Name: ES細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 40 s
Description: 学ぶES細胞を用いたハイスループットスクリーニング法で、マウスのストレス抵抗性遺伝子を同定し、長寿研究のためのマウスモデルを効率的に作成する方法です。老化と健康寿命の遺伝的基盤を解明します。

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私たちは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBacトランスポゼースの贈り物に対して、ウェルカムトラストサンガー研究所に感謝したいと思います。 この研究は、コロラド州のブッチャー助成金とNIH R01 AG041801(W.S.C)によって支援されました。

<ol><li>Johnson, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity+genes+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+also+mediate+increased+resistance+to+stress+and+prevent+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inherit+Metab+Dis%22%5BJournal%5D)">Longevity genes in the nematode Caenorhabditis elegans also mediate increased resistance to stress and prevent disease.</a> J Inherit Metab Dis. 25, 197-206 (2002).</li>
<li>Murakami, S., Salmon, A., Miller, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+stress+resistance+in+cells+from+long-lived+dwarf+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Multiplex stress resistance in cells from long-lived dwarf mice.</a> Faseb J. 17, 1565-1566 (2003).</li>
<li>Perez, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+overexpression+of+major+antioxidant+enzymes+does+not+extend+the+lifespan+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The overexpression of major antioxidant enzymes does not extend the lifespan of mice.</a> Aging Cell. 8, 73-75 (2009).</li>
<li>Martin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+of+mice+to+test+the+oxidative+damage+theory+of+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+NY+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering of mice to test the oxidative damage theory of aging.</a> Ann NY Acad Sci. 1055, 26-34 (2005).</li>
<li>Chick, W. S., Drechsel, D. A., Hammond, W., Patel, M., Johnson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+mutant+phenotypes+from+ES+cells+to+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Transmission of mutant phenotypes from ES cells to adult mice.</a> Mamm Genome. 20, 734-740 (2009).</li>
<li>Ramirez-Solis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+DNA+microextraction%3A+a+method+to+screen+numerous+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genomic DNA microextraction: a method to screen numerous samples.</a> Anal Biochem. 201, 331-335 (1992).</li>
<li>Uren, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+splinkerette-PCR+method+for+the+isolation+and+sequencing+of+retroviral+insertion+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput splinkerette-PCR method for the isolation and sequencing of retroviral insertion sites.</a> Nat Protoc. 4, 789-798 (2009).</li>
<li>Wang, W., Bradley, A., Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+piggyBac+transposon-based+genome-wide+library+of+insertionally+mutated+Blm-deficient+murine+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A piggyBac transposon-based genome-wide library of insertionally mutated Blm-deficient murine ES cells.</a> Genome Res. 19, 667-673 (2009).</li>
<li>Chick, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+stress-resistance+mutations+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Screening for stress-resistance mutations in the mouse.</a> Front Genet. 5, 310(2014).</li>
<li>Salmon, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+cell+lines+from+young+adult+mice+of+long-lived+mutant+strains+are+resistant+to+multiple+forms+of+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Fibroblast cell lines from young adult mice of long-lived mutant strains are resistant to multiple forms of stress.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 289, 23-29 (2005).</li>
<li>Skarnes, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+gene+trap+resource+for+mouse+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">A public gene trap resource for mouse functional genomics.</a> Nat Genet. 36, 543-544 (2015).</li>
<li>Baker, K. E., Parker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense-mediated+mRNA+decay%3A+terminating+erroneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nonsense-mediated mRNA decay: terminating erroneous gene expression.</a> Curr Opin Cell Biol. 16, 293-299 (2004).</li>
<li>Shigeoka, T., Kawaichi, M., Ishida, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+nonsense-mediated+mRNA+decay+permits+unbiased+gene+trapping+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Suppression of nonsense-mediated mRNA decay permits unbiased gene trapping in mouse embryonic stem cells.</a> Nucleic Acids Res. 33, e20(2004).</li>
<li>Symula, D. J., Zhu, Y., Schimenti, J. C., Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+annotation+of+mouse+mutations+in+embryonic+stem+cells+by+use+of+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Functional annotation of mouse mutations in embryonic stem cells by use of expression profiling.</a> Mamm Genome. 15, 1-13 (2004).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

フォワード遺伝子解析により、特定の表現型に関与する遺伝子についてゲノムを偏りなく調べることができます。 この方法は、新しい遺伝子機能を明らかにするのに非常に強力です。 これは、主にそれに伴うインフラストラクチャとロジスティクスに関連する非常に高いコストのために、低等生物では広く使用されていますが、マウスなどの哺乳類では広く使用されていません。 ここでは、遺伝子スクリーニングプロセスをES細胞培養プラットフォームに移行し、変異体の生成と変異の同定における効率とスループットを大幅に向上させました。 
耐性変異体を効果的に選択するには、致死量のストレッサーと治療期間を確立して、すべての野生型細胞が死滅させる必要があります。 選択の厳密さが高いほど、誤検知の発生は少なくなります。 線維芽細胞フィーダーは、ES細胞よりも酸化ストレスに対する耐性が高いです。フィーダーの存在は、ストレッサーによって死滅する近くのES細胞を救出します。 したがって、ストレス選択中のフィーダーの省略は、効果的な殺傷のために非常に重要でした。 皮膚線維芽細胞では、長命マウスのストレス耐性表現型を明らかにするために血...

長寿はストレス耐性との親密な関係を持っています。一般的には、長寿命の種は、多くの場合、過酸化水素、パラコート（PQ）、UV、熱、及び重金属1,2のような複数のストレスに向かって抵抗が増大し実証します。対照的に、ストレスに対する感受性の増大を短縮寿命および/または複数の疾患を起こしやすい表現型を予測する傾向があります。抗酸化掃気経路は長く、動物にストレス耐性を付与するに主要な役割を果たしていると推測されています。しかし、いくつかの例外を除いて、様々な抗酸化酵素 （例えば、SOD）での操作とトランスジェニック動物の多様からの研究では、酸化剤捕捉酵素のレベルを増加させると、寿命や健康スパン3を増加させないことを示しています。これらのデータは、一貫して長寿命の動物で観察されたストレス耐性形質がまだ発見される他の細胞経路によって媒介されることを示唆しています。 我々は公平な前進を取りました上に変異遺伝子を同定するための遺伝学的アプローチは、培養された胚性幹（ES）細胞におけるストレス耐性表現型を付与することができました。 ES細胞は、この研究において二つの大きな利点を提供する：（1）高度な遺伝子操作は、ES細胞のゲノムを改変するために利用可能です。 （2）画面から回収ストレス耐性ES細胞を直接全動物試験への急速な変換が寿命及び健康スパンを測定することができ、マウスの製造に使用することができます。 本稿では、BLMの対立遺伝子が、テトラサイクリン応答性エレメントの制御下にあったここでC9のES細胞株の使用を説明しました。ドキシサイクリン（DOX）の治療は、一時的に姉妹染色分体交換の増加事件につながるBLMの発現をオフになっています。この短期BLMノックアウトストレス耐性の劣性突然変異はスクリーニングプロセスで捕捉できるようにヘテロ集団内のホモ接合変異を生成するために許可されています。我々また、ランダムにゲノム中の遺伝子を変異させるポリトラップカセット（PB-UPA）を挿入するための変異原としてのpiggyBac（PB）、トランスポゾンの使用を記載しています。ポリトラップによる遺伝子の破壊を有する細胞はG418耐性となり、遺伝子トラップ変異体（遺伝子トラップライブラリー）の収集が行われ、その後、ストレス耐性た変異体クローンについてスクリーニングすることができるように回収することができました。 選択から回収したストレス耐性クローンは、挿入の数（定量PCR）の点で、分子技術によってかなり迅速に特徴付けることができ、挿入部位（splinkerette PCR）、破壊された遺伝子（BLAST）の正体、およびその発現レベル（ RT-qPCRを）。 PBの挿入は、野生型DNA配列を復元するため、ストレス耐性の損失をテストするために、クローンでMPBトランスポザーゼの一過性発現によってremobilizedすることができます。これらは、前に行われるべきである変異の因果関係を確認する強力な方法であります高価なマウスの生産に。以前の研究では、ストレッサーにさらされた細胞は、その多能性4,5を失ったことを示しました。したがって、このプロトコルでは、ストレス因子で処理されない変異体細胞の複製セットの保存が成功したマウスの生産のために重要です。 私たちの研究室では、両方が要求に応じて他の研究者に利用可能であり、C9 ES細胞株およびPB-UPAベクトルを開発しました。プロトコルは、ここで報告されたストレス耐性クローン（ 図1B）を分離するためにレプリカプレーティング、ストレスの選択に続いて、PB-UPA（ 図1A）との遺伝子トラップされたES細胞のデノボライブラリーの生成によって開始されます。我々はパラコート、細胞内で強力なラジカル発生剤を用いた選択性を示しました。事実上、任意の細胞毒性化合物または毒素、例えば、ERのストレス要因（例えば、タプシガルギンおよびツニカマイシン）、神経細胞の酸化剤（例えば、MPP +、6-ヒドロキシドーパミン、およびロテノン）、熱、および重いです金属（ 例えば、CD、SE）は、それぞれの耐性変異株を選択するための方法に適合させることができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Vector</td></tr><tr><td>PB-UPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mPBase mPBase</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tissue Culture</td></tr><tr><td>500-ml Stericupフィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>250-ml Stericupフィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Steriflip-GV フィルター</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M179M6</td><td></td></tr><tr><td>KO DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Tissue Culture Biologicals</td><td>104</td><td></td></tr><tr><td>Heat Inactivated FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>&β;-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>二塩化ビオロゲンメチル (パラコート)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>856177</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド Hybri-MAX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMAX 0.1% ゼラチン</td><td>EMD ミリポア</td><td>ES006B</td><td></td></tr><tr><td>DPBS/Modified</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>T25 フラスコ</td><td>コーニング</td><td>353108</td><td></td></tr><tr><td>T75フラスコ</td><td>コーニング</td><td>353135</td><td></td></tr><tr><td>100mm&nbsp; プレート</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>150mm&nbsp; プレート</td><td>コーニング</td><td>430599</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル&nbsp; プレート</td><td>コーニング</td><td>3585</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルU底プレート</td><td>コーニング</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>50mlリザーバー&nbsp;</td><td>Corning</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>VWR International, LLC</td><td>82050-276</td><td></td></tr><tr><td>初代マウス胚性線維芽細胞</td><td>EMD ミリポア</td><td>PMEF-NL</td><td></td></tr><tr><td>DR4 マウス胚性線維芽細胞</td><td>Applied StemCell</td><td>ASF-1001</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td></td><td></td>BP25312</tr><tr><td>Geneticin (G418)</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>フィッシャーバイオ試薬&nbsp;</td><td></td><td></td>BP26531</tr><tr><td>クライオチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5702</td><td></td></tr><tr><td>TC10 cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting Slides (TC10用)</td><td>Bio-Rad</td><td>1450011</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electroporation</td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell</td><td>Bio-Rad</td><td>1652611</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Cuvettes (4&#160;mm gap)</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1652088</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Molecular Biology</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercylcer ep Gradient&nbsp;S</td><td></td></tr><tr><td>Puregene Core kit B</td><td>Qiagen</td><td>158745</td><td></td></tr><tr><td>Topo-TA クローニングキット</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>450030</td><td></td></tr><tr><td>大容量cDNA合成キット</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>100%エタノール</td><td>デコンラボラトリーズ(株)</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Double Processed Tissue Culture Water</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>Sau3A1</td><td>New England BioLabs</td><td>R0169L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">96-well Lysis Buffer (Ramires-Solis et al. 1992)</td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーバイオ試薬&nbsp;</td><td>A144-212</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine ナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5777</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase-K</td><td>Fisher BioReagents&nbsp;</td><td>BP1700</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Electrophoresis</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4469EDU</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose&nbsp;</td><td>GeneMate</td><td>E3120500</td><td></td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド&nbsp;</td><td>フィッシャーバイオ試薬&nbsp;</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>100 BP DNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3231S</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3232S</td><td></td></tr><tr><td>2ログDNAラダー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N3200L</td><td></td></tr></tbody></table>

es細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ

Forward Genetic Approach to Uncover Stress Resistance Genes in Mice &#8212; A High-throughput Screen in ES Cells

>jove_content<マウスにおける表現型駆動型遺伝子スクリーニングは、遺伝子機能を明らかにするための強力な技術ですが、しばしば非常に高いコストによって妨げられ、その可能性は著しく制限されています。 ここでは、マウス胚性幹細胞(ES)細胞を代理細胞として使用して目的の表現型をスクリーニングし、その後、これらの細胞を宿主胚に導入して、表現型を持つ生きたマウスに成長させる方法について説明します。 この方法は、(1)哺乳類細胞の遺伝子スクリーニングのための費用対効果の高いハイスループットプラットフォームを提供します。(2)変異した遺伝子を特定し、因果関係を検証するための迅速な方法。(3)全動物研究のために、これらの選択されたES細胞から直接マウス変異体を開発するための近道。 パラコート(PQ)を使用して耐性変異体を選択し、酸化ストレス耐性を付与する変異を特定することを実証しました。 他のストレッサーや細胞毒性化合物も、耐性変異体のスクリーニングに使用され、さまざまな細胞ストレス耐性の新規遺伝的決定要因を明らかにすることができます。

典型的な突然変異誘発実験では、トランスフェクションは、PB-UPAとMPBトランスポゼースで3×10 7 ES細胞の合計で構成されています。 2つの独立した実験で生成された遺伝子トラップされたES細胞の数を表1に要約されている。遺伝子取り込みの効率は約0.04％です。組み合わせ遺伝子トラップライブラリは、マウスゲノム（23000コードする遺伝子）を完全にカバー約22,400の独立した変異体を含みます。過剰なカバレッジを繰り返し変異誘発を介して複数の変異体を生成し、および/またはプロセスをスケールアップすることによって達成することができます。 遺伝子トラップライブラリーは、ランダム変異を含むので、ストレス耐性の表現型を有する変異体の数を予測することは不可能です。 PQ抵抗のための2つの独立した選択を行いました。 22440独立した遺伝子トラップ突然変異の組み合わせスクリーニングはPQに対する細胞の抵抗（0.08％）（ 表1）を付与する17の変異を発見しました。 &lt;Pクラス= &q...

ストレス耐性は、長寿のための顕著な特徴の一つであり、遺伝的に支配されることが知られています。ここでは、寿命試験のためのマウスモデルを開発したとのES細胞におけるストレス耐性を付与する突然変異をスクリーニングするために公平な高スループットの方法を開発しました。

ES細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ

Phenotype-driven genetic screens in mice is a powerful technique to uncover gene functions, but are often hampered by extremely high costs, which severely ...

本手法の全体的な目的は、ストレス耐性を持つ変異胚性幹細胞を効率的に選択し、関連遺伝子を迅速に特定し、費用対効果高く生存可能なマウスモデルを作製することです。本手法は、老化分野における重要な疑問への回答に役立ち、ストレス耐性や哺乳類の健康寿命および寿命の延長に関与する遺伝子の特定を可能にします。したがって、本技術の利点の一つは、新規変異体の費用対効果の高い選択が可能であること、およびサロゲートモデルとしての胚性幹細胞スクリーニングに続き、表現型マウスモデルを作製できることです。ES細胞の培養を開始するには、まず、ES細胞培養のフィーダー細胞として使用する、マイトマイシンCで活性化したマウス胚性線維芽細胞（PMFs）のバイアル1本を37°Cのウォーターバスで融解します。細胞を5 mLのES細胞培地に転移し、100 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を30 mLのES細胞培地に再懸濁します。細胞を100 mmプレート2枚とT 25フラスコ2本に分配します。細胞を37 °C、5% CO2条件下で24時間インキュベートします。次に、C9 ES細胞1バイアルを37 °Cのウォーターバスで融解させます。細胞を5 mLのES細胞培地に移し、100 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞を5 mLのES細胞培地で再懸濁します。その後、フィーダー細胞を含むT 25フラスコのいずれかに播種します。37°C、5% CO2条件下でインキュベートします。培地は毎日交換してください。2日後、ES細胞が約80%コンフルエントになった時点で継代します。これらの細胞を5 mLのPBSで1回洗浄し、0.25% trypsin EDTAを2.5 mL加えて37 °Cで10分間インキュベートします。次に、ES細胞培地を2.5 mL加え、ピペッティングを15回行い、細胞塊を分散させます。細胞を15 mLコニカルチューブに移し、100 ×gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、細胞ペレットを4 mLのES細胞培地で再懸濁します。次に、細胞を1 mLずつ、9 mLのES細胞培地を含む2枚の100 mmプレートに移します。プレートを細胞培養インキュベーターで培養し、毎日培地を交換して、ライブラリー作製用の96ウェルフィーダープレートを調製します。マイトマイシンCで不活化したPおよびmfsのバイアルを3本ずつ解凍し、各バイアルを33.3 millilitersのESL培地で再懸濁します。これらの細胞を合わせて、このプレートから100 milliliterの細胞懸濁液を作成します。24時間後、10枚の96ウェルプレートの各ウェルに100 microlitersの細胞を分注します。100 mmプレートで培養したC9 ES細胞をトリプシンで回収します。細胞数を算出した後、5 × 10⁶個のES細

forward-genetic-approach-to-uncover-stress-resistance-genes-mice-high

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、タンパク質の発現と局在の後胚レギュレータを識別するための増感方法について説明します。...

の後胚表現型を識別するためのRNAiスクリーニング C.エレガンス</em

我々はすぐに識別し、マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を特徴付けるための蛍光レポーターアッセイを説明します。...

マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ

マウス卵母細胞のマイクロインジェクションは、古典的なトランスジェネシス（ すなわち、トランスジーンのランダム組込み）およびCRISPR媒介遺伝子ターゲティングの両方に一般的に使用される。このプロトコールは、マイクロインジェクションの最新動向をレビューし、特に品質管理とジェノタイピング戦略を重視しています。...

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

このプロトコルでは、出芽酵母でタンパク質に基づく継承のため画面の機能的に高スループット方法論について説明します。...

出芽酵母におけるタンパク質ベース継承の高速スクリーニング

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。...

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

シャペロン-シャペロンとシャペロン基質相互作用を研究するために、我々は、軽度の突然変異またはシャペロンの過剰発現と組み合わせてRNA干渉を使用して カエノハブディティス・エレガンス...

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

読み出しとしてCa2+の標高に基づく前方遺伝的スクリーンは、植物のカルシウム依存性シグナル伝達経路に関与する遺伝的成分の同定につながる。...

トランスジェニックカルシウムレポーターエークオリンを用いたニューシグナル伝達の新しい標的の同定を用いた遺伝子スクリーンの前方

神経精神疾患の病因における最近発見された疾患関連遺伝子の役割は依然として不明瞭である。子宮エレクトロポレーション技術における修飾された両側性は、ニューロンの大規模集団における遺伝子導入と、社会的行動に対する遺伝子発現変化の原因の影響の検討を可能にする。...

子宮内電散法における両側性を用いたパイプラインによるげっ歯類の行動に対する遺伝的影響の調査

この研究は、 シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー遺伝子スクリーニングのプロトコルについて説明しています。このスクリーニングでは、ゲノムワイドなプラスミドライブラリを使用して、クエリ変異株に関連する機能喪失表現型のサプレッサークローンを特定します。 ell1...

シゾサッカロミセス・ポンベにおけるマルチコピーサプレッサー同定のための遺伝子スクリーニング

人工多能性幹細胞(iPSC)に由来するニューロン、初代皮質ニューロン、およびアストロサイトからなる共培養システムを生成するためのプロトコルが説明されています。この共培養システムにより、新しいiPS細胞由来ニューロンとチャネルロドプシン-2を発現する既存の皮質ニューロンとの間のシナプス接触および回路の形成を検出することができます。...

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

学ぶES細胞を用いたハイスループットスクリーニング法で、マウスのストレス抵抗性遺伝子を同定し、長寿研究のためのマウスモデルを効率的に作成する方法です。老化と健康寿命の遺伝的基盤を解明します。

ES細胞におけるハイスループットスクリーニングを - マウスにおけるストレス抵抗性遺伝子を明らかにフォワード遺伝的アプローチ

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