Name: 未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ低周波超音波によるヒト白血病細胞への損傷効果と、メチルベータシクロデキストリンを用いたコレステロール除去が超音波感受性を増強するメカニズムについて。XTTアッセイと自動細胞計数で細胞生存率を評価する方法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者は、私たちのシステム設計に関連する事柄において革新的な支援をしてくれたシラキュース大学物理学部ワークショップのスタッフに感謝したいと思います。

1.クリーニングセルソニシステム<ol><li>ホーンとコンバータクロロホルムを使用し、綿の綿棒労働組合の間を清掃してください。さらに、金属の削りくず、さび、または酸化の蓄積を除去するために、ホーンとコンバータのスレッドに軽油や鉱物油を適用します。 </li><li>油でスレッドを拭いた後、組合から石油やその他の汚染物質を除去するためにクロロホルムを使用します。 </li></ol> 2.セルソニファイアーを再組み立てし、システムを設定します<ol><li>コンバータにホーンを取り付けます。システムを適切にトルクに、カップ（ 図2A）の底部からホーンを引いて、カップアセンブリから組み立てコンバータとホーンを取り外します。変換器（ 図2B）の上部近くに三つの小さな穴の内側にスロットレンチを置きます。そして、ホーン（ 図2B）のスロット部分に½インチのカラスの足を取り付けたトルクレンチを置きます。秒で締めtandard時計方向トルク計は、製造業者16が推奨するトルク、54.23 N。M（ 図2C）を読み込むまで。締めコンバータを取り付け、カップに戻すホーン、および直立位置にあるリングスタンドにホーンとコンバーターを搭載。実験的なパルス投与のためのシステムを設定する前に、電源へのコンバータを取り付けます。 </li><li>パルスはパルス間1秒で超音波処理の1秒を使用して投与するためのシステムを設定します。異なる投与モデルは、他の実験条件のために使用することができます。このような水の量とホーン直径などの多くの変数が、潜在的にこの投薬の変更を必要とするであろう。上記の細胞試料の種類、量、および濃度を用いて、経験的データおよび観察は、この投与計画の処方につながっています。 </li><li>所望の振幅にシステムを調整します。このプロトコルでは、sonosensitの効果をレンダリングすることになる完全な細胞破壊を防止するために、33％および50％の振幅を使用しゲージすることが困難または不可能izers。 注：この研究では振幅が比較されます。 </li></ol> 3.システムの強度や機能を評価します<ol><li>サンプルの超音波処理のレベルは1.5センチ、でキャビテーションメーターを保持します。システムが期待される強度で実行されていることを評価するために測定値を注意してください。現在のシステムと水のレベルを使用して、33％の振幅および50％の振幅のために115〜125 W / cm 2の 100〜110 W / cm 2の間で期待しています。直接W / cm 2の中にキャビテーションエネルギーを表すメータ表示からキャビテーションメーターの測定値を注意してください。水の表面でこれらの測定値を取り、泡がメートルのプローブの面に存在しないことを確認します。 注：これらの手順は、ホーン上記アクセス用のキャップなしで行われることに留意することが重要です。彼らはすべての超音波処理後に繰り返す必要はありません。むしろ、彼らは、洗浄再組み立て、システムを設定した後に実行する必要があります。 </LI&gt; <li>完全にハイドロフォンセンサーを浸漬するために、水12.5ミリリットルを含有するサンプルバイアルにハイドロホンを配置します。リングスタンドを使用して、ハイドロフォンを一時停止します。 </li><li>波形特性を評価するために、オシロスコープの入力にハイドロフォンを接続します。異常な波が、メーカーの仕様からシステムの周波数を変更することができるように、明確な正弦波のためのオシロスコープを調べます。キャビテーションメーターとオシロスコープの両方が周波数の読みを与えるが、唯一のオシロスコープは、障害が発生したシステムまたは不適切なアセンブリを示している異常な波が表示されます。 </li></ol>細胞および培地の4準備<ol><li> 240ミリリットルイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）、50mlのウシ胎児血清を使用してメディアを準備します。温度の急激な上昇は、血清安定性の妥協につながることができますように、湯浴中でウシ胎児血清を解凍しないでください。 240μlのゲンタマイシンを50mg / mlおよび5ミリリットルのペニシリンは、コンバイン/標準的な培養フラスコに100Xをストレプトマイシン、培地に加えます。 4℃でメディアを保管してください。 </li><li>シードU937細胞において約4×10培地を用いて調製した25cm 2のフラスコ中で4細胞/ ml。 TC20セルカウンターとマイクロ遠心チューブに細胞を15〜20μlのトリパンブルーの15〜20μLを入れ、内容物を混合することにより、トリパンブルー排除を用いて濃縮し、生存のために細胞を評価します。 Pipette15-20 TC20サンプリングスライドに、この混合物のμL、およびTC20セルカウンターにスライドを配置することによってカウントを開始します。 </li><li> 37℃で細胞をインキュベートし、5％CO 2、およびトリパンブルー排除およびTC20セルカウンターを用いて細胞生存率を確認してください。細胞を、適切な濃度であり、および/または適切な時間枠のためsonosensitizers、転送20mlガラスシンチレーションバイアルに培養フラスコから細胞を3mlで処理されたとき。このプロトコルでは、48時間、U937細胞を成長し、その後0.5、1で処理または30分間、5 mMのMeβCDは十分に超音波処理の前に、細胞のコレステロールを枯渇させます。 </li></ol> 5.細胞超音波処理<ol><li>ドガは、脱イオン真空およびブフナーフラスコを用いて水を蒸留しました。カップホーンに水を移し、ホーンの最上部より上15mmのレベルに記入してください。超音波処理プロセスは数分の間、さらに水を脱ガスが発生し、システムは、超音波処理をサンプリングする前に実行されていない場合は、実験の過程で不整合が生じることができます。そのため、超音波処理をサンプリングする前に〜7分間システムを実行します。 </li><li>保持装置に細胞を含むシンチレーションバイアルを取り付けます。そして、カップホーンの上部に保持装置を接続して（スライド機構を用いて水の表面での）ホーンの上部から15mmの高さに設定します。 </li><li>細胞は、典型的には、1秒は、これらのパルスの各々の間に間隔をあけて、超音波の3 1秒のパルスを用いて超音波処理します。このためプロトコル、上記パルス投与を使用して33％と50％の振幅で超音波処理細胞。 </li></ol> 6.損傷後の超音波処理のための細胞を評価します<ol><li>トリパンブルーとTC20セルカウンターを用いて損傷し、生存のために懸濁した細胞を評価します。また、Z2カウンタを使用してサンプルを分析します。 Z2計数分析のために、ピペット20ミリリットルに100μlの細胞懸濁液、等張生理食塩水（200：1の比）。分析の前に、等張生理食塩水を用いて少なくとも2倍Z2粒子分析器の開口部を洗い流します。カウンターホルダーにZ2のサンプルを配置し、カウントを開始する前に、開口部のプラットフォームを上げます。 </li><li>製造業者によって提供されるソフトウェアを使用して、TC20及びZ2カウンターからデータを取得します。細胞の損傷、生存能力、および超音波処理から細胞破片を作成するためのこれらのデータを分析します。 </li></ol> 7. XTTアッセイは、細胞生存率を決定し、処理されたU937及びTHP1細胞のミトコンドリア活性に<ol><li>プリオXTTアッセイを、R、同じ条件下でU937及びTHP1細胞を成長させます。超音波処理の前に30分間MeβCDの同じ濃度範囲で細胞を前処理します。細胞は今1-3 1秒パルスの範囲を用いて、超音波処理している以外は前と同じ超音波パラメータを使用すると、評価するXTTキットの損傷の範囲を開発するために1秒間隔を置いて配置しました。 注：これらの手順の多くは、XTTキットのマニュアルから直接取得され、唯一の興味研究所の便宜のために繰り返されます。 </li><li> 10分間200×gで遠心分離することによって細胞を収集します。前述した増殖培地中で細胞ペレットを再懸濁します。約1×10 5細胞/ mlで再懸濁細胞。ウェルを三連で平底96ウェルマイクロタイタープレートに当たり100μlの種子におけるU937細胞を、次いで、別個の96ウェルプレートを使用してTHP1細胞について繰り返します。ブランク吸光度の測定値として単独で完全増殖培地100μlを含む3対照ウェルを含みます。その後、2のために接種したプレートをインキュベート4時間。 </li><li> XTT試薬および使用前に37℃での活性化試薬の2つのアリコートを解凍。透明な溶液が得られるまで穏やかにアリコートを旋回。 XTT試薬5.0 mlの活性化試薬を0.1mlを加え、1枚の96ウェルマイクロタイタープレートアッセイのための十分な活性化XTT溶液を形成します。他のプレートのためのプロセスを繰り返します。 </li><li>各ウェルに活性化 - XTT溶液50μlを追加します。 2時間の細胞培養CO 2のインキュベーターにプレートを返します。静かに均等に陽性ウェルにオレンジ色を配布するインキュベーション期間の後、プレートを振ります。マイクロタイタープレートリーダーを用いて450〜500 nmの波長の間の波長で細胞を含有するアッセイウェルおよびブランクバックグラウンド対照ウェルの吸光度を測定します。 </li><li>いずれのブランク対照ウェルを用いてマイクロタイタープレートリーダーをゼロまたは特定の結果から、その平均値を減算します。 wavelengで再びすべてのアッセイウェルの吸光度を測定します第630から690 nmの間で得られた450〜nmの値から値を減算します。注：この第二の吸光度決意は、アッセイの結果から、非特異的な測定値を排除するのに役立ちます。 XTTアッセイは、両方の細胞株について4回繰り返しました。 </li></ol>

<ol><li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The promise of sonodynamic therapy.</a> Cancer Metastasis Rev. 33 (1), 143-160 (2014).</li>
<li>Semins, M. J., Trock, B. J., Matlaga, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+shock+wave+rate+on+the+outcome+of+shock+wave+lithotripsy%3A+A+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">The effect of shock wave rate on the outcome of shock wave lithotripsy: A meta-analysis.</a> J Urol. 179 (1), 194-197 (2008).</li>
<li>Pace, K. T., Ghiculete, D., Harju, M., Honey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shock+Wave+Lithotripsy+at+60+or+120+shocks+per+minute%3A+A+randomized%2C+double-blind+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+Urol%22%5BJournal%5D)">Shock Wave Lithotripsy at 60 or 120 shocks per minute: A randomized, double-blind trial.</a> J Urol. 174 (2), 595-599 (2005).</li>
<li>McClain, P. D., Lange, J. N., Assimos, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+shock+wave+lithotripsy%3A+a+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Urol%22%5BJournal%5D)">Optimizing shock wave lithotripsy: a comprehensive review.</a> Rev Urol. 15 (2), 49-60 (2013).</li>
<li>Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healing+sound%3A+the+use+of+ultrasound+in+drug+delivery+and+other+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Healing sound: the use of ultrasound in drug delivery and other therapeutic applications.</a> Nat Rev Drug Discov. 4 (3), 255-260 (2005).</li>
<li>Cordeiro, E. R., Cathelineau, X., Thüroff, S., Marberger, M., Crouzet, S., de la Rosette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+definitive+treatment+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound (HIFU) for definitive treatment of prostate cancer.</a> BJU Int. 110 (9), 1228-1242 (2012).</li>
<li>Li, P. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+treatment+for+patients+with+unresectable+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatobiliary+Pancreat+Dis+Int%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound treatment for patients with unresectable pancreatic cancer.</a> Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 11 (6), 655-660 (2012).</li>
<li>Xiaoping, L., Leizhen, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+of+high+intensity+focused+ultrasound+%28HIFU%29+for+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hyperthermia%22%5BJournal%5D)">Advances of high intensity focused ultrasound (HIFU) for pancreatic cancer.</a> Int J Hyperthermia. 29 (7), 678-682 (2013).</li>
<li>Lukka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-intensity+focused+ultrasound+for+prostate+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Oncol+%28R+Coll+Radiol%29%22%5BJournal%5D)">High-intensity focused ultrasound for prostate cancer: a systematic review.</a> Clin Oncol (R Coll Radiol). 23 (2), 117-127 (2011).</li>
<li>So, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIFU+ablation+is+not+a+proven+standard+treatment+for+localized+prostate+cancer%29%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Urol+Assoc+J%22%5BJournal%5D)">HIFU ablation is not a proven standard treatment for localized prostate cancer).</a> Can Urol Assoc J. 5 (6), 424-426 (2011).</li>
<li>Crouzet, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-gland+ablation+of+localized+prostate+cancer+with+high-intensity+focused+ultrasound%3A+oncologic+outcomes+and+morbidity+in+1002+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Urol%22%5BJournal%5D)">Whole-gland ablation of localized prostate cancer with high-intensity focused ultrasound: oncologic outcomes and morbidity in 1002 patients.</a> Eur Urol. 65 (5), 907-914 (2014).</li>
<li>Tezel, A., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+inertial+cavitation+bubbles+with+stratum+corneum+lipid+bilayers+during+low-frequency+sonophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Interactions of inertial cavitation bubbles with stratum corneum lipid bilayers during low-frequency sonophoresis.</a> Biophys J. 85, 3502-3512 (2003).</li>
<li>Tang, H., Wang, C. C., Blankschtein, D., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+investigation+of+the+role+of+cavitation+in+low-frequency+ultrasound-mediated+transdermal+drug+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">An investigation of the role of cavitation in low-frequency ultrasound-mediated transdermal drug transport.</a> Pharm Res. 19 (8), 1160-1169 (2002).</li>
<li>Ueda, H., Mutoh, M., Seki, T., Kobayashi, D., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+cavitation+as+an+enhancing+mechanism+of+low-frequency+sonophoresis+for+transdermal+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Acoustic cavitation as an enhancing mechanism of low-frequency sonophoresis for transdermal drug delivery.</a> Biol Pharm Bull. 32 (5), 916-920 (2009).</li>
<li>Trendowski, M., Yu, G., Wong, Y., Aquafondata, C., Christen, T., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+real+deal%3A+Using+cytochalasin+B+in+sonodynamic+therapy+to+preferentially+damage+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">The real deal: Using cytochalasin B in sonodynamic therapy to preferentially damage leukemia cells.</a> Anticancer Res. 34 (5), 2195-2202 (2014).</li>
<li>Sonifier Cell Disrupter Model SLPeEDP. , Branson Ultrasonics Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf">http://www.emersonindustrial.com/en-US/documentcenter/BransonUltrasonics/Sonifier_Brochure.pdf</a> (2010).</li>
<li>Lagneaux, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonic+low-energy+treatment%3A+A+novel+approach+to+induce+apoptosis+in+human+leukemic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Ultrasonic low-energy treatment: A novel approach to induce apoptosis in human leukemic cells.</a> Exp Hematol. 30 (11), 1293-1301 (2002).</li>
<li>Krasovitskia, B., Frenkelb, V., Shohama, S., Kimmel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramembrane+cavitation+as+a+unifying+mechanism+for+ultrasound-induced+bioeffects%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Intramembrane cavitation as a unifying mechanism for ultrasound-induced bioeffects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108 (8), 3258-3263 (2011).</li>
<li>Sundaram, J., Mellein, B. R., Mitragotri, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+analysis+of+ultrasound-induced+permeabilization+of+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical analysis of ultrasound-induced permeabilization of cell membranes.</a> Biophys J. 84 (5), 3087-3101 (2003).</li>
<li>Mizrahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+intensity+ultrasound+perturbs+cytoskeleton+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Low intensity ultrasound perturbs cytoskeleton dynamics.</a> Soft Matter. 8 (8), 2438-2443 (2012).</li>
<li>Chen, X., Leow, R. S., Hu, Y., Wan, J. M., Yu, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-site+sonoporation+disrupts+actin+cytoskeleton+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Single-site sonoporation disrupts actin cytoskeleton organization.</a> J R Soc Interface. 11 (95), 20140071(2014).</li>
<li>Trendowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+enlargement+of+leukemia+cells+using+cytoskeletal-directed+agents+and+cell+cycle+growth+control+parameters+to+induce+sensitivity+to+low+frequency+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Preferential enlargement of leukemia cells using cytoskeletal-directed agents and cell cycle growth control parameters to induce sensitivity to low frequency ultrasound.</a> Cancer Lett. In press, (2015).</li>
<li>Dumontet, C., Sikic, B. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+action+of+and+resistance+to+antitubulin+agents%3A+Microtubule+dynamics%2C+drug+transport%2C+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of action of and resistance to antitubulin agents: Microtubule dynamics, drug transport, and cell death.</a> J Clin Oncol. 17 (3), 1061-1070 (1999).</li>
<li>Verrills, N. M., Kavallaris, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+targeting+of+tubulin-binding+agents%3A+lessons+from+drug+resistance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Improving the targeting of tubulin-binding agents: lessons from drug resistance studies.</a> Curr Pharm Des. 11 (13), 1719-1733 (2005).</li>
<li>Trendowski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inherent+metastasis+of+leukaemia+and+its+exploitation+by+sonodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">The inherent metastasis of leukaemia and its exploitation by sonodynamic therapy.</a> Crit Rev Oncol Hematol. In press, (2014).</li>
<li>Trendowski, M., Wong, V., Wellington, K., Hatfield, S., Fondy, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerated+doses+in+zebrafish+of+cytochalasins+and+jasplakinolide+for+comparison+with+tolerated+doses+in+mice+in+the+evaluation+of+pre-clinical+activity+of+microfilament-directed+agents+in+tumor+model+systems+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tolerated doses in zebrafish of cytochalasins and jasplakinolide for comparison with tolerated doses in mice in the evaluation of pre-clinical activity of microfilament-directed agents in tumor model systems in vivo.</a> In Vivo. 28 (6), 1021-1031 (2014).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

最適な結果を達成するために、特別なケアは慎重にサンプルを配置し、コンバータ·ホーン組合をきれいにするために取られるべきです。ホーンのサンプルの配置は、ホーンからの距離を変更すると、音響焦点を変化させ、したがって、サンプルがさらされるエネルギーを変化させるように、一貫性の細胞破壊を得るために重要です。カップホーン内の音響エネルギーは、最大キャビテーションの位置を見つけるために、キャビテーションメーターを用いてマッピングすることができます。また、キャビテーションメーター、オシロスコープと一緒に細胞がさらされている音の強さを決定するために不可欠であるだけでなく、波形の均一性。したがって、これらの機器は、システムに問題を検出し、トラブルシューティングは、システムの不安定性を修正するために必要とされるかもしれないものを判断するために使用されるべきです。 前述のように、低周波数システムは、実験を通して、さらに脱ガスに水を作用していない場合のために実行することができます超音波処理をサンプリングする前に数分。この最初の実行では、実験中に比較的脱気した超音波処理媒体ため、一貫性のある結果を得るために行われなければなりません。 sonosensitizersの有効性を評価する際の感作の真の程度が評価するのは困難であるように加えて、細胞は、最大振幅またはその近くで超音波処理されるべきではありません。 40 kHzのシステム上で33％の振幅を使用すると、それが顕著な損傷を生成するように、理想的な設定ですが、U937及びTHP1細胞（ 図7）に対してMeβCDで示されたように、その有効性を実証するためにsonosensitizers十分な余地を提供します。これらのデータはまたMeβCDが用量依存的に低周波の超音波の多重白血病株を感作することを確認します。 超音波処理17-19を介して生成された膜内キャビテーション気泡の証拠を示す8 MHzに0.75メガヘルツの範囲でより高い周波数で行われた実験の数がありました。しかし、questioまだ超音波によって誘導される細胞溶解18の正確なメカニズムに関しては残るNS。我々は細胞骨格を流動化し、低周波超音波15、他の研究室20,21によって実証現象を利用して音波の感度を増加させたとの間のリンクを示している。また、我々は、サイトカラシンBのようなマイクロフィラメント、破壊剤は、複数の白血病での超音波の感度を増強することを発見しましたアクチン重合の阻害を示唆する線ではなく、hHSCsまたは22の白血球は、特に関心のsonosensitizing機構であってもよいです。またビンクリスチン、チューブリン重合を阻害する23微小管破壊剤、24は 、顕著に急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病を含む、 インビトロでの異なるタイプの白血病の超音波感受性を増加させることを観察しました。これとは対照的に、細胞骨格成分を安定化させる細胞骨格指向剤（パクリタキセルANDのジャスプラキノリド）は、細胞溶解22の下率で反射された、超音波処理に細胞が耐性にするように見えます。まとめると、これらのデータは、腫瘍細胞の細胞骨格成分を流動化することは、実際にSDT 25の効率を向上させる上で重要な因子であるという仮説を支持します。本研究はまた、コレステロール枯渇はMeβCD処理したU937細胞が著しく40 kHzの超音波に感作されているように、さらに、新生物細胞の超音波感受性を増強するすることにより、別の方法であってもよいことを示しています。 当社の超音波処理プロトコルは、in vitroで顕著な抗新生物活性を示しているが、現在の方法論は、文化や超音波処理のために使用バイアルに適合することができる小型の脊椎動物のモデルで動作するように制限されています。我々は、安全に、パルスの低周波超音波（20キロヘルツ）を用いて超音波処理することができることを示しているゼブラフィッシュ、および化学療法剤に対する耐性は、定量的に同等であることを担癌ゼブラフィッシュは、これらのプロトコルのインビボ抗腫瘍活性を評価する予備研究において使用され得ることを示唆しているマウスモデル26によって許容用量。それにもかかわらず、前の哺乳動物モデルの超音波処理に化学療法剤を投与するMHzの範囲1に報告されており、このようなプロトコルは、おそらく、低周波超音波、ならびにコレステロール枯渇および細胞骨格指向剤を組み込むように拡張することができます。 SDTのこの形式の潜在的な臨床応用は、従来の超音波処理25のために除去された血液に（iv）の抗腫瘍剤を静脈内に投与された体外血液超音波処理を含むことができます。この方法は、人体の解剖学的構造によってもたらされる潜在的な音の障壁を除去し、固形腫瘍から白血病性芽球、ならびに転移を損傷する効果的な方法かもしれません。これは、コレステロール枯渇および細胞骨格指向剤は可能性もあります既にこの治療法の有効性を改善する試みにおいて、臨床において検討されているHIFUプロトコルにおいて使用されます。 本研究に記載された方法は、潜在的なsonosensitizersの価値を評価することが可能で、さらにシステムの改良は、このユーティリティを高めることができます。しかし、電源品質、音響焦点、およびコンバータの個体ばらつきを含む超音波クレビスを使用する際に考慮すべき多くの変数があります。そのため、今後の研究は音波を可視化し、その結果に及ぼす影響を理解することに焦点を当てます。 SDTは、 インビトロで細胞溶解を増強することが示されており、哺乳動物モデルにおけるインビボでの多くのデータが取得された場合、臨床的に実行可能なことが判明し得ます。複数のエージェントおよび超音波を伴う悪性細胞の他の潜在的に悪用可能な特性、ならびに種々の複合モダリティを調べる実験では、我々の研究室で継続します。

超音波は、人間の聴覚能力（〜20キロヘルツ）1の上限値よりも高い周波数を有する任意の振動音圧の波を指します。 20〜60 kHzの範囲の低周波の超音波は、核酸抽出のため、組織破壊のため、および他の試験の様々な細胞のサンプルを調製し、エマルションを生成する手段として研究室で利用されています。低周波超音波のユーティリティは、様々な材料を洗浄、溶接のための工業環境に拡張し、材料加工に採用されています。市販の超音波発生器は100-1,200 Wからワット数を18〜60 kHzの範囲の周波数に来て、フルスケール超音波は、長い画像診断のための臨床設定で使用されてきたが、それはごく最近の治療法として適用されています。超音波≥1MHzのは、安全に目に尿路結石（腎臓結石）と胆管結石（石を破壊することが可能です症状2,3を減らすために、患者の電子の胆嚢や肝臓で）。体外衝撃波砕石術（ESWL）と呼ばれるこの手法は、現在広くクリニック（百万人以上の患者が米国だけでESWLで毎年4に処理されます）に適用され、モダリティを提供していますそれによって非侵襲的に結石を破壊され、外部から印加され、集中し、高強度の音響パルス2-4を使用することにより、最小限の付随的な損傷。 これにより、高強度の超音波によって生成される一意の直接剪断力、ならびにキャビテーション気泡に、これらの方法は、高強度として知られている手法では去勢抵抗性前立腺癌および膵臓腺癌の治療のための癌治療において検討されているが、集束超音波（HIFU ）5-8。 ESWLと非常に類似した方法では、HIFUは、複数の超音波ビームを使用し、60°CまたはHIGの温度を生成するために、選択された焦点領域上に焦点を合わせます標的組織5で凝固壊死を誘導する音響エネルギーの使用を介して彼女の、。熱アブレーションの他のモダリティは、現在（高周波アブレーションおよびマイクロ波切除）が存在するが、HIFUは、それが唯一の非侵襲性の高体温モダリティ5であることを、これらの方法に比べて明らかな利点を提供しています。 HIFUは、診療所での混合の結果を達成し、現在臨床試験8-11でのみ使用することができました。それにもかかわらず、限られた成功は、それを実現しており、前臨床モデル哺乳動物から取得された生体内データにおける非常に有望な癌治療における超音波の可能性を実証しました。 HIFUを改善するために、研究者はsonochemotherapyのフォームを生成するために、適切な抗悪性腫瘍剤で超音波を結合しようとしました。音響化学療法（SDT）は、インビトロでの印象的な抗新生物活性を示した有望な新規な治療法であり、 <em&gt; in vivo試験1。そのような細胞および正常組織学的1,5のものとの間のサイズの差に基づいて、優先的に悪性細胞損傷を、その超音波が示されています。 SDTは、腫瘍細胞に対して、超音波によって及ぼさ優先損傷の程度を増加させるためのsonosensitizersとして知られる特殊な薬剤を搭載しています。 SDTの治療用途は、以前に検討されているが、使用される超音波システムは、典型的には、より高い周波数の超音波（≥1MHz）を採用し、低kHzの周波数の超音波の効果はまだ十分に探求されなければなりません。超音波の周波数が低い慣性キャビテーション、物理化学的ダメージ12-14の誘導、マイクロバブルの急速な崩壊に起因する細胞の破壊をもたらす現象を生産で多くの場合、より精通しています。 MHzおよび低kHzの超音波との間の慣性キャビテーションの発生の差が低い波周波数はマイクロバブルを有効にするという事実に起因していますその結果、以下の圧縮半サイクル12の間に、より暴力的な崩壊を生成する、拡張半サイクルにおいて整流拡散によって成長する多くの時間です。 我々は以前U937ヒト単球性白血病細胞は、低周波超音波（23.5キロヘルツ）に敏感であり、この感度は著しく細胞骨格15を乱す抗腫瘍剤を適用することにより増加させることができることを示しています。さらに、我々は、大きなセルは、より高い音波感受性を示すと、細胞が優先的サイズに基づいて、破損していることを実証しました。加えて、同程度の細胞サイズで正常なヒト造血幹細胞（hHSCs）および白血球仮低周波超音波を優先正常組織の存在下で悪性細胞を損傷するために使用され得ることを示唆し、その新生物の対応15より超音波処理に非常に耐性が高いです。 さらにユニークな小道具を調べるために、潜在的な治療に使用するための低周波超音波のertiesは、我々は、我々の現在の超音波処理システムのいずれかの有効性と信頼性を高めるために取り付けられた20ミリメートルのホーンを搭載したブランソンモデルSLPe 150 W、40 kHzの細胞破砕を、洗浄および安定化手順を開発しました7.62センチメートルカップに。さらに、我々はハイドロホンとキャビテーションメーターとオシロスコープを使用して、40 kHzの範囲内で正確なサンプルキャビテーションエネルギーだけでなく、一貫性のある波形と振幅を決定することができました。精錬と私たちのプロトコルを体系によって、我々は、私たちは定量的に異なるhistogenetic系統の腫瘍性および正常細胞の音波感度を比較することができ、我々の実験超音波処理の一貫性を確立することができました。 40 kHzのシステムのための我々のプロトコルは、関心のある研究室は、同程度の実験を行うことができるように、および抗腫瘍によって誘発効果の調査結果を評価するために広範に詳細に示されています低周波超音波。 （; 図1MeβCD）、コレステロール除去剤、U937の超音波感受性およびTHP1ヒト単球性白血病細胞を増加させることに加えて、我々はメチルβシクロデキストリンの用量依存的効果を調べます。

<table><tbody><tr><td>Iscoveの変更されたDulbeccoの媒体w / NaHCO3&25mM Hepes&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>12440079</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンBソリューション&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A2942&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン100x溶液&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12105</td><td></td></tr><tr><td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3" (25mm) Cuphorn</td><td>Branson Ultrasonics</td><td>101-063-726</td><td>超音波処理装置</td></tr><tr><td>Brisk Heat SDC ベンチトップ デジタル温度コントローラー 1000 ml ビーカーヒーター</td><td>Brisk Heat</td><td>SDCJF1A-GBH1000-1</td><td>ヒーター 温度制御に使用</td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&reg;ソフトウェア</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605700</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20 Automated Cell</td><td>Counter Bio-Rad</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin 50 mg/ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 ml & 25 ml ベント式培養フラスコ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>353082</td><td></td></tr><tr><td>ロンザ L-グルタミン 200 mM 0.85% NaCl</td><td>ロンザ</td><td>17-605C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml バイアルとキャップ</td><td>Beckman-Coulter</td><td>&nbsp;A35473</td><td></td></tr><tr><td>アキュジェット プロ オートピペット&nbsp;</td><td>BrandTech Scientific</td><td>26330</td><td></td></tr><tr><td>USA Scientific 10 ml 使い捨て血清ピペット</td><td>USA Scientific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Tip One 100 &#956;lと1,000 &#956;lフィルターチップ</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>1120-1840、1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>100&#956;l マイクロピペット&nbsp;</td><td>ウィートン</td><td>851164</td><td></td></tr><tr><td>1,000 &#956;l マイクロピペット</td><td>Wheaton</td><td>851168</td><td></td></tr><tr><td>BioRad デュアルチャンバー計数スライド</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0015</td><td></td></tr><tr><td>Forma Scientific デュアルチャンバーウォータージャケット インキュベーター</td><td>Forma Scientific</td><td>3131</td><td></td></tr><tr><td>Tektronix&nbsp;DPO 2002B デジタル・フォスファ・オシロスコープ</td><td>テクトロニクス</td><td>DPO2002B</td>超音波<td>波形の測定に使用</td></tr><tr><td>PPB Megasonics Model PB-500 超音波エネルギー・メータ</td><td>PPB Megasonics</td><td>PB-500&nbsp;</td><td>W/cm2</supで音の強さを評価するために使用されます></td></tr><tr><td>テレダインレゾンTC4013-1ハイドロフォンテレ</td><td>ダイン</td><td>TC4013-1&nbsp;</td><td>オシロスコープに接続&nbsp;</td></tr><tr><td>ウィートン 250 ml フラスコ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z364827</td><td></td></tr><tr><td>20 ml ガラス シンチレーション バイアル&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z190527</td><td></td></tr><tr><td>Beckman-Coulter等張生理食塩水&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>N/A</td><td>Z2カウンター用希釈剤</td></tr><tr><td>クロロホルム 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 200 プルーフ 無水&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td><td>ATCC</td><td>30-1011K</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルマイクロプレートリーダー</td><td>Cole-Palmer</td><td>&nbsp;EW-13055-54</td><td></td></tr><tr><td>U937 ヒト単球性白血病細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL&shy;1593.2</td><td></td></tr><tr><td>THP1 ヒト単球性白血病細胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td></td></tr></tbody></table>

未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

20 kHzの範囲の低周波超音波は、腫瘍細胞における選択的な細胞溶解と死を誘発するための新しい物理的モダリティです。さらに、この方法は、超音波が腫瘍細胞に対して及ぼす優先的損傷の程度を増加させるために、ソノセンシタイザーとして知られる特殊な薬剤と組み合わせて使用することができ、ソノダイナミックセラピー(SDT)と呼ばれるアプローチです。前臨床のin vitro設定で低周波超音波を生成し、適用するための方法論は、腫瘍細胞と正常細胞に対する超音波処理の影響を調べ、比較するために、再現性のある細胞破壊を達成できることを実証するために提示されています。これにより、前臨床治療評価に必要な一貫性レベルで腫瘍性細胞を確実に超音波処理する手段が提供されます。さらに、腫瘍細胞における超音波感受性の増強に対するコレステロール枯渇剤および細胞骨格指向性薬剤の影響について、超音波化学療法アプローチを助長する作用機序について詳しく説明しています。

システムの安定性は、反復可能で信頼性の高い結果を得るために非常に重要です。 54.23 N、Mの適切なトルク値は、 図3Bは、サンプルバイアルの内部測定値を示している。波形の整合性をオシロスコープとハイドロホン（ 図3A）を使用することによって評価されると、変換器とソノトロード2の適切な結合を達成し、かつ図3Cは、カップホーン内の安定性を評価します。予想されるように、振幅がわずかによりガラスに吸収されるエネルギーの一部に減少しました。しかし、波形が乱さまたはサンプルに音波エネルギーを確実に配信するために必要ないずれかのパネルBまたはCに歪んでいませんでした。明確な特異正弦波として表示されません波形は障害のあるトランスデューサまたは不適切なセットアップを示しています。これは、複数の異常な波を示し、図3D、正弦波の明確な非存在下で発現され、かつ周波数がない読書しますtが適切​​に機能してシステムに期待します。 （ 図4）生成されたキャビテーションエネルギーを測定するために使用されるキャビテーションメーターは33％の振幅で100〜110 W / cm 2となるように音の強さを発見し、そして50％の振幅で、125〜130 W / cm 2です。 40 kHzのシステムが適切に較正され、その全体（ 図5）に組み立てた後の両方TC20及びZ2のカウンタ（ 図6）によって決定されるように、信頼性の細胞破壊が容易に達成されました。予想されるように、より広範な細胞損傷ではなく、33％の振幅に比べて、50％で超音波処理した細胞集団で観察されました。それにもかかわらず、33％の振幅は、それが顕著な被害を生じさせるように、投与された薬剤の潜在的な音波増感効果を検出するための出発点として有用であるが、薬剤は、超音波感受性のそれらの増強を評価するために適用されるときに、より損傷を検出するための余地があります。これは、 図7Aに示されていますU937細胞の超音波感受性を増強する上でMeβCDの用量依存的効果が示されています。非超音波処理MeβCD処理細胞は、非超音波処理し、未処理細胞の生存率は非常に類似していたが、生存率は顕著に40 kHzの超音波を印加した1秒の3つのパルスの後に低下しました。また、超音波処理後の生存率の低下は、5 mMのMeβCD最大1 mMのに続いて、細胞数の減少、およびその後0.5 mMのMeβCDを製造したように、用量依存性であったと思われます。 XTTキット（ 図7B）を用いて評価されるように、細胞の生存率およびミトコンドリアの活性に類似の効果は、超音波処理の前にMeβCD種々の濃度で処理した両方のU937及びTHP1細胞で観察されました。 THP1細胞は、U937細胞よりも耐性がやや音波であるように見えるが、両方のヒト白血病株は、用量依存的に損傷を受けます。 MeβCDの高い濃度と超音波PRODの複数のパルス細胞の生存率およびミトコンドリア活性を低下させるために、対応する、U937及びTHP1細胞の両方のための可溶性、鮮やかな色のオレンジ誘導体にXTTの最低削減をuced。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> メチルβシクロデキストリンの図1の分子構造。（A）メチルβシクロデキストリン（MeβCD）の完全な構造。 （B）MeβCDはHまたはCH 3のいずれかのR基を有する7繰り返し単位のポリマーです。分子式：C 56 H 98 O 35。分子量= 1331.36。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> 図2.適切に40 kHzの超音波システムをトルク締め。（A）ホーンとコンバータはカップpriから削除されますまたはトルク締めします。 （B）それぞれの位置にあるスロットレンチとトルクレンチを置きます。 （C）カップにホーンと、コンバータを再接続する前に、時計回りの方向のトルクの54.23 N。Mを適用します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> 超音波システムの波形を特徴づけるために、オシロスコープの3.図 。 （A）ハイドロフォンと、オシロスコープは、振幅、波形の整合性を評価するために使用することができます。 （B）の記録を1.5 -1で直接ホーンの上にカップに取り、33％の振幅で設定します。 （C）ここで描か波形は、ハイドロホンを20mlガラスシンチレーションバイアル内に配置されたときに取得された読み取りです。バイアルは、上記ホーン1.5センチメートルに配置し、再び33％の振幅に設定されています。 （D）オシロスコープのスクリーンショットO障害が発生したシステムやホーンコンバータ組合の不適切な結合で予想されるように、異常な周波数とFAシステム。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> 超音波システムの音の強さを特徴付けるキャビテーションメーター図4.。ここに見られるキャビテーション計はW / cm 2の中にキャビテーションエネルギーを表すために使用されます。これは、サンプルに対するエネルギーの一貫性を評価するための非常に重要な手段です。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> 40 kHzの超音波システムの図5.主な構成要素は、超音波システムは、カップホーンを備えた示されています（ <stroNG&gt; A）、加熱装置（B）、コンバータ（C）、及び試料位置決め機構（D）。この設計は、ホーン（F）上記のサンプル（E）の容易な位置決めを可能にします。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> TC20及びZ2のカウンタを使用してU937細胞を超音波溶解に対する振幅の異なるレベルの図6の効果 。細胞を、それぞれの間で1秒間隔で、超音波の三1秒パルスを用いて33％の振幅で40 kHzのセル除膜器（dismembrator）（100〜110 W / cm 2）を50％の振幅（125〜130 W / cm 2）を用いて超音波処理しました。これらのパルスの。 Z2カウンタソフトウェアから（A）のスクリーンショットは、U937細胞に対する超音波処理の効果を示します。 TC20カウンタから（B）のデータは、結果の再現性を実証するために、グラフにまとめました秒。これらのデータは、合計して、生細胞数、ならびにトリパンブルーは、細胞生存率を評価した含まれています。バーは4つの独立した細胞集団の平均の標準誤差（SEM）を反映している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> U937及びTHP1細胞の超音波感受性を増強する上でメチルβシクロデキストリンの図7.影響。（A）U937細胞は、従来の40kHzの超音波（105 W / cm 2の超音波処理されることに30分間MeβCD種々の濃度で処理しました）は、3つの1秒パルスを使用して、離れて1秒間隔をあけ。細胞集団は≥12ミクロンと≥17ミクロンに分類しました。 （B）U937またはTHP1細胞が再び変化するコンセントで処理しました30分間の前に1秒の超音波の1-3パルスを使用して40 kHzのシステムで超音波処理されることにMeβCDの配給は1秒間隔を置いて配置しました。細胞の生存率およびミトコンドリア活性は、XTTキットで評価しました。細胞100μlを、平底96ウェルマイクロタイタープレートにウェルあたり播種しました。プレートは、従来のXTT溶液の添加を24時間インキュベートしました。波長を読み取る前に、細胞を、次いでさらに2時間インキュベートしました。バーは、4つの独立した細胞集団のためにSEMを反映している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

ヒト白血病細胞の選択的損傷は、白血病細胞および正常造血細胞の化学療法前処理の有無にかかわらず、低周波超音波を適用する新しいアプローチを通じて達成することができます。

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

本実験の全体的な目的は、コレステロール除去剤の有無における、パルス低周波超音波によるヒト白血病細胞集団への損傷効率および再現性を評価することです。これは、超音波処理システムの洗浄および安定性の評価を行うことで達成されます。その後、メチル-β-シクロデキストリンの有無の条件下で、ヒト白血病細胞に超音波処理を施します。次に、自動細胞計数装置を用いて、細胞生存率ならびに超音波処理およびコレステロール除去の効果を評価します。白血病細胞のミトコンドリア活性は、XTTアッセイにより評価されます。最終的に、これらのデータは、低周波超音波が悪性細胞に損傷を与えるために利用可能であり、コレステロール除去剤の使用によってその効果が増強されることを示唆しています。当研究室では、超音波の抗腫瘍効果と超音波の効果を増強させる特殊な薬剤を組み合わせた新しい治療形態であるソナーナンプ治療に関心を持っています。本プロトコルでは、腫瘍細胞と正常細胞の両方の音響感受性を評価し、さらなる前臨床研究に値する潜在的な化学療法アプローチを決定します。一般的に、この手法に不慣れな方は、超音波システムの安定性を評価するために使用する装置の操作に苦労する場合があり、これらの装置を最適に適用する方法を習得するまでに時間を要することがあります。洗浄および安定化の手順は、ソニケーションシステムの評価において、再現性のある結果を得るために不可欠であるため、本手法の視覚的なデモンストレーションが重要となります。実験を開始する前に、クロロホルムと綿棒を使用して、ホーンとコンバーターの接合部を洗浄してください。次に、ホーンとコンバーターのネジ山に軽油を塗布します。さらに金属片、錆、または酸化物の蓄積を取り除いた後、クロロホルムを使用してユニオンからオイルやその他の汚染物質を除去し、ホーンをコンバーターに再装着します。システムを適切にトルク管理するには、ホーンをカップの底部から引き出し、コンバーター上部付近にある3つの小さな穴のいずれかにスロットレンチを挿入します。次に、1/2インチのクローフットレンチを取り付けたトルクレンチをホーンのスロット部分に配置し、トルクメーターが39.99 foot poundsを示すまで、標準的な時計回りに締め付けます。締め付けた後、コンバーターとホーンをカップに戻し、各部品をリングスタンドに直立状態で固定して、コンバーターを電源に再接続し、システムをパルス投与に設定します。1秒間の超音波処理と1秒間のパルス間隔を用い、システムを目的の振幅に調整して、sauna Fireシステムの強度と機能を評価します。まず、キャビテーションメーターを1.5 centimetersの位置に保持し、メータープローブの表面に気泡がないように注意してください。キャビテーションメーターの画面を確認し、システムが適切な強度で動作していることを確認してください。次に、12.5 millilitersの水が入ったサンプルバイアルにハイドロフォンセンサーを完全に浸し、リングスタンドを使用してハイドロフォンを吊り下げます。波形特性の安定性を確認するため、ハイドロフォンをオシロスコープの入力端子に接続し、明確な正弦波が出ていることを確認してください。異常波が発生するとシステムの周波数が変動する可能性があるためです。超音波処理に向けて細胞を調製するため、まず、調製したばかりの培地を用いて、25 cm²フラスコに1 mLあたり4 × 10⁴個の密度で細胞を播種します。トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定し、培養液が目的の濃度に達するまで、37 °C、5% CO₂条件下で培養します。細胞が超音波処理に適した状態になったら、真空ポンプとブフナーフラスコを用いて、脱イオン蒸留水を脱気します。次に、ホーンの先端から15 mm上の位置まで水を満たします。脱気水を用いてシステムを約7分間運転します。その後、3 mLの細胞を20 mLのガラス製シンチレーションバイアルに移し、バイアルを保持装置に取り付けます。次に、ホールドデバイスをカップホーンの上部に装着し、スライド機構を使用して、水面におけるホールドデバイスの高さをホーン上端から15 millimetersに設定します。次に、33%および50%の振幅で、1秒間の超音波パルスを1秒の間隔で3回照射して細胞をソニケーションし、ソニケーション後の細胞生存率をトリパンブルー排除法で評価します。細胞損傷を評価するために、Z2粒子解析装置の開口部を等張生理食塩水で少なくとも2回洗浄します。次に、超音波処理した細胞100 µLを20 mLの等張生理食塩水に加え、細胞サンプルをカウンターホルダーに移します。その後、プラットフォームをアパーチャまで上昇させ、メーカーの指示に従って細胞損傷、生存率、およびデブリを分析します。XTTアッセイにより超音波処理した細胞の生存率を評価するには、1から3の範囲で超音波処理を行います。XTTキットで評価するための様々な損傷範囲を形成させるため、1秒間のパルスを1秒間隔で照射し、その後、細胞を遠心分離して、新鮮に調製した増殖培地を用いてペレットを1 × 10⁵ cells/mLに再懸濁します。次に、個別のフラットボトム96ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ播種し、ブランクの吸光度測定用として完全増殖培地のみを100 µL含むコントロールウェルを3つ含め、3連（トリプリケート）で調製します。アッセイ当日の朝に細胞を24時間インキュベートし、37°Cに加温したXTTおよび活性化試薬の分注液を、溶液が透明になるまで静かに swirling（旋回混和）させます。次に、5 mLのXTT試薬に活性化試薬0.1 mLを加えます。続いて、活性化させたXTT溶液50 µLをU937およびTHP-1を接種したプレートの各ウェルに加え、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。2時間後、プレートを軽く振って陽性ウェル内のオレンジ色の染料を均一に分散させ、マイクロプレートリーダーを用いて450から500ナノメートルの波長で吸光度を測定します。最後に、すべてのアッセイウェルの吸光度を、630から690ナノメートルの波長で再度測定します。予想通り、振幅33%の場合よりも50%で超音波処理した細胞集団において、より広範な細胞損傷が観察されます。しかしながら、33%の振幅では、薬剤を投与した際のさらなる損傷を検出することが可能です。本実験では、コレステロール除去剤であるメチルβシクロデキストリンの用量依存的な影響が、U 9 37細胞の超音波感受性を増強させる点について評価しました。メチル-β-シクロデキストリンで処理していない細胞の生存率は、未処理の細胞と同程度でしたが、1秒間×40 kHzの超音波を3回照射した後に生存率は著しく低下しました。さらに、XTTアッセイによる評価の結果、超音波照射後の生存率の低下は用量依存的であると考えられ、コレステロール除去剤であるメチル-β-シクロデキストリンの5 mM処理で細胞数の最大低下が見られ、次いで1 mM、0.5 mMの順となりました。THP-1細胞はU937細胞よりもわずかに超音波耐性が高いと考えられますが、これら両方のヒト白血病細胞株において、用量依存的な損傷が認められました。さらに、高濃度のmethyl beta cyclodextrinとより多数の超音波パルスを組み合わせることで、U 9 37細胞およびTHP one細胞の両方において、XTTから水溶性の鮮やかなオレンジ色の誘導体への還元が最も低く抑えられました。これは、両方の細胞株において細胞生存率およびミトコンドリア活性がより低くなったことに対応しています。本手順に続き、細胞骨格標的薬や活性酸素種生成剤などの他の音響感受性増強剤を用いて、音響感受性の増強能を評価することができ、これにより前臨床有効性を検討可能な新しい治療アプローチを確立できます。本手順を実施する際は、TCおよびZ twoカウンターから得られたSONデータを適切に整理することが重要です。これらのデータは治療プロトコルの有効性に関する詳細な情報を提供しており、整理を怠るとそれらの情報を失う可能性があるためです。ロジスティカルスキームを使用しない場合、このビデオを視聴することで、前臨床in vitroモデルにおいて低周波超音波を潜在的なアノセンシタイザーと組み合わせて使用し、その治療的有用性を評価する方法について十分に理解できるはずです。

generation-quantitative-analysis-pulsed-low-frequency-ultrasound-to

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

マイクロバブルのInsonationは減少時間平均音響パワーで、同様に治療薬の標的化送達のための腫瘍切除のための有望な戦略である。本研究の目的は、皮下C6神経膠腫への非熱的血管アブレーションとペイロードの配信を最大にするためには、低いデューティサイクルの超音波パルス化戦略とナノキャリアを開発することである。...

コントラストの超音波は、薬剤ベアリングナノ粒子デリバリーと微小血管アブレーションを経由してマウスの神経膠腫の治療を対象と

このプロトコルは、接着斑の形成と膜貫通マトリックス受容体、シンデカン-4の関与を模倣することによってRac1の活性化を駆動する低強度パルス超音波による培養線維芽細胞の刺激を説明しています。このアプローチは、それによって治療法の改良の機会を提供する、細胞レベルで成功した臨床技術の調査を可能にします。...

低強度の超音波を用いた接着依存性のシグナルの誘導

このビデオでは、低周波超音波を使用してヒト白血病細胞の選択的損傷について説明しています。前臨床のin...

低周波超音波アプリケーション:ヒト白血病細胞に対する超音波処理の影響を決定する方法

この記事では、細胞の生存率とミトコンドリア活性を評価するための比色アッセイであるXTTアッセイのプロトコルについて説明します。...

XTT Assay:細胞の生存率とミトコンドリア活性を評価するための比色アッセイ

このプロトコルは、イメージングマウス頸部リンパ節のための高周波超音波（HFUS）の適用を説明しています。この技術は、頸部リンパ節の形態、量および血流の可視化及び定量化を最適化します。頸部リンパ節および組織学的評価のためのリンパ組織の処理の画像誘導生検も実証されています。...

マウス子宮頸部リンパ節の高周波超音波イメージング

腫瘍治療領域（TTFields）は、低強度、中周波、交番電界の連続非侵襲的適用によってもたらされる効果的な抗腫瘍治療法である。 TTFields in vitroアプリケーションシステムを使用して細胞株にTTFieldsアプリケーションを適用すると、細胞数が最も減少する最適な頻度を決定することができます。...

腫瘍治療領域（TTFields）を用いた癌細胞の最適阻害頻度の決定

ここで高周波超音波マウスの胎児の生体内解析のための手法について述べる。このメソッドには、胎児のフォロー...

体内の胎児と胎盤の開発の分析のための高周波超音波

低出力パルス超音波刺激 (体表) は内因的あるいは人工的高時空間分解能細胞の非侵襲的な機械的刺激の様相です。この記事では、エピ蛍光顕微鏡に体表を実装する方法と、不要な機械工芸品を防ぐために超音波のパスに沿って音響インピー...

多重蛍光顕微鏡と超音波刺激を集中

血液脳関門(BBB)は、マイクロバブル媒介性集中超音波(FUS)で一時的に破壊することができる。ここでは、非超音波専門家がアクセス可能なモジュラーFUSシステムを使用して、高スループットBBBのインビボでの開口のためのステップバイステッププロトコルについて説明する。...

げっ歯類における血液脳関門開口のためのハイスループット画像誘導定型神経ナビゲーションと集中超音波システム

提示された実験プロトコルは、薬物送達および/または他の生物効果の成功に必要な条件の調査を可能にすることを目的として、細胞培養装置におけるキャビテーション活性のリアルタイム測定を行うために使用することができる。...

キャビテーション強化療法の研究

メラノーマは、すぐに他の臓器に広がる非常に攻撃的な病気です。このプロトコルは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積を監視するために、3Dレンダリングと組み合わせた超高周波超音波イメージングの適用を説明する。...

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

学ぶ低周波超音波によるヒト白血病細胞への損傷効果と、メチルベータシクロデキストリンを用いたコレステロール除去が超音波感受性を増強するメカニズムについて。XTTアッセイと自動細胞計数で細胞生存率を評価する方法です。

未処理および処理腫瘍細胞のソニック感受性を決定するための生成およびパルス低周波超音波の定量分析

さらに動画を探す