未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析

本実験の全体的な目的は、コレステロール除去剤の有無における、パルス低周波超音波によるヒト白血病細胞集団への損傷効率および再現性を評価することです。これは、超音波処理システムの洗浄および安定性の評価を行うことで達成されます。その後、メチル-β-シクロデキストリンの有無の条件下で、ヒト白血病細胞に超音波処理を施します。

次に、自動細胞計数装置を用いて、細胞生存率ならびに超音波処理およびコレステロール除去の効果を評価します。白血病細胞のミトコンドリア活性は、XTTアッセイにより評価されます。最終的に、これらのデータは、低周波超音波が悪性細胞に損傷を与えるために利用可能であり、コレステロール除去剤の使用によってその効果が増強されることを示唆しています。

当研究室では、超音波の抗腫瘍効果と超音波の効果を増強させる特殊な薬剤を組み合わせた新しい治療形態であるソナーナンプ治療に関心を持っています。本プロトコルでは、腫瘍細胞と正常細胞の両方の音響感受性を評価し、さらなる前臨床研究に値する潜在的な化学療法アプローチを決定します。一般的に、この手法に不慣れな方は、超音波システムの安定性を評価するために使用する装置の操作に苦労する場合があり、これらの装置を最適に適用する方法を習得するまでに時間を要することがあります。

洗浄および安定化の手順は、ソニケーションシステムの評価において、再現性のある結果を得るために不可欠であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが重要となります。実験を開始する前に、クロロホルムと綿棒を使用して、ホーンとコンバーターの接合部を洗浄してください。次に、ホーンとコンバーターのネジ山に軽油を塗布します。

さらに金属片、錆、または酸化物の蓄積を取り除いた後、クロロホルムを使用してユニオンからオイルやその他の汚染物質を除去し、ホーンをコンバーターに再装着します。システムを適切にトルク管理するには、ホーンをカップの底部から引き出し、コンバーター上部付近にある3つの小さな穴のいずれかにスロットレンチを挿入します。次に、1/2インチのクローフットレンチを取り付けたトルクレンチをホーンのスロット部分に配置し、トルクメーターが39.99 foot poundsを示すまで、標準的な時計回りに締め付けます。

締め付けた後、コンバーターとホーンをカップに戻し、各部品をリングスタンドに直立状態で固定して、コンバーターを電源に再接続し、システムをパルス投与に設定します。1秒間の超音波処理と1秒間のパルス間隔を用い、システムを目的の振幅に調整して、sauna Fireシステムの強度と機能を評価します。まず、キャビテーションメーターを1.5 centimetersの位置に保持し、メータープローブの表面に気泡がないように注意してください。

キャビテーションメーターの画面を確認し、システムが適切な強度で動作していることを確認してください。次に、12.5 millilitersの水が入ったサンプルバイアルにハイドロフォンセンサーを完全に浸し、リングスタンドを使用してハイドロフォンを吊り下げます。波形特性の安定性を確認するため、ハイドロフォンをオシロスコープの入力端子に接続し、明確な正弦波が出ていることを確認してください。異常波が発生するとシステムの周波数が変動する可能性があるためです。

超音波処理に向けて細胞を調製するため、まず、調製したばかりの培地を用いて、25 cm²フラスコに1 mLあたり4 × 10⁴個の密度で細胞を播種します。トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定し、培養液が目的の濃度に達するまで、37 °C、5% CO₂条件下で培養します。細胞が超音波処理に適した状態になったら、真空ポンプとブフナーフラスコを用いて、脱イオン蒸留水を脱気します。

次に、ホーンの先端から15 mm上の位置まで水を満たします。脱気水を用いてシステムを約7分間運転します。その後、3 mLの細胞を20 mLのガラス製シンチレーションバイアルに移し、バイアルを保持装置に取り付けます。

次に、ホールドデバイスをカップホーンの上部に装着し、スライド機構を使用して、水面におけるホールドデバイスの高さをホーン上端から15 millimetersに設定します。次に、33%および50%の振幅で、1秒間の超音波パルスを1秒の間隔で3回照射して細胞をソニケーションし、ソニケーション後の細胞生存率をトリパンブルー排除法で評価します。細胞損傷を評価するために、Z2粒子解析装置の開口部を等張生理食塩水で少なくとも2回洗浄します。

次に、超音波処理した細胞100 µLを20 mLの等張生理食塩水に加え、細胞サンプルをカウンターホルダーに移します。その後、プラットフォームをアパーチャまで上昇させ、メーカーの指示に従って細胞損傷、生存率、およびデブリを分析します。XTTアッセイにより超音波処理した細胞の生存率を評価するには、1から3の範囲で超音波処理を行います。

XTTキットで評価するための様々な損傷範囲を形成させるため、1秒間のパルスを1秒間隔で照射し、その後、細胞を遠心分離して、新鮮に調製した増殖培地を用いてペレットを1 × 10⁵ cells/mLに再懸濁します。次に、個別のフラットボトム96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ播種し、ブランクの吸光度測定用として完全増殖培地のみを100 µL含むコントロールウェルを3つ含め、3連（トリプリケート）で調製します。

アッセイ当日の朝に細胞を24時間インキュベートし、37°Cに加温したXTTおよび活性化試薬の分注液を、溶液が透明になるまで静かに swirling（旋回混和）させます。次に、5 mLのXTT試薬に活性化試薬0.1 mLを加えます。続いて、活性化させたXTT溶液50 µLをU937およびTHP-1を接種したプレートの各ウェルに加え、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。

2時間後、プレートを軽く振って陽性ウェル内のオレンジ色の染料を均一に分散させ、マイクロプレートリーダーを用いて450から500ナノメートルの波長で吸光度を測定します。最後に、すべてのアッセイウェルの吸光度を、630から690ナノメートルの波長で再度測定します。予想通り、振幅33%の場合よりも50%で超音波処理した細胞集団において、より広範な細胞損傷が観察されます。

しかしながら、33%の振幅では、薬剤を投与した際のさらなる損傷を検出することが可能です。本実験では、コレステロール除去剤であるメチルβシクロデキストリンの用量依存的な影響が、U 9 37細胞の超音波感受性を増強させる点について評価しました。

メチル-β-シクロデキストリンで処理していない細胞の生存率は、未処理の細胞と同程度でしたが、1秒間×40 kHzの超音波を3回照射した後に生存率は著しく低下しました。さらに、XTTアッセイによる評価の結果、超音波照射後の生存率の低下は用量依存的であると考えられ、コレステロール除去剤であるメチル-β-シクロデキストリンの5 mM処理で細胞数の最大低下が見られ、次いで1 mM、0.5 mMの順となりました。THP-1細胞はU937細胞よりもわずかに超音波耐性が高いと考えられますが、これら両方のヒト白血病細胞株において、用量依存的な損傷が認められました。

さらに、高濃度のmethyl beta cyclodextrinとより多数の超音波パルスを組み合わせることで、U 9 37細胞およびTHP one細胞の両方において、XTTから水溶性の鮮やかなオレンジ色の誘導体への還元が最も低く抑えられました。これは、両方の細胞株において細胞生存率およびミトコンドリア活性がより低くなったことに対応しています。本手順に続き、細胞骨格標的薬や活性酸素種生成剤などの他の音響感受性増強剤を用いて、音響感受性の増強能を評価することができ、これにより前臨床有効性を検討可能な新しい治療アプローチを確立できます。本手順を実施する際は、TCおよびZ twoカウンターから得られたSONデータを適切に整理することが重要です。これらのデータは治療プロトコルの有効性に関する詳細な情報を提供しており、整理を怠るとそれらの情報を失う可能性があるためです。

ロジスティカルスキームを使用しない場合、このビデオを視聴することで、前臨床in vitroモデルにおいて低周波超音波を潜在的なアノセンシタイザーと組み合わせて使用し、その治療的有用性を評価する方法について十分に理解できるはずです。