圧縮されたコラーゲンで細分化した組織：シングル段再建修復のための細胞含有Biotransplant

以下の手順の全体的な目的は、再建手術中に自家組織を移植して増殖させることです。これは、まず目的の組織から生検試料を採取することで行われます。次に、生検試料を細切し、プラスチック圧縮ポリカプロラクトン（PCL）コラーゲン自家移植片を作製します。

次に、PCLと自家切削組織を統合して3Dスキャフォールドを作製します。ここでは1対6の膨張率を用いています。その後、このスキャフォールドを被験者に移植します。

最終的に、自家移植組織の再生は、スキャフォールドおよび細切組織粒子内における細胞の増殖と再編成の免疫組織化学的解析によって評価できます。この手法を、動物モデル、皮膚、および尿路上皮を用いて実演します。本技術の意義は、重度の組織形成不全がある組織の治療や、外科的修復に必要な組織が著しく不足している外傷後の症例への応用にまで及びます。

in vitro 培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一段階の手術手順として実施できることです。組織の採取から移植までのステップは無菌状態で行う必要があるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。ブタの膀胱生検検体を得るには、まず鉗子で膀胱を把持し、滅菌済みのメジャーを用いて組織の寸法を測定します。

次に、滅菌したペンを使用して、1〜6倍の拡張率を目指し、2×1 cmの楕円形の生検部位をマークします。その後、メスでマークした組織を切り出し、膀胱生検検体を滅菌条件下でDMEMに浸します。皮膚生検検体を採取する場合は、皮膚切除器（ダーマトーム）を使用して、厚さ0.3 mmの部分層検体を採取します。

次に、組織をDMEMに入れ、創傷部位をドレッシング材で覆います。続いて、膀胱生検組織をDMEMで2回洗浄し、粘膜面を上にして滅菌済みの解剖プレート上に移します。解剖ピンを用いて検体の一方をプレートに固定し、微細剪刀とピンセットを使用して、粘膜組織を排尿筋から分離します。

次に、粘膜の上にミンシングデバイスを置き、組織の端から端まで垂直および水平に動かして、0.8 by 0.8 millimeterのミンシング組織片を得ます。この際、デバイスを組織に押し付けながら動かす必要があることに注意してください。プラスチック圧縮コラーゲン自家移植片を調製するには、まず、10X DMEM（コラーゲンtype I添加）に、培地の色が濃い黄色からピンク色に変わるまで、通常の水酸化ナトリウムを1滴ずつ加えます。

pHが7.4から8であることを確認した後、2 mLのDMEMを溶液に慎重に混ぜ合わせます。次に、約2 mLのコラーゲンを20x30x10 mmの鋼製長方形型ウェルに分注し、10分間インキュベートします。コラーゲンが凝固したら、ゲル化したコラーゲンの上に適切な量のPCLバイオマテリアルを載せ、残りの6 mLのコラーゲンをPCLの上に注ぎます。

型をインキュベーターに戻し、さらに20分間静置します。次に、滅菌済みの表面にガーゼパッドを厚く積み重ねます。その上に、厚さ400 µmのステンレスメッシュを置き、さらに厚さ110 µmのナイロンメッシュシートを重ねます。

コラーゲンゲルをナイロンメッシュ上にそっと転写し、長方形のスチール製型を慎重に取り除きます。細切にした組織をコラーゲン上に転写します。ここでは、1～6倍の拡大率を目指します。

次に、コラーゲンゲルと組織の上に新しいナイロンメッシュの層を重ね、その上に2枚目のスチールメッシュを置き、さらに最低120 gの荷重プレートを載せます。5分後、自家移植片から荷重プレート、スチールメッシュ、およびナイロンを取り除きます。自家移植片をin vitroで培養する場合、まず薄くなった構築物を12ウェルプレートに収まる十分な小ささに切断します。

次に、各ウェルに1 mLの角化細胞培地を加え、組織を3～6週間培養します。細切した膀胱粘膜の自家移植片をブタの膀胱に移植するには、移植片をDMEMで湿らせます。その後、細い走行モノフィラメント縫合糸を用いて、構築物を健康な組織に移植します。

留置尿道カテーテルを通して膀胱に生理食塩水を注入し、グラフトが水密であるかを確認します。細切した皮膚表皮を用いた自家移植片を全層創に移植する場合、DMEMでグラフトを湿らせます。次に、自家移植片の四隅と中央を断続縫合し、構成体を皮膚全層創の底部に固定します。

最後に、湿潤状態を維持するために、創傷部をプラスチックドレッシングで覆います。この微小片化皮膚自家移植の画像で観察されるように、複合バイオグラフトは、把持、縫合、および外科的な操作に耐えることができます。in vitro 培養中の異なる時点における免疫組織化学染色では、細胞が増殖、遊走し、その細胞表現型に典型的な微細構造を持つ連続的な上皮へと再編成されることが示されています。

例えば、2週間後、皮膚自家移植片の表面の細胞層は約2層の厚さになります。右側に示すように、同じ培養期間後の膀胱上皮は約8層の厚さになります。5～6週間後には、細切皮膚上皮および細切膀胱粘膜の自家移植片の両方において、連続的な上皮は約8～10層の細胞厚になります。

in vitroでの組織拡張と比較して、この手法は迅速で手間が少なく、高度な研究設備を必要としません。さらに、すべての部品がFDA承認済みであるため、標準的な外科的環境での使用が可能です。この手順を行う際は、ゲル、バイオトランスプラント、および自家組織を無菌条件下で調製することが重要です。

本手順や、細胞のin vitro培養などの他の手法を併用することで、細胞の増殖および分化に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。この技術が発展すれば、再生医療分野の研究者に新たな道を切り開く可能性があります。これにより、自家組織エンジニアリング移植を用いて、皮膚や泌尿器系の深刻な奇形を治療できる可能性があります。