、脳内における細胞外イオン調節および活動誘発性鉄過渡応答を研究するために用いられます。ここでは、2種類のイオン選択性微小電極の作製と校正について説明します。また、神経伝達物質の投与に応答して生じる細胞外カリウムまたはナトリウムの変化を、急性脳組織切片を用いて測定する方法を示します。

本手順は、Nicole Hark氏とSimon氏によって実演されます。まず、イオン感受性バレルに使用するフィラメント付きのボアシリケートガラスキャピラリーと、後のリファレンスバレルに使用する別のキャピラリーを準備します。次に、2液混合型接着剤または小さなアルミホイルの断片を用いて、長いキャピラリーと短いキャピラリーの両端を固定します。

残存水分を除去するため、ダブルキャピラリーを電気炉にて60 °Cで1時間加熱します。その後、使用するまで電極をデシケーター内で保存します。リボルバーチョークを用いて、ダブルキャピラリーを垂直型プラーの中央に配置します。キャピラリーの伸長を防ぐためにチョークを使用してください。

リボルバーを水平に回転させることができるまで、ガラスが十分に柔らかくなるまでコイルを静かに保持します。冷却後、180度回転させてチャックし、メカニカルブレイクを取り除きます。2本の鋭いダブルバレルキャピラリーを作成するため、キャピラリーを延伸させる2回目の加熱プロトコルを適用します。

二重キャピラリーのチップ径は、1 µmに近いものである必要があります。次に、細菌の定着を防ぐため、リファレンスバレルをチップの先端まで蒸留水で満たします。以下の手順では、二重バレルキャピラリーのチップを上にした状態で、専用のホルダーに設置します。

次に、このホルダーをあらかじめ加温したHMDSが入った広口瓶にセットし、70分間インキュベートします。その後、キャピラリーを金属製スタンドに移します。続いて、あらかじめ加熱した電気炉に2時間入れ、コーティング後の両方のバレルを乾燥させます。使用するまで、キャピラリーはデシケーター内で乾燥した状態に保持してください。

実験当日、シリコン処理されたバレル先端に2〜3 µLのイオン選択性センサーを充填し、イオン選択性電極を準備します。次に、ナトリウム感受性マイクロ電極の場合は100 mM 塩化ナトリウムを、カリウム感受性マイクロ電極の場合は100 mM 塩化カリウム生理食塩水をバレルに逆充填します。この操作中に、追加の気泡が入らないように注意してください。

作製に成功し、センサーが適切に充填されていれば、バックフィルに対してセンサー表面がはっきりと視認できる凹面として現れます。次に、リファレンスチャネルを充填し、両方のバレルに塩素化銀線を挿入して、各バレルをデンタルワックスで封印します。この手順では、水平型プラーを用いて2 mmのキャピラリーを引き出し、短いテーパーと4 µmの先端径になるように調整してください。

使用直前に、シリコン処理したキャピラリーに0.2 µLのセンサーを充填します。内部キャピラリーを準備するには、細径キャピラリーを引いて、長いテーパーと鋭い先端を持つ2本のキャピラリーを作成します。その後、それらを100 mM塩化ナトリウムまたは100 mM塩化カリウム生理食塩水で満たします。

センサーを充填したキャピラリーと生理食塩水を充填したキャピラリーを、カバーガラスで製作したカスタムストッパーの上に、互いに直線状に並べて配置します。小さい方のキャピラリーを、大きい方のキャピラリーに部分的に挿入します。次に、キャピラリーを別のカバーガラスに固定します。

モデリングクレイを用いてキャピラリーを顕微鏡のステージに固定し、100倍の倍率で観察します。マイクロマニピュレーターに取り付けたガラス棒を用いて、外側キャピラリーの先端と内側キャピラリーの先端の距離がおよそ5 µmになるまで、外側キャピラリーを内側キャピラリーに向けてゆっくりと前進させます。外側キャピラリーの開口端を歯科用ワックスで内側キャピラリーに固定し、銀線を挿入します。

参照電極を準備するために、垂直型プラーでフィラメントを用いてキャピラリーを引き、上のピペットを廃棄した後、下のチャックを開き、下のピペットを約5 mm持ち上げます。再びチャックを閉じ、下の電極の先端が加熱コイルの約5 mm上に位置するまで持ち上げます。その後、コイルを加熱し、ピンセットを使用して先端を側方に約45度曲げます。

メインシャフトと平行になるように、チップをさらにマイナス45度ほど曲げます。次に、リファレンスバレルにリン酸緩衝生理食塩水（HBSS）を満たします。そこに塩化銀線を挿入し、歯科用ワックスでバレルを密封します。

このステップでは、イオン感受性電極と参照電極の両方をマイクロマニピュレーターに取り付け、A CSFで灌流された実験チャンバー内に降ろします。実体顕微鏡下で、塩素化銀線を差動増幅器のヘッドステージの各入力端子に接続します。その後、電極抵抗を測定します。

その後、電圧信号をゼロに調整し、キャリブレーションのための記録を開始します。安定したベースラインが得られたら、測定対象のイオンを規定濃度で含む生理食塩水に切り替えます。次に、厚さ 250 micron の海馬スライスを実験チャンバーに移し、グリッドで固定します。

校正済みのイオン選択性マイクロ電極をスライス表面まで降ろします。次に、電極をさらに約 50 microns、CA1 領域の stratum radiatum まで挿入します。トランスミッターアゴニストを投与するため、適用ピペットに 0.5 millimolar のグルタミン酸を満たします。

ピペットをマイクロマニピュレーターに取り付け、圧力印加装置と接続します。次に、印加用ピペットを組織内に下げ、イオン選択性マイクロ電極の先端付近に慎重に配置します。40 millibarsの圧力印加を開始します。

ここに示すのは、バス液のナトリウム濃度変化に応答した、ダブルバレル電極および同心電極のリファレンスバレルの電圧変化です。また、これらはバス液のナトリウム濃度変化に応答した、ダブルバレル電極および同心電極のナトリウム電位の電圧変化です。この図は、バス液のナトリウム濃度の半対数プロットに対する、両電極のナトリウム電位の電圧を示しています。

線形プロットにより、両方の電極で約48ミリボルトの傾きがあることがわかります。ここでは、バス内の急速な変化（ナトリウム濃度が152ミリモルから70ミリモルへ変化）に対する、ダブルバレル電極および同心円状電極の応答を示します。

同心電極の応答速度が大幅に速いことに注目してください。この図は、ダブルバレル電極と同心電極によって検出された細胞外ナトリウムの一過性変化を示しています。バーで示されている通り、10 millimolarのアスパラギン酸を120秒間バス灌流させることで、参照バレルの電位の一過性変化と細胞外ナトリウム濃度の一過性変化が誘導されました。また、この図では、10 millimolarのグルタミン酸を0.2秒間局所圧入することで、参照バレルの電位の一過性変化と細胞外ナトリウム濃度の一過性変化を誘導しています。

この条件下では、円錐電極の応答速度が大幅に速くなることに注意してください。この手順を行う際は、適切なサイランシング（静止化）が、鉄選択性マイクロ電極を正常に作製するための重要なステップであることを念頭に置いてください。このビデオを視聴することで、脳組織における細胞外鉄の過渡的な検出のために、これらの電極をどのように準備し使用するかについて、十分に理解できたはずです。