Name: 圧縮されたコラーゲンで細分化した組織：シングル段再建修復のための細胞含有Biotransplant (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 学ぶ、PCLスカフォールドを用いた自家組織の生体内拡張法。細切り組織とポリカプロラクトンを統合し、3D構造体を構築して単段階再建手術を実現する再生医療技術です。

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著者は、スウェーデン医学研究学会、プロモビリア財団、皇太子妃ロヴィーサ財団、児童福祉のためのフリーメーソン財団、スウェーデン医学会、ソルスティッカン財団、カロリンスカ研究所、ストックホルム市議会の財政的支援に感謝します。

動物ストックホルム郡委員会とすべての手続きにより事前承認された全ての動物プロトコルは、動物用の規制だけでなく、関連する連邦政府の法令に準拠しました。 1.動物の手順<ol><li>手術のために動物を準備<ol><li>無菌条件下での操作に必要なすべての材料と器具で手術台を準備します。感染の危険性を減少させ、生存手術における条件を最適化するために、無菌条件下で排他的に手術を行います。 </li><li>手術前に12時間のために動物を迅速かつその重量を測定します。前投薬のためのアザペロンの筋肉内注射（2ミリグラム/キログラム）を管理します。チレタミン次亜塩素酸の筋肉内注射で動物を麻酔（2.5ミリグラム/キログラム）、ゾラゼパム次亜塩素酸（2.5ミリグラム/キログラム）、メデトミジン（25μgの/ kg）及びアトロピン（25μgの/キログラム）。 </li><li> phenobarbiturateを注入した（15mg / kg）をendotrache前にアル挿管および0.8％-2％イソフルランで全身麻酔を続けます。片方の耳に末梢静脈カテーテルを挿入し、動物の健康を維持するために静脈内処置中にグルコース（25 mg / mlで）を注入します。 </li><li>温度、血圧、彩度、及び末梢脈拍をチェックするために、耳または尾部上のデバイスを監視配置。耳や蹄の痛み刺激による制御麻酔。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、目に軟膏を適用します。 </li></ol></li><li>膀胱生検標本の切り出し<ol><li>尿道を表示して半無菌条件下で尿を空に尿道を通って膀胱にカテーテルを挿入する鏡を導入することにより、10-フランスのシリコーンカテーテルを用いて膀胱カテーテルを挿入。 20-25センチH 2 O、約100〜300 mlに圧力を滅菌生理食塩水で膀胱を充填し、次に空のO 2センチH 20（約8ミリリットル/ kg体重）。 </li><li> THと電子豚は慎重にグルコン酸クロルヘキシジンのアプリケーションで皮膚の基本的な術前消毒を行い、側位置になりました。シェービングハサミで毛を除去した後、肩にジアテルミープレートを適用します。 </li><li>仰臥位に慎重豚の電源を入れ、シェービングばさみを使用して腹部の毛を除去し、グルコン酸クロルヘキシジンのアプリケーションと腹部の皮膚の基本的な術前滅菌を行います。 <ol><li>四肢の関節の過伸展損傷のリスクを最小限にするために柔らかい衣服と四肢を埋め込みます。グルコン酸クロルヘキシジンの連続した​​アプリケーションと動物の腹部皮膚を殺菌し、手術野の周りに滅菌ドレープを配置します。 </li></ol></li><li>皮膚切開の前に、臍下の正中線にブプレノルフィン（45μgの/キログラム）、カルプロフェン（3mg / kg）およびリドカインの局所注射からなる静脈内鎮痛剤を適用します。 SKを把握することによって痛みの反応をチェックピンセットでインチ出血の制御のためのジアテルミーを使用して、筋膜と腹膜を介して下部正中切開を行います。豚で完全に腹腔内の位置を有しており、自由に手術創を通してそれを動員して露出させることができる膀胱をローカライズ。 </li><li>ピンセットで膀胱のホールドを取り、滅菌巻き尺でそれを測定し、滅菌したペンを使用して、縦方向に約2センチ、横方向に1センチメートル、または小さい楕円形の生検標本をマーク（豚は、膀胱サイズの四分の一の減少を許容結構）。メスを用いて、マークされた領域を切除し、滅菌条件下でDMEM中で膀胱生検標本を配置します。 </li><li> biotransplantで自家移植を実行するか、2層に5-0ビクリルでそれを縫合することによって膀胱を閉じます。 2-0または3-0ビクリルを実行して、慎重に腹部筋膜を閉じます。 3-0ビクリルと3-0 Ethilonと皮膚と皮下組織を閉じます。傷口に包帯を置き、慎重にそれは麻酔から十分に回復していると痛みを発現しないまで動物に傾向があります。 </li><li>術後のケアのための条件を確保するために、動物のケア施設に動物を移動します。加熱ランプと、単一のケージに動物を入れて、出席動物に麻酔から完全に回復するまで、動物をペアでストールすることができます。 </li><li>痛みと幸福に関する平穏無事回復を提供し、5日間毎日一回3日間、1日2回筋肉内に術後鎮痛とtrimetoprim（4ミリグラム/ kg）及びスルホンアミド（20 mgの/ kg）のためにブプレノルフィン（45μgの/キログラム）を管理し、術後感染症のリスクを軽減します。 </li></ol></li><li>皮膚生検標本の切り出し<ol><li>すべての必要な材料と手術台を準備します。以前1.1で説明したように動物を麻酔。 、ワックスを使用して毛を取り外し洗浄し、ベタジンおよび70％アルコールで切開領域を殺菌した後、滅菌ドレープをaroun置きます切開領域を日間。 </li><li> 0.3ミリメートル部分層皮膚生検標本を採取するデルマトームを使用してください。 2.2で説明したように、ミンチ前にDME​​Mで皮膚片を置きます。脂肪軟膏と包帯で創傷領域をカバーしています。 </li></ol></li></ol> 2.ミンチ組織調製<ol><li>膀胱粘膜<ol><li> DMEMで二回膀胱生検を洗ってください。上を向い粘膜で滅菌解剖板に膀胱生検標本を置き、解剖ピンを使用してプレートに側面の1を固定します。 </li><li> （ 図3）細かいハサミやピンセットを用いて排尿筋からの粘 ​​膜組織を分離し、その上に生理食塩水またはDMEMを滴下することにより湿った粘膜を維持します。 </li><li>粘膜上に配置することによってミンチ装置を使用し、0.8ミリメートル×0.8mmの細分化した組織片を得るために手動圧力を加え、垂直方向と水平方向の一端から他端へのデバイスを通過する（1.3ミリメートルrotatin間の距離であります切刃G）。 </li></ol></li><li>皮膚<ol><li>皮膚biopsis場合は厚さ：無菌解剖板上に皮膚を配置し、皮下脂肪及び真皮から表皮を分離するために、外科用はさみを使用しています。表皮は薄く、半透明である（約0.3ミリメートル）それはミンチの準備ができているとき。 </li><li>表皮上に置くことによってミンチデバイスを使用してください。圧力0.8ミリメートル×0.8mmの細分化した組織片を得るために、水平垂直方向に一端から他端へのデバイスを通過し。 </li></ol></li></ol>プラスチック圧縮PCL /コラーゲン自家移植片の調製<ol><li>冷たい保つために氷の上にすべての材料を配置します。必要な道具：ファルコンチューブ、10×DMEM、1xのDMEM、1 N NaOHおよびラット尾コラーゲンタイプ1。 <ol><li> （培地中の色が強いから変更することにより、pH値を示すべきである7.4から8までのpHを、一滴ずつ、1 NのNaOHを加え、コラーゲンタイプ1の12ミリリットルで10倍の2ミリリットルをDMEM（慎重に気泡を避けるために）ミックスピンに黄色K）。また、pHがストリップを使用します。 </li><li>慎重に1×2mlのDMEMを添加し、溶液を混合。板鋼の長方形のモールド（20x30x10ミリ）の各ウェルのコラーゲンの約2ミリリットルと37でインキュベート 10分間、5％CO 2でC°。 注：コラーゲンの濃度は、0.6％酢酸およびコラーゲン1ミリリットル/ cm 2の量で2.06 mg / mlであるべきです。 </li><li>コラーゲンは、金型内にセットした後、コラーゲンゲル（×30から20mm mm）との上に生体材料（PCL）を配置し、その上に残りのコラーゲン（約6ml）に注ぎます。 20分間、5％CO 2中37℃でインキュベートします。 </li><li>コラーゲンゲルの上に：（6拡張1）みじん切り組織を置きます。次のようにプラスチック製の圧縮を使用して機械的な力によって、構築物から水を押して（ 図3および 4）。 </li><li>無菌の表面にガーゼパッドの厚い層を配置します。 gauzの上に1ステンレスメッシュ（厚さ400μm）を配置電子パッド、その後ナイロンメッシュ（110ミクロン厚）のシート。慎重にナイロンメッシュ上にコラーゲンゲル/みじん切り組織を転送し、慎重に長方形のスチール製の金型を削除します。 </li><li>コラーゲンゲル/みじん切り組織の上にナイロンメッシュの新しい層を配置します。ナイロンメッシュの上に第二のスチールメッシュを配置します。位置に5分間120グラム（ すなわち 、ガラス板）の最小値を計量圧力や荷重プレートを置きます。 </li><li>体重、ナイロン、スチールメッシュを削除します。自家移植は現在、全層皮膚創傷に豚の膀胱に縫合またはin vitroで培養される準備ができています。 </li><li> インビトロ培養のために、12ウェルプレートをフィット小片に薄い構造物を切断します。ケラチノサイト培地の1ミリリットルを追加します。 37℃、5％CO 2や文化6週間までのインキュベーターでプレートを置き、培地を週3回に変更します。 </li></ol></li></ol>自家移植片の4縫合<ol><li>自家移植の縫合糸で豚の膀胱へのミンチ膀胱粘膜<ol><li>待機時間中にDMEM中で湿った自家移植片を保管してください。細かいランニングモノフィラメント縫合糸で自家移植片を縫合。研究目的のために、非吸収性5-0 Ethilonを使用してください。 </li><li>尿道留置カテーテルを介して生理食塩水で膀胱を充填することによって水密かどうかを確認してください。可能な場合は、大網の層で自家移植をカバーしています。 1.2.6で説明したように腹壁、皮下組織、および皮膚を閉じます。創傷被覆材を適用します。 </li></ol></li><li>全層創傷にミンチ皮膚表皮と自家移植片の縫合<ol><li>待機時間中にDMEM中で湿った自家移植片を保管してください。 </li><li>密接に下地表面に付着した自家移植を維持するために隅にし、自家移植片の中央に結節縫合によって皮膚創傷、全層の底部に自家移植片を縫合。 </li><li>湿潤創傷を保持プラスチックドレッシング傷をカバーしています。 </li></ol></li></ol><ol><li>落ち着いた動物終了前に筋肉内ゾラゼパム次亜塩素酸（2.5ミリグラム/キログラム）の注射およびメデトミジン（25μgの/キログラム）で、パルスと血圧をチェックするために、耳や尾に監視装置を適用します。 </li><li>静脈内ペントバルビタールナトリウム（60〜140ミリグラム/キログラム）の致死量を投与することによって動物を安楽死させます。死が発生するまでのパルスと血圧をチェックしてください。 </li></ol> 6. in vitro培養 注：組織学的に、インビトロでの PCL /コラーゲン構築物で細分化した組織の進行を評価するために、コラーゲン/ PCL /ミンチパッチはケラチノサイト培地を用いて12ウェルプレート中で培養されます。 <ol><li>ケラチノサイト培地の調製： <ol><li> 500ミリリットルのガラス瓶を滅菌します。 </li><li> （：1混合物4）ハムF12の100ミリリットルを含むDMEMの400ミリリットルを混ぜます。 10％ウシ胎児血清を補足し、5μg/ mlのインスリン、0.4 / mlのヒドロコルチゾン、21 / mlのアデニン、10 -10モル/ Lのコレラ毒素、2×10 -9モル/ Lのトリヨードチロニン、5μg/ mlのトランスフェリン、10ng / mLの上皮細胞成長因子、50 U / mlペニシリンおよび50μg/ mlストレプトマイシン。 </li><li> 0.2μmのフィルターを通して濾過して滅菌し、無菌の500ミリリットル瓶にろ液を集めます。 </li></ol></li></ol> 7.免疫組織化学注：免疫組織化学プロトコルは、一般的に次のステップに分かれています：（1）固定し、パラフィン包埋、（2）マイクロ切片5μmの切片、スライド、脱パラフィンし、再水和上に配置するには、（3）抗原アンマスキング、染色および取り付け。免疫組織化学の手順の最後の手順を開始する前に、洗浄緩衝液および抗原脱マスキング液（別々の材料の詳細を参照してください）​​をご用意。使用前にABC複合体溶液に少なくとも30分を準備します。 <ol><li>固定 NOTE：in vitro培養の終わりに、次のようにパッチを修正します。 <ol><li> 4％緩衝ホルムアルデヒド（PFA）の1ミリリットルでエッペンドルフチュー​​ブを準備します（注意：ホルムアルデヒドは毒性があり、この化学物質を使用する前に、製品安全データシートを読んで手袋と安全メガネを着用し、ドラフト内の溶液を用意してください）​​。 </li><li> 4％PFAを含むエッペンドルフチュー​​ブにコラーゲンパッチのそれぞれを転送します。室温で一晩固定してください。 </li><li> 4℃での長期保存のための70％エタノールに入れサンプル。サンプルは現在、脱水のため準備ができていると切片の前にパラフィンブロックに埋め込みます。 </li></ol></li><li>水分補給<ol><li> 15分間のX-TRAのSOLVで染色ジャーにスライドを置きます。 X-TRA SOLVと新しい染色ジャーを使用して繰り返します。 10分間、無水エタノールを用いた染色ジャーにスライドを置きます。無水エタノールで新しい染色ジャーを使用して繰り返します。 95％エタノールで染色ジャーにスライド10分間、その後、配置10分間、70％エタノールで染色ジャーに。最後に蒸留水で5分間二回スライドを洗浄します。 </li></ol></li><li>抗原アンマスキング<ol><li> TE溶液でコプリンジャーにスライドを入れて、20分間沸騰する水浴中で瓶を置きます。慎重に水浴から瓶を取ります。 30分間室温にスライドを冷却し、トリス緩衝液中で5分間、二回洗浄します。 10分間、3％過酸化水素で染色ジャーにスライドを置きます。トリス緩衝液中で5分間二回スライドを洗浄します。マーキングペン撥水剤を使用して、サンプルの周りに円を描きます。 </li><li>ブロッキング溶液の100から300μLを用いて抗体の非特異的結合をブロックします。ブロッキング溶液を除去し、トリス緩衝液中の推奨濃度で溶解し、一次抗体の100から300μlを添加します。一晩インキュベートします。抗体溶液を除去し、5分間二回Tris緩衝液中でセクションを洗います。 </li><li>部屋のtemperatで1時間、二次抗体でインキュベートURE。トリス緩衝液中で5分間二回洗浄します。 （製造元の指示に従ってください）​​ABCエリートキットを用いて30分間インキュベート。トリス緩衝液中で2回洗浄します。 </li><li>製造元の指示（1-7分のインキュベーションは、一般的に明確な紫色の強度を生成）以下、ベクトルVIPキットを使用して、抗体反応を開発します。蒸留水にスライドを置きます。 30秒間マイヤーのヘマトキシリン​​で対比染色。 </li><li> 5分間流水で洗ってください。 1分間70％エタノールを用いた染色ジャーにスライドを置きます。 70％エタノールを使用して新しい染色ジャーを使用して繰り返します。 1分間95％エタノールで染色ジャーにスライドを置きます。 95％エタノールで新しい染色ジャーを使用して繰り返します。 </li><li> 5分間のX-TRAのSOLVで染色ジャーにスライドを置きます。しっとり保つために一度、1を削除してください。 （気泡を避けるために慎重にそう）各スライドの上に取り付け培地のドロップを置き、上にカバーガラスを置きます。スライドを一晩乾燥させますとミクロの下でスライドを見ます範囲。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

この研究は、手術台での移植のための自家組織と膀胱壁のパッチを作成するための使いやすいアプローチを提示します。パッチは、プラスチック製の圧縮と組み合わせて、外面で細分化した組織とない中・コラーゲン中の生分解性ポリマー編みの組み合わせによって形成されています。プラスチックの圧縮は、以前に他の著者によって記載された方法で、コラーゲンゲル12,13からの流体の急速な放出と定義することができます。膀胱粘膜や皮膚のみじん切り組織は、この足場に播種され、膀胱や皮膚上皮の形成は、6週間の間続くことができました。免疫組織化学的分析は、正常な組織の特徴の等価物の形成を示しました。これらの結果は、再上皮化および創傷治癒を研究するためのin vitroモデルではないだけを許可するだけでなく、自家組織移植のための生体材料を形成しています。最も重要なのは泌尿器科の目的のために、AUTograftsは、移植11の前にin vitro培養を必要とせずに操作された自己組織パッチなど再建泌尿器科における組織工学のインビボ用途に使用することができます。 <p class...

皮膚と泌尿生殖器管への移植のほとんどの組織工学の研究は、特別装備し、細胞培養施設1,2における健康な組織や細胞増殖の自己細胞の収穫が含まれます。 患者は、自家移植片を受け取るように準備される場合、細胞増殖の後、細胞は、通常、後の使用のために格納されます。窒素冷凍庫は-150℃以下の低温での長期保存を可能にします。凍結のプロセスは、慎重かつ細胞を失わないために制御しなければなりません。細胞死の一つのリスクは、細胞膜の破裂につながることが融解プロセス中に細胞内の水の結晶です。細胞の凍結は、通常、細胞、ウシ胎児血清、およびジメチルスルホキシドの高い濃度を用いて、ゆっくりと制御冷却（-1°Cあたり分）によって行われます。解凍後、細胞を凍結培地を除去し、細胞培養プラスチックまたはで培養することによって再び処理される必要があります戻って患者に移植する前に生体材料。 すべての上記の手順は、時間がかかり、面倒であり、高価な3。また、患者の移植のために意図された細胞のすべてのin vitroでの処理は非常に規制されているとよく訓練されたと認定された担当者や研究室4が必要です 。すべてのすべてで、安全で信頼性の高い製造プロセスを調達するために、技術は技術的に高度なセンターの非常に少ない数で確立することができ、一般的な外科的疾患における普​​及は疑問です。 実験室環境での細胞培養の限界を克服するために、in vivoでの細胞増殖のために細分化した組織を移植するという概念は、バイオリアクターとしての本体自体を使用することによって導入されます。これらの目的のために、自家移植は、優先的に私の臓器の最終的な再構築のために必要とされる形状に応じて3Dモールド上に移植されることになります5-7 nterest。 もともと、みじん切り上皮を移植するという考えは、彼が上皮は、創傷の縁から成長方法を説明したときに1958年にミークによって発表されました。彼は皮膚の小片は、垂直方向（ 図1）8に二回ピースを切断することにより、100％によって、その余白とそれによって細胞の拡大のためにその可能性を増大させることを実証しました。理論は、皮膚移植9用のメッシュ構造部分層皮膚移植片の使用によってサポートされており、肌にモデル10を創傷治癒されています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53061/53061fig1.jpg" width="600" /> 図1：ミーク理論はミークの理論によれば、上皮は、創傷の縁から成長。ミンチ技術により露出面積を大きくすることで、細分化した組織は、多くのスポットから傷をepithelializes。 本研究は、ハイポに基づいています同じ原理は、金型の周囲にミンチ上皮を配置することによって、皮下組織に適用することができる論文。 （内側本体から異物（金型）を創傷領域をカバーし、分離連続neoepitheliumを形成するために、上皮細胞は、創傷領域は（移行）をカバー、ミンチ移植（再編成）から動員だろうと除算は（拡大します） 図2）。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53061/53061fig2.jpg" /> 図2：ミークの理論によるin vivoでの体内組織拡大のためのみじん切り上皮と3Dモールドの漫画の皮下組織に金型に入れ、次いで移植細分化した組織を使用することにより、仮説は、上皮細胞から移行することです細分化した組織の縁は、再編成、および創傷領域をカバーし、内側本体から異物（金型）を分離連続neoepitheliumを形成するように拡張します。 インビボ研究において以前は有望な結果を示しているが、再生上皮が良い7機械的外傷に耐えることができるように、更なる改良が自家移植片を強化することによって達成することができます。簡単に栄養素や老廃物の拡散、可能性金型に3Dの方法で、手術取り扱いの容易さ：これらの目的のために、成功した生体材料のための重要な前提条件は、次のような、同定されました。結論は、これらの必要性を細分化した組織への複合生体材料を添加することによって達成することができたと判断しました。 生分解性生地の補強芯を含むプラスチック - 圧縮コラーゲンに細分化した組織で構成される足場を開発することを目的とした今回の研究。これらの手段によって、生存細胞を細分化した組織粒子から移行する可能性があり、元の上皮（皮膚や尿路上皮）の特徴的な形態学的特徴で増殖します。塑性圧縮を使用して、足場を減らすました約420μmのみじん切り粒子として、1 CMからサイズのdは上位層のコラーゲンに包まれました。コア・ファブリックは、任意のポリマーであるが、被覆コラーゲン層11とインターリンクするために、親水性表面で修飾することが必要である可能性があります。 この方法は、ブタからミンチ膀胱粘膜やみじん切り皮膚を培養するための足場としてそれを使用して、2つのプラスチック製の圧縮コラーゲンゲル内にポリ（εカプロラクトン）からなるニットメッシュ（PCL）を組み込むことによって強化された足場の整合性を提供します。構築物は、よく連結ハイブリッド構築物の上に層状、多層尿路上皮または扁平皮膚上皮の成功形成を実証し、in vitroで 6週間まで細胞培養条件下で維持しました。構築物は、取り扱いが容易であったと膀胱増強の目的や皮膚の欠陥の被覆のための場所に縫合することができました。すべての組織スキャフォールドの部分がFDA承認されており、技術組織細断収穫、プラスチック圧縮、および単一段階介入として患者に戻し移植することにより、一段階手順を使用することができます。手順は、任意の一般外科ユニット内の無菌条件下で組織拡大と再構築のために行うことができました。

<table><tbody><tr><td>シリコーンカテーテル 10-フレンチ</td><td></td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>DMEM 10x</td><td>Gibco</td><td>31885-023</td><td>プラスチック圧縮セクション4</td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>ファルコン</td><td>08-772-1</td><td>プラスチック圧縮セクション4</td></tr><tr><td>3',3',5-トリヨードチロニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>IRMM469In vitro培養;セクション5</td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Labmed Solutions</td><td>200-001-8</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td>Histolab</td><td></td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>ABCエリートキット:ビオチン-ストレプトアビジン検出キット</td><td></td><td>ベクターPK6102</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>無水エタノール</td><td>Histolab</td><td>1399.01</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>アデニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8626</td><td>in vitro culture;セクション5</td></tr><tr><td>アトロピン 25 &mu;g / kg</td><td>Temgesic、RBファーマシューティカルズ、イギリス</td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>ア<tr><td>ザペロン2&thinsp;mg/kg&nbsp;</td><td>Stresnil, Janssen-Cilag, Pharma, Austria</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション 1</td></tr><tr><td>バイオセーフティ レベル 2 フード&nbsp;</td><td></td><td></td><td>プラスチック圧縮;セクション4</td></tr>ブロッキング<tr><td>ソリューション:&nbsp;二次二次抗体が生成されたのと同じ種由来の正常な血清。</td><td>ベクターブロッキング</td><td>溶液は、&nbsp;最初の抗体の起源に依存します</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr>ブ<tr><td>プレノルフィン45&mu;g / kg</td><td>アトロピン、マイラン社、キャノンズバーグ、ペンシルバニア</td><td></td>州<td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr>カル<tr><td>プロフェン3&thinsp;mg/kg&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>リマディル、オリオンファーマ、スウェーデン</td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>グル<tr><td>コン酸クロルヘキシジン&nbsp;</td><td>ハイビスクラブ40&thinsp;mg/mL, Regent Medical, England</td><td></td><td>手術のための動物の準備, セクション 1</td></tr><tr><td>コレラ毒素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td>In vitro culture;セクション5</td></tr><tr><td>Coplinジャー:</td><td>Histolab</td><td>6150</td><td>免疫細胞化学を沸騰させるための染色ジャー。セクション6</td></tr>ステンレス<tr><td>モールド(33 mm x 22 mm x 10 mm)カスタムメイド</td><td></td><td></td><td>プラスチック圧縮。セクション 4</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>3188-5023</td><td>プラスチック圧縮セクション 4.氷の上を保つ&nbsp;プラスチック圧縮で使用する場合</td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644</td><td>In vitro培養;セクション5</td></tr>エ<tr><td>チロン(皮膚縫合糸用の非吸収性モノフィラメント)</td><td>エチコン</td><td></td><td>手術、セクション1</td></tr>ウ<tr><td>シ胎児血清(FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437-036</td>プラスチック<td>圧縮セクション4</td></tr><tr><td>鉗子(歯付きアディソン)</td><td></td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr>ガー<tr><td>ゼ(Gazin Mullkompresse)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>ハムのF12</td><td>Gibco</td><td>31765-027</td><td>プラスチック圧縮セクション4</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>Histolab</td><td>1820</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>湿度チャンバー</td><td>DALAB</td><td></td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr>ヒ<tr><td>ドロコルチゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>in vitro培養;セクション5</td></tr><tr><td>過酸化水素溶液 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr>イン<tr><td>スリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3536</td><td>in vitro培養;セクション5</td></tr>イ<tr><td>ソフルラン</td><td>イソフルラン、バクスター、ディアフィールド、イリノイ</td><td></td>州手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>リドカイン5 mg / ml</td><td>キシロカイン、アストラゼネカ、スウェーデン</td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>ル<tr><td>コース25&thinsp;mg / ml</td><td>バクスター、ディアフィールド、イリノイ州</td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>マーカー<tr><td>ペンパップペン</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>Z377821-1EA</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>メデトミジン 25 &mu;g/kg&nbsp;</td><td>ドミトール、オリオンファーマ、スウェーデン</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>ミンチデバイス</td><td>Applied Tissue Technologies LLC</td><td></td><td>ミンチ組織の準備、セクション2</td></tr><tr><td>モノクリル(吸収性モノフィラメント)</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Surgery、セクション1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>NaOH 1&nbsp;N</td><td>Merck Millipore</td><td>106462</td><td>プラスチック圧縮セクション 4 および細胞培養</td></tr><tr><td>ナイロンメッシュ、110 &mu;M厚孔径 0.04&nbsp;sqmm</td><td></td><td></td><td>プラスチック圧縮;セクション4</td></tr><tr><td>Oculentum simplex APL:目の保護のための軟膏</td><td>APL</td><td>Vnr 336164</td><td>Surgery、セクション1</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>プラスチック圧縮セクション4</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>プラスチック圧縮セクション4</td></tr><tr><td>フェノバルビツール酸15&nbsp;mg/kg</td><td>ペントバルビタール、APL、スウェーデン</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>PCLニット生地</td><td></td><td></td><td>プラスチック圧縮;セクション4</td></tr>ラット<tr><td>テールコラーゲン</td><td>First LINK、Ltd、英国</td><td>60-30-810</td><td>プラスチック圧縮セクション4、氷上に保つ</td></tr><tr><td>メスの刃-15</td><td></td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>シェービングシャー手術</td><td></td><td></td><td>のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>ステンレスステルメッシュ、400&nbsp;&mu;M厚の細孔サイズ</td><td></td><td></td><td>プラスチック圧縮;セクション4</td></tr>滅菌<tr><td>手袋</td><td></td><td></td>手術<td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>滅菌<tr><td>ガウン手術</td><td></td><td></td><td>のための動物の準備、セクション1</td></tr>滅菌<tr><td>ドレープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterilium</td><td>Bode Chemie HAMBURG</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>縫合糸エチロン</td><td></td><td></td><td>動物のための準備手術、セクション1</td></tr><tr><td>TE溶液(抗原非マスキング溶液)は、10 mM Trisおよび1 mM EDTA、pH 9.0</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris/1 mM EDTAで構成されています。&nbsp; pHを9.0</td></tr><tr><td>次亜塩化チレタミン2.5に調整します。mg/kg</td><td></td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション 1</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>In vitro 培養;セクション5</td></tr><tr><td>トリズマ基地、H2NC&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td>免疫<td>細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>ベクターVIPキット:酵素&nbsp;ペルオキシダーゼ基質キット</td><td></td><td>ベクターSK4600</td><td>免疫細胞化学;セクション6</td></tr><tr><td>Vicryl(吸収性ブレード)</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Surgery、セクション1</td></tr><tr><td>Tris緩衝液pH 7.6(洗浄緩衝液)</td><td></td><td></td><td>TE溶液:60.6 gトリス(Trizmaベース、H2NC(CH2OH)3、 M = 121.14 g / mol)、800 mlの蒸留水を加え、pHを7.6まで調整し、87.7 gのNaClを加えて蒸留水で1,000 mlまで満たします。蒸留水で1倍に希釈します。</td></tr><tr><td>X-tra solv (溶媒)</td><td>DALAB</td><td>41-5213-810</td><td>免疫細胞化学;セクション6。ヒュームフードの下で使用</td></tr><tr><td>ゾラゼパム次亜塩素酸</td><td>ゾレチル、ビルバック、フランス</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>脱毛ワックスストリップ</td><td>Veet</td><td></td><td>手術のための動物の準備、セクション1</td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>Lundbeck</td><td></td>終了<td>、セクション3</td></tr></tbody></table>

圧縮されたコラーゲンで細分化した組織：シングル段再建修復のための細胞含有biotransplant

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

組織工学目的での細胞増殖と自家細胞の移植のための従来の技術は、特別に装備されたヒト細胞培養施設で行うことができます。これらの方法には、単一細胞懸濁液中の細胞の単離や、患者への移植前のいくつかの面倒で時間のかかるイベントが含まれます。これまでの研究では、患者に移植する前に組織や細胞の生体外操作を最小限に抑えるために、体自体を細胞増殖や組織再生のためのバイオリアクターとして使用できることが示唆されています。本研究の目的は、組織採取、連続上皮の単離、上皮の小片化、3層構造の生体材料への組み込み方を実証することであった。その後、3層構造の生体材料は、外科的取り扱い、移植全体での栄養交換、および制御された分解を可能にする送達手段として機能しました。生体材料は、コラーゲンの2つの外層と、機械的に安定してゆっくりと分解されるポリマーのコアで構成されていました。ミンチした上皮は、移植前にコラーゲン層の1つに組み込まれていました。上皮組織を細かく刻むことで、その断片を広げることができ、それによって細胞の増殖が促進されました。移植の最初の撮影後、細胞の増殖と再編成が起こり、細胞外マトリックスが成熟して、毛細血管と神経の内成長と細胞外マトリックスのさらなる成熟が可能になります。この技術は、生体外操作を最小限に抑え、細胞採取、自家移植片の調製、および患者への移植を簡単な1段階の介入として可能にします。将来的には、患者の特定のニーズに応じて、体内の3D金型の周りで組織の拡張を開始することができます。さらに、この技術は、高度な細胞培養施設を必要とせずに、通常の手術環境で実行できます。

この研究は、コラーゲンやミンチ組織の塑性圧縮を使用して、移植のための生体材料を製造する方法を示しています方法を提示します。 膀胱粘膜や皮膚を採取した後、機械的に小さい粒子（ 図3）にみじん切りすることができます。プラスチック圧縮することにより、みじん切り粒子は、コラーゲンゲル（ 図4）の外側層内に機械的に強固である中央に生分解性ポリマーとの複合足場内に組み込まれています。 6膨張率：細分化した組織粒子は、1を可能にするために分離することができます。コラーゲンの水分を押し出すことによって、自己の再建手術のためbiotransplantが完了する。 Biotransplants は 、インビトロでのさらなる研究のために、通常の細胞培養環境中でのインビボ調査研究又は培養のために動物に自家移植のために使用することができます。 T<html>彼複合自家移植片...

組織工学は、多くの場合、組織再生のための自家移植を作成するためにインビトロで拡張に含まれます。この研究では、組織拡張、再生、およびin vivoでの再構成のための方法は、体外細胞および生体物質の処理を最小限にするために開発されました。

圧縮されたコラーゲンで細分化した組織：シングル段再建修復のための細胞含有Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

以下の手順の全体的な目的は、再建手術中に自家組織を移植して増殖させることです。これは、まず目的の組織から生検試料を採取することで行われます。次に、生検試料を細切し、プラスチック圧縮ポリカプロラクトン（PCL）コラーゲン自家移植片を作製します。次に、PCLと自家切削組織を統合して3Dスキャフォールドを作製します。ここでは1対6の膨張率を用いています。その後、このスキャフォールドを被験者に移植します。最終的に、自家移植組織の再生は、スキャフォールドおよび細切組織粒子内における細胞の増殖と再編成の免疫組織化学的解析によって評価できます。この手法を、動物モデル、皮膚、および尿路上皮を用いて実演します。本技術の意義は、重度の組織形成不全がある組織の治療や、外科的修復に必要な組織が著しく不足している外傷後の症例への応用にまで及びます。in vitro 培養などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、単一段階の手術手順として実施できることです。組織の採取から移植までのステップは無菌状態で行う必要があるため、本手法の視覚的な実演が極めて重要となります。ブタの膀胱生検検体を得るには、まず鉗子で膀胱を把持し、滅菌済みのメジャーを用いて組織の寸法を測定します。次に、滅菌したペンを使用して、1〜6倍の拡張率を目指し、2×1 cmの楕円形の生検部位をマークします。その後、メスでマークした組織を切り出し、膀胱生検検体を滅菌条件下でDMEMに浸します。皮膚生検検体を採取する場合は、皮膚切除器（ダーマトーム）を使用して、厚さ0.3 mmの部分層検体を採取します。次に、組織をDMEMに入れ、創傷部位をドレッシング材で覆います。続いて、膀胱生検組織をDMEMで2回洗浄し、粘膜面を上にして滅菌済みの解剖プレート上に移します。解剖ピンを用いて検体の一方をプレートに固定し、微細剪刀とピンセットを使用して、粘膜組織を排尿筋から分離します。次に、粘膜の上にミンシングデバイスを置き、組織の端から端まで垂直および水平に動かして、0.8 by 0.8 millimeterのミンシング組織片を得ます。この際、デバイスを組織に押し付けながら動かす必要があることに注意してください。プラスチック圧縮コラーゲン自家移植片を調製するには、まず、10X DMEM（コラーゲンtype I添加）に、培地の色が濃い黄色からピンク色に変わるまで、通常の水酸化ナトリウムを1滴ずつ加えます。pHが7.4から8であることを確認した後、2 mLのDMEMを溶液に慎重に混ぜ合わせます。次に、約2 mLのコラーゲンを20x30x10 mmの鋼製長方形型ウェルに分注し、10分間インキュベートします。コラーゲンが凝固したら、ゲル化したコラーゲンの上に適切な量のPCLバイオマテリアルを載せ、残りの6 mLのコラーゲンをPCLの上に注ぎます。型をインキュベーターに戻し、さらに20分間静置します。次に、滅菌済みの表面にガーゼパッドを厚く積み重ねます。その上に、厚さ400 µmのステンレスメッシュを置き、さらに厚さ110 µmのナイロンメッシュシートを重ねます。コラーゲンゲルをナイロンメッシュ上にそっと転写し、長方形のスチール製型を慎重に取り除きます。細切にした組織をコラーゲン上に転写します。ここでは、1～6倍の拡大率を目指します。次に、コラーゲンゲルと組織の上に新しいナイロンメッシュの層を重ね、その上に2枚目のスチールメッシュを置き、さらに最低120 gの荷重プレートを載せます。5分後、自家移植片から荷重プレート、スチールメッシュ、およびナイロンを取り除きます。自家移植片をin vitroで培養する場合、まず薄くなった構築物を12ウェルプレートに収まる十分な小ささに切断します。次に、各ウェルに1 mLの角化細胞培地を加え、組織を3～6週間培養します。細切した膀胱粘膜の自家移植片をブタの膀胱に移植するには、移植片をDMEMで湿らせます。その後、細い走行モノフィラメント縫合糸を用いて、構築物を健康な組織に移植します。留置尿道カテーテルを通して膀胱に生理食塩水を注入し、グラフトが水密であるかを確認します。細切した皮膚表皮を用いた自家移植片を全層創に移植する場合、DMEMでグラフトを湿らせます。次に、自家移植片の四隅と中央を断続縫合し、構成体を皮膚全層創の底部に固定します。最後に、湿潤状態を維持するために、創傷部をプラスチックドレッシングで覆います。この微小片化皮膚自家移植の画像で観察されるように、複合バイオグラフトは、把持、縫合、および外科的な操作に耐えることができます。in vitro 培養中の異なる時点における免疫組織化学染色では、細胞が増殖、遊走し、その細胞表現型に典型的な微細構造を持つ連続的な上皮へと再編成されることが示されています。例えば、2週間後、皮膚自家移植片の表面の細胞層は約2層の厚さになります。右側に示すように、同じ培養期間後の膀胱上皮は約8層の厚さになります。5～6週間後には、細切皮膚上皮および細切膀胱粘膜の自家移植片の両方において、連続的な上皮は約8～10層の細胞厚になります。in vitroでの組織拡張と比較して、この手法は迅速で手間が少なく、高度な研究設備を必要としません。さらに、すべての部品がFDA承認済みであるため、標準的な外科的環境での使用が可能です。この手順を行う際は、ゲル、バイオトランスプラント、および自家組織を無菌条件下で調製することが重要です。本手順や、細胞のin vitro培養などの他の手法を併用することで、細胞の増殖および分化に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。この技術が発展すれば、再生医療分野の研究者に新たな道を切り開く可能性があります。これにより、自家組織エンジニアリング移植を用いて、皮膚や泌尿器系の深刻な奇形を治療できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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