Name: 静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 58 s
Description: 学ぶ、マウス胚を用いた口蓋剥離と静的器官培養法。口蓋融合のメカニズムを解明し、口唇口蓋裂の治療戦略開発に貢献する技術です。薬剤効果を評価し、発生生物学の理解を深めます。

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記載されている全ての手順は、ローカル機関動物実験委員会の事前承認を含む、脊椎動物の使用のためのガイドラインと規則に従って実行されなければなりません。 解剖インスツルメンツおよび培養培地の調製<ol><li>予備洗浄全ての機器は、3％過酸化水素で20分間121℃でオートクレーブに切開に使用します。フード内の真空吸引と0.22μmの細孔サイズのフィルターを使用して、抗生物質や抗真菌溶液でBGJbメディアをフィルタリングします。 </li></ol>文化機器の調製<ol><li> 70％のアルコールでスプレー、小さな三角形で口蓋器官をサポートするポリカーボネートメンブレンフィルターをカットし、それらを乾燥させます。器官培養プレート上で、清潔で滅菌正三角形状のワイヤグリッド（20ミリメートル）を配置することにより、センターウェル器官培養皿（60x15 mm）を用意します。そして、Bの1ミリリットルとよくを埋めますGJBメディア培養培地。注：メディアは舌を沈めることなく、グリッドのレベルに達するのに十分であるべきです。メンブレンフィルターを配置し、光沢のある側を下に、グリッドの上に（グリッドあたり3-4膜）実験に.Depending、治療（タンパク質、抗体または阻害剤）を培地に添加することができます</li></ol> 3.マウスの胚収集と文化のための準備<ol><li>野生型マウスの胚を得るために、使用は13.5妊娠CD-1マウスの遺伝的背景の歪みをタイムアウトしました。 70％エタノールで解剖エリアを清掃してください。 注：マウスの​​他の系統を使用することができます。私たちが原因大きなごみ番号のCD-1マウスを好みます。 </li><li>承認されたプロトコルを使用して死を保証するために、頸椎脱臼に続いて5％イソフルランとE13.5 DPC（日性交後）で妊娠マウスを安楽死させます。 </li><li>商品に腹部ヘアスティックを回避するために腹側腹部表面に70％エタノールをスプレーします。その後、腹側腹腔を開き子宮を見つけるために鋭い鈍い動作はさみとマイクロ解剖ピンセットを使用して。鉗子を使用して、子宮全体を持ち上げ、子宮体部で切断することにより、ライト動作ハサミで子宮角の先端に体から分離。 </li><li> （ケアおよび実験動物の使用のためのプロトコルガイドによる）を氷の上に清潔なペーパータオル上で子宮を置きます。汚染を防止するための別の清潔なペーパータオルで子宮をカバー。さらに使用する前に、70％エタノールのスプレーを使用して器具を滅菌します。子宮胚を氷上で実験室に輸送することができます。 </li><li>オープン層流フードでは、慎重に鋭い鈍い動作はさみとマイクロ解剖ピンセットを用いて卵黄嚢の小さな開口部を作ります。開口部が広いことを確認した後、静かに卵黄嚢から胚を体外に出すためにそれを押してください。 </li><li>冷リン酸緩衝生理食塩水1X（PBS）pH7.4でペトリ皿にすぐに胚を移します。適切な段階を保証するために、元ボディ、頭の大きさ及び四肢の形態のための解剖顕微鏡下で胚アミン。 注：開発の権利の段階ではない胚を実験に使用されていません。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig2.jpg" /> 図2.肢芽形態。前部と後肢が数字の間ウェビングインデント度がチェックされます。 E13.5では、すべての桁の縮合は非常に明確な登場数字の間のウェビングと遠位くぼみで、顕著です。後肢の桁が半日によって背後にある12上段：前肢、下段：後肢。 4.口蓋解剖<ol><li>解剖顕微鏡下でのPBSでペトリ皿の中で一度に一つの胚を置きます。小さな解剖ハサミとピンセットを使用すると、胚の本体からヘッドを分離します。 </li><li>慎重にピンセットで目の高さ以上のマウスの頭蓋骨を保持する（回避上顎プロセス）は、リップラインの両側にある2つの切開を行います。そして、下顎と舌を削除します。目の高さにカットすることによって上顎処理領域を分離し、脳、目、鼻中隔と隣接する組織を除去します。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig3.jpg" /> 図 3. 口蓋組織が ​​口蓋棚が上昇した13.5胚から採取したが、接触が行われていない。口蓋棚は静的モデルで72時間空気メディアインタフェースでのフィルタに器官培養に入れた。（A）レベル培養皿のE13.5胚の解剖。台形フィルター膜上に配置された解剖口蓋棚の（B）ブルー星解剖時に鉗子で組織を保持するための領域の境界を定める。（C）の表示。（D）は側面図の配置後味覚及び培地の添加を解剖しました。 <ol start="3"><li>後部に前方から東洋それを助けるために取り付けられた第一の味覚を保ち、口蓋口側を置き、鼻中隔とその周囲の組織を除去します。スプーンヘラを使用し、非常に慎重に培養皿にグリッド上に準備されたフィルターに（鼻側を下）口蓋棚を転送します。注：適切な空気メディア・インターフェースを可能にするために、メディアの音量を調整します。 </li><li>実体顕微鏡下では、一次口蓋を分析し、互いに近接口蓋棚を配置するためにピンセットを使用しています。彼らが接触するように配置されていない場合、口蓋棚が融合されません。口蓋の前方部分が配置されている三角形の膜フィル​​ターをカットします。台形形状は、口蓋の前方部分を局所化に役立ちます。 </li><li>培養口蓋棚単独で又は二種BGJb培地を使用して、同じ器官培養皿三有します。 </li></ol> 5.培養マウス口蓋棚<ol><li> TISSUをインキュベート72時間、加湿気体混合物（5％CO 2及び95％空気）中で37℃ES、及び培地を24時間毎に変更します。 </li></ol>組織学的分析のために6口蓋処理<ol><li> 4℃で4％ホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水のO / Nと文化の中で72時間後に舌を修正&#160; C.次に、静かに転送ピペットを用いてPBSで培養皿に組織を洗います。カセットを埋め込むには、実験室のワイプと場所の一部で舌を包みます。 注：実験用ワイプで口蓋をラップは、脱水工程の間に彼らの損失を防ぎます。 </li><li> 70％、80％以下の、通常のパラフィン包埋手順に続いて1時間100％エタノール洗浄、まで組織を脱水。埋め込むために、トレイに直面して口蓋の前方部分を配置します。 </li><li>後部に前方から冠状方向で連続6μmのセクションをカット。完全なセクションの口蓋は、350〜450 sectiが得られますアドオン。ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）。10得点、以前に説明した平均融 ​​合スコアを使用して、すべての20 番目のセクション （MFS）スケール（表1）を持つセクションを染色。8 </li></ol>

<ol><li>Nawshad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatal+seam+disintegration+to+die+or+not+to+die+that+is+no+longer+the+question%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Palatal seam disintegration to die or not to die that is no longer the question.</a> Developmental dynamics an official publication of the American Association of Anatomists. 237, 2643-2656 (2008).</li>
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</ol>

著者には競合する金銭的利益はありません。

この記事のプロトコルは、胎生13.5で胚から口蓋棚を解剖する方法を提供します。マウス胚から口蓋棚を、37℃で95％O 2、5％CO 2雰囲気中で無血清培地中で培養しました。成功口蓋解剖を安楽死させたマウスの胚時から培養終了までの手順の間、各段階で複数の要因に決定的に依存しています。口蓋融合に影響を与える最も重要な要因の一つは、器官培養を開始するのに要する時間です。胚は胎生13.5二次口蓋棚が水平であるようにする必要がありますが、（ 図1）を融合させるために開始していません。 処置中の別の重要な点は、卵黄嚢から胚の具象化です。このステップでは、顔の構造への損傷を防ぐために細心の注意が必要です。胚を嚢から除去されると、ヘッドから除去され本体両側から光ファイバ照明を有する実体顕微鏡で観察するペトリ皿に入れました。下顎と舌が口蓋を露出し、削除されます。脳と残留組織は、目の高さで除去されます。この時点では、棚の周りに上皮層を考慮することが重要です。これは、これらの細胞の完全性を維持するために非常に慎重に組織を操作するために必要です。上皮...

口腔顔面裂が最も優勢な頭蓋顔面の先天性欠損症です。また、考慮して可能なすべての頭蓋顔面の欠陥を取って、これらは、新生児2における第二の最も一般的な先天異常があります。裂口蓋は毎年約1米国ではすべての700の出産（米国）で発生し、口蓋裂の発生率は、裂け目月額味覚または3日目あたり裂と15人の子供を持って生まれた475人の子供に等しいです。毎年の展示世界中で生まれた子供の約1％頭蓋顔面​​異形学のいくつかのフォーム。 口蓋や唇の裂け目は、この異常を有する患者のための生涯の影響で非常に高価で複雑な手続きが必要です。経口裂と各患者の推定コストはおよそ$ 100,000個の4です。口唇口蓋裂を有する患者の治療は、頭蓋顔面外科医、耳鼻咽喉科医、遺伝学者、麻酔科医を含む医師のチームを必要とします音声言語病理学者、栄養士、歯科矯正医、補綴、心理学者、神経外科医、および眼科医。 palatogenesisでは、二次口蓋は最初垂直方向に成長し、舌の背の上口蓋棚の上昇を受けて対になった派生物として発生します。標高に続いて、対になった口蓋棚は（ヒトではマウスではE14.5 -E15で週9）正中線に向かって成長します。棚の先端をカバー内側縁上皮（MEE）は正中上皮縫い目を形成する接着します。 これは間葉合流を可能にするために間葉移行、および/またはアポトーシスの上皮が続きます。 MEEに反対の接着は、その変更口蓋裂の原因となる不可欠なイベントです。しかし、研究はわずか口蓋棚5の初期接着性を検討しました。骨芽細胞への間葉細胞の分化により硬口蓋フォーム。音部記号を生成することができます口蓋の発達異常tはまたは唇の関与なしに味覚。 口蓋器官培養技術は、過去30年間6,7に比べて多くのラボのために広く使用されていました。 このプロトコルでは、詳細に口蓋解剖し、静的な器官培養する方法を説明します。静止器官培養の利点は、口蓋棚の融合を可能にすることです。この技術は、多くの融合とシグナル伝達の実験8,9のために私たちの研究室で首尾よく使用されていました。しかし、技術の範囲は膨大であり、静的な器官培養系は、外因性の化学薬剤に対する応答の評価、異なる経路および特定のタンパク質における調節増殖因子の効果を含めて、必要なときにいつでも使用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53063/53063fig1.jpg" /> 図1.マウスPalatogenesis。マウス口蓋の発達段階。（BF）走査 ELE代表的な発達時期に二次口蓋のCTRON顕微鏡写真（SEM）。赤矢印：口蓋接着および融合の最初の部分を示しています。黄色の矢印：ポイント（PLOS 1から許可を得てカウフマン11より転載）融合後に消えますプライマリとセカンダリの口蓋との間の空間に。

<table><tbody><tr><td>BGJb</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>17-602E</td><td>100X</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td>100 x15 mm</td></tr><tr><td>センターウェルオルガン培養皿</td><td>ファルコン&nbsp;</td><td>#353037</td><td>60 x15 mm</td></tr><tr><td>ワイヤー三角グリッド</td><td>臓器培養皿によく合うようにステンレス鋼の金網でカスタムメイド。&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネートフィルター</td><td>GE&水とプロセス技術</td><td>K04BP04700</td><td>黒 0.4 ミクロン、47 mm</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>ZEISS&nbsp;Stemi SR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カルチャーフード</td><td>NUAIRE 層流</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子</td><td>Dumont Medical&nbsp;</td><td></td><td>#5</td></tr><tr><td>マイクロダイセクティングハサミ</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS14003-G</td><td>ヴァナスハサミ、ストレート、長さ8cm、先端0.1mm、刃5mm、ドイツ製</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS500086</td><td>ヴァンナス・ハサミ、ストレート、長さ8.5cm、先端0.025mm×0.015mm、刃7mmの</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>ケント・サイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS14127-G</td><td>スプリングハサミ湾曲、長さ10.5 cm、刃8 mm、ドイツ製</td></tr><tr><td>外科用カレット(スプーンヘラ)</td><td>Hu-friedy</td><td></td><td>CM 2/4</td></tr><tr><td>プロテクターラボラトリーフード</td><td>Labconco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Farma</td></tr><tr><td>Series11 ウォータージャケット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBSの&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>1倍</td></tr><tr><td>光ファイバー光源</td><td>ファイバーライト&nbsp;Dolan-Jenner</td><td>PL-750</td><td></td></tr><tr><td>埋め込みカセット&nbsp;</td><td>Statlab</td><td>EC301</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td></td><td>VWR470173-504</td><td></td></tr></tbody></table>

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

口唇口蓋裂は、すべての先天性欠損症の最も一般的なの一つです。正中上皮縫い目を形成するために付着上皮で覆われた間葉系の棚からの二次口蓋の形（MES）。理論は、MESの細胞が融合した口蓋1を作り、間葉移行（EMT）、アポトーシスおよび移行に対する上皮に従うことを示唆しています。 MESの完全な崩壊は、間葉系細胞とその周辺口蓋合流の最終不可欠相です。私たちは、口蓋の器官培養のための方法を提供します。 試験管プロトコルで開発された溶融中に生物学的および分子プロセスの研究を可能にします。この技術の用途は、外因性の化学薬剤に対する応答を評価するなど、規制および増殖因子と特定のタンパク質の効果数多くあります。口蓋器官培養は 、インビボ研究で使用したことはできない開発の様々な段階での操作を含む、多くの利点を有します。

技術は研究が口蓋融合のin vitroでのニコチンの催奇形効果をテストするために設計された以下のexperiments.Theの異なる種類に適用することができます。 2系統のマウスは、この実験のために利用された、CD1とC57.Palatal組織は、ニコチンヘミ硫酸塩の0.06と6 mMの濃度で処理しました。これは、口蓋融合パターンとタイミングは、2つの異なる株で異なっていたことが観察されました。 CD1マウスでは、対照群から口蓋棚は、時間依存的に融合し続けました。しかし、処理群のニコチンに特に6mMのニコチン濃度（ 図4A）での融合を遅らせました。 CD1マウスの味覚の組織学のセクションでは、コントロール標本における72時間後の全融合を示しました。ニコチンの低用量で口蓋棚が付着するが、上皮細胞は、培養3日後に残っています。ニコチンの高用量でインキュベート口蓋棚は、インキュベーションの72時間後に接触していませんでした。 <p class=対照群のC57マウスで &quot;jove_content&quot;&gt;、口蓋棚は、時間依存的に融合し続けました。試料は同じ時間（ ...

口蓋開発の研究は、口蓋裂、驚異的な健康の負担を課し、外観を損なうを持続残すことができ先天異常の発生率が動機とされています。ここでは口蓋の開発および融合に関与する種々のシグナル伝達経路を研究するために使用することができる培養口蓋棚の技術を実証します。

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

本手順の全体的な目的は、口蓋の摘出および静的臓器培養の方法について記述することです。まずマウス胚を回収し、次に下顎骨を除去して口蓋を摘出することでこれを達成します。最終ステップとして、口蓋棚を静的な器官培養に設置します。最終的に、培養物の平均融合スコアを評価することで、目的の特定の薬剤が口蓋融合に及ぼす影響を評価できます。この手法は、融合プロセスにどのような因子が関与しているかなど、口蓋の発達に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は、哺乳類であるマウスの口蓋融合に関する知見を提供できるだけでなく、鶏の口蓋など、他のモデル生物にも適用可能です（Maria SerranoおよびIsrael Ibrahimによる）。ここでは、私の大学院生がマウス胚を採取する手順を実演します。まず、妊娠13.5日のマウスの腹側表面を70% ethanolで清浄します。次に、鋭利な鈍端手術用はさみとマイクロ解剖用ピンセットを用いて、腹腔を開きます。続いて、子宮全体を持ち上げ、エタノールで滅菌した鋭利な鈍端手術用はさみとマイクロ解剖用ピンセットを使用して、子宮体部および子宮角の先端を切断し、子宮を体腔から分離します。卵黄嚢に慎重に小さな切開口を作ります。次に、切開口を広げ、卵黄嚢の組織をそっと押して胚を外部に押し出し、直ちに冷えたPBSを含むペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡下で、新鮮なPBSを入れた新しいペトリ皿に胚を移し、口蓋を一つずつ解剖します。1番目の胚の頭部を取り除いた後、ピンセットでマウスの頭蓋骨の目の上の部分を慎重に掴み、唇のラインの両側に2か所の切開を加えます。下顎と舌を除去します。次に、上顎突起領域を単離するため、目の高さで切開し、脳、目、鼻中隔、および隣接する組織を除去します。口蓋棚を鼻側を上にして置き、方向性を維持するために一次口蓋を付着させたまま、鼻中隔および周囲の組織を除去します。次に、スプーンスパチュラを用いて、口蓋棚を非常に慎重に、培地を入れた培養皿内に配置したグリッド上の準備済みフィルターに鼻側を下にして転送します。適切な気液界面を形成するように、培地の量を調整します。次に、解剖顕微鏡下で、口蓋の前部がある位置の三角形の膜を切断します。組織の前部分を方向付け、ピンセットを使用して口蓋突起を互いに近づけます。最後に、BGJB培地を用い、37°C、5% carbon dioxideの条件下で最大3つの口蓋を同一の器官培養皿で72時間培養し、24時間ごとに培地を交換します。本実験では、2種類の異なるマウス系統を用い、in vitroにおけるニコチンの口蓋融合に対する催奇形性効果を、CD-1マウスから単離した口蓋を用いて検討した。対照群の口蓋突起は時間依存的に融合を継続したが、ニコチン処理した口蓋では融合の遅延が見られ、特にC57マウスの口蓋において6 mMのニコチン濃度で顕著であった。対照群の口蓋突起は48時間で時間依存的に融合したが、0.6 mMのニコチンのみで処理したこれらのマウス口蓋の口蓋突起では、対照群の個体と比較して融合不全が認められた。このことは、CD-1マウスと比較してC57マウスがニコチン処理の影響に対してより高い感受性を有することを示唆している。この手法を行う際は、組織を慎重に扱うことが非常に重要です。このビデオを視聴することで、静的臓器培養の実施方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

この手順では、スパイラル輪部とらせん神経節ニューロンの有無にかかわらず、コルチ器のマウス器官の単離および培養のための方法を説明します。我々はまた、エレクトロポレーションにより、コルチ植の器官における外因性レポーター遺伝子の発現のための方法を示しています。...

初代培養およびコルチのマウス臓器のプラスミドエレクトロ。

我々は、と矯正装置から自然口腔バイオフィルムの構造と組成分析のためのプロトコルを提示...

蛍光in situハイブリダイゼーションおよび共焦点レーザー走査顕微鏡による口蓋パンダの口腔バイオフィルムの解析

我々は人間の茸状乳頭味細胞の長期培養を分離して維持するための再現可能なプロトコルを開発することを目的とした。生検で得られたヒト茸状乳頭由来の細胞が正常に生存率の低下なしに個以上の通路（12ヶ月）培養で維持した。...

人間の茸状の味覚乳頭細胞の単離および培養

ここでは、心臓と筋肉の前駆細胞とその微小環境の生物学を研究するための咽頭弓の培養プロトコルを提示します。...

咽頭アーチのex vivo培養は、ハートと筋前駆細胞とそのニッチを研究します

ここでは、共焦点顕微鏡法を用いたマウス二次口蓋融合のライブイメージングのためのプロトコールを提示する。このプロトコールは、様々な蛍光レポーターマウス系統と、および機械的洞察のための経路阻害剤と組み合わせて使用​​することができる。このプロトコールは、他の発生系におけるライブイメージングに適合させることができる。...

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

三次元切片培養マウス卵形嚢との蝸牛は光学的コラーゲン...

前庭と聴覚の感覚器官の三次元切片培養

本論文では、全体および無傷の味覚芽(それらを内面化する神経線維を含む)を一貫して生み出し、味覚芽内の構造と周囲の乳頭の構造間の関係を維持する全真菌形態、周回、口蓋味覚芽の組織調製、染色、分析の方法について説明する。...

菌体、円周体、口蓋味覚芽の全山染色、可視化、分析

我々は、二次元(2D)成長および創傷修復アッセイのタイムラプスイメージングのための一次マウス胚口蓋間葉細胞の単離および培養のためのプロトコルを提示する。また、タイムラプスイメージングデータの解析方法を提供し、細胞流の形成と指向運動性を決定します。...

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

本プロトコルは、成人マウス口蓋に由来する経口角化細胞の分離および培養について説明する。免疫染色を用いた評価方法も報告されている。...

成人マウス口蓋からの一次口腔角化細胞の分離と培養

ヒト鼻上皮細胞からの インビトロ...

ヒト鼻上皮オルガノイドの培養とイメージング

学ぶ、マウス胚を用いた口蓋剥離と静的器官培養法。口蓋融合のメカニズムを解明し、口唇口蓋裂の治療戦略開発に貢献する技術です。薬剤効果を評価し、発生生物学の理解を深めます。

静的器官培養を使用して口蓋の融合を研究の方法

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