Name: 溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぼう、溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜作製技術を。シリコン二酸化膜や金基板上で脂質二重層を形成し、膜タンパク質や創薬研究への応用を可能にする革新的な方法です。

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著者はNJCに国立研究財団（NRF -NRFF2011-01とNRF2015NRF-POC0001-19）、国立医学研究審議会（/ 0005/2012 NMRC / CBRG）、およびナンヤン工科大学からのサポートを認めることを望みます

親水性固体支持体上に支持された脂質二重層の形成1。 <ol><li> 10 mg / mlの1,2- dioleoyl- SN -glycero -3-ホスホコリンの脂質ストック溶液を準備します（DOPC）および1 mg / mlの1,2- dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine- N - （リサミンローダミンBそれぞれの脂質粉末を溶解することによりスルホニル）ロジウム（Rh-PE）は、（適切にイソプロパノール溶液中の分析物質収支）を事前に秤量しました。 </li><li>希釈し、最終濃度で、所望の脂質混合物を調製するために、イソプロパノール中ストック溶液を混合します。蛍光顕微鏡およびFRAP実験のために、0.5重量％のRh-PE脂質混合物中に含まれるべきです。 </li><li>それが満たされるまで、マイクロ流体チャネル内に、イソプロパノール中の脂質混合物を注入します。 </li><li>約10分間、ガラス表面上の脂質混合物をインキュベートします。 </li><li>徐々に非常に低い流量で、蠕動ポンプを用いて水または緩衝溶液と脂質溶液を交換（10〜50μL/分）。また、ピペッティングを繰り返すことにより、脂質混合物を交換してください。 </li><li>残留イソプロパノールを除去するために過剰の緩衝液で徹底的にチャンネルを洗い流します。 </li></ol>コレステロールに富む支持された膜の形成2。 注：固体表面（SiO 2）が小胞の融合をサポートしていますが、コレステロールに富む小胞は、高剛性30を曲げているため、膜組成物（高コレステロール）は、小胞融合を阻害します。 <ol><li>まずイソプロパノールで各粉末を溶解させて10 mg / mlのDOPCの脂質、10 mg / mlのコレステロール、および1mg / mlでのRh-PEを含むストック溶液を調製します。 </li><li>繰り返しは、ステップ2.1で調製したストック溶液を使用して、1.2から1.6を繰り返します。 </li></ol> 3.膜流動性アッセイ<ol><li> 10分間のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）溶液（1％）でガラススライドを浸します。 </li><li>脱イオン水で十分にスライドを洗浄し、ウィットをすすぎますHエタノール。 </li><li>ブロー乾燥窒素の穏やかな流れを使用してスライドを。 </li><li>酸素プラズマチャンバ内で最大の高周波電力で30秒間酸素プラズマにスライドを露出させます。 </li><li>ピンセットを使用して、底なしの商用マイクロ流体チャンバー（ 図1A）の保護フィルムコーティングを外し、チャンバー（ 図1B）の粘着面上にスライドガラスを取り付けます。 </li><li>チャンバーの入口と出口の位置にコネクタとチューブを組み立て、顕微鏡ステージ（ 図1C）にマイクロ流体チャネルを配置します。 </li><li>蛍光標識されたフォームは、マイクロ流体チャネルの[希望する脂質組成物の有機溶媒中に0.5重量％のRh-PEを含む（ 例えば 、0.5 mg / mlのDOPC）を使用して、手順1を繰り返し]を脂質二重層を支持しました。 </li><li>画像をキャプチャするために、60X油浸対物レンズ（NA 1.49）との二層面の位置を確認します。 </li><li> 2つの事前漂白画像を撮影し、フォトブリーチ301; 532 nmで、100 mWのレーザービームで広い円形スポットをメートル。その強度が安定するまで退色する前に、レーザーを温めます。すぐに退色した後、漂白スポットの蛍光強度の回復を追跡するために、2分毎に1秒の一連の画像をキャプチャします。 </li></ol> 4.コレステロール定量アッセイ<ol><li>酸素プラズマチャンバ内で最大の高周波電力で30秒間酸素プラズマに二酸化ケイ素でコーティングされた水晶センサーチップを露出します。チャンバーからチップを取り出し、すぐに測定室にチップをマウントします。 </li><li>実験の前に、第一の適切な取り付けを確実にするために、空気中のセンサチップの周波数と損失を取得します。 <ol><li>商業Q-センスE1またはE4 QCM-Dの機器については、Q-ソフトのソフトウェアプログラムを実行し、「取得」をクリックして、「セットアップ測定」を選択します。 </li><li>表示される新しいウィンドウでは、3、5、7をご確認ください、9、11、13倍音[検索]をクリックしますと、共鳴スペクトルをチェックするために実行します。 24で温度を設定します °C。一つ以上の共振周波数が期待値と一致していない場合は、チップ実装を確認し、合意に達するまで、この手順を再度実行します。 </li></ol></li><li>蠕動ポンプを起動し、100μL/分の流速で測定室に（10mMのトリス、150mMのNaCl、pH7.5）に緩衝​​液を流します。 </li><li>ソフトウェアプログラムでは、「取得」をクリックして、共振周波数とエネルギー散逸信号を記録するために、「再起動測定」を選択します。安定したベースラインが周波数と消費のシフトのために取得されるまで、この手順を繰り返します。注：以下の手順については、時間の関数として記録することができ、追加の周波数と消費のシフトが存在することになります。 </li><li> 10分間（脂質なし）イソプロパノールを注入します。 </li><li>でDOPC脂質/コレステロールとの混合物を注入します10分間イソプロパノール中0.5 mg / mlの総脂質濃度が所望のモル比。 </li><li> 100μL/分の流速で20分間のバッファを注入します。 </li><li>周波数信号が安定した値に達するまで緩衝液（流速100μL/分）で調製した1mMのメチルβシクロデキストリン溶液（MβCD）を注入します。 </li><li> MβCD処理工程によって引き起こされる相対的な正の周波数シフトを測定し、[量Δm=のSauerbrey式を用いて質量値にΔfのCHOおよび ΔfのDOPCの値を変換することにより、コレステロールおよびDOPCの脂質の質量を計算- （C / N）× Δfを、C = 17.7 NG / cm 2であり、nは：倍音]。 </li><li>アカウントにDOPC脂質（786.1グラム/モル）及びコレステロール（386.6グラム/モル）の分子量を取って、SLB中のコレステロールのモル分率を計算します。 </li></ol>

<ol><li>Sackmann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membranes%3A+Scientific+and+practical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supported membranes: Scientific and practical applications.</a> Science. 271, 43-48 (1996).</li>
<li>Kraft, M. L., Weber, P. K., Longo, M. L., Hutcheon, I. D., Boxer, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+of+lipid+membranes+analyzed+with+high-resolution+secondary+ion+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phase separation of lipid membranes analyzed with high-resolution secondary ion mass spectrometry.</a> Science. 313, 1948-1951 (2006).</li>
<li>Kalb, E., Engel, J., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+proteins+to+specific+target+sites+in+membranes+measured+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Binding of proteins to specific target sites in membranes measured by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biochemistry. 29, 1607-1613 (1990).</li>
<li>Bally, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Norovirus+GII.+4+Virus-like+Particles+Recognize+Galactosylceramides+in+Domains+of+Planar+Supported+Lipid+Bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Norovirus GII. 4 Virus-like Particles Recognize Galactosylceramides in Domains of Planar Supported Lipid Bilayers.</a> Angewandte Chemie International Edition. 51, 12020-12024 (2012).</li>
<li>Bally, M., Graule, M., Parra, F., Larson, G., Höök, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+virus+biosensor+with+single+virus-particle+sensitivity+based+on+fluorescent+vesicle+labels+and+equilibrium+fluctuation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">A virus biosensor with single virus-particle sensitivity based on fluorescent vesicle labels and equilibrium fluctuation analysis.</a> Biointerphases. 8, 10-1186 (2013).</li>
<li>Groves, J. T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+in+studies+on+immune+cell+adhesion+and+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers in studies on immune cell adhesion and communication.</a> Journal of Immunological Methods. 278, 10-1016 Forthcoming.</li>
<li>Mager, M. D., Melosh, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Bilayer+Deposition+and+Patterning+via+Air+Bubble+Collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Lipid Bilayer Deposition and Patterning via Air Bubble Collapse.</a> Langmuir. 23, 9369-9377 (2007).</li>
<li>Lenhert, S., Sun, P., Wang, Y., Fuchs, H., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+Parallel+Dip-Pen+Nanolithography+of+Heterogeneous+Supported+Phospholipid+Multilayer+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography of Heterogeneous Supported Phospholipid Multilayer Patterns.</a> Small. 3, 71-75 (2007).</li>
<li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+solid-supported+lipid+bilayers+by+spin-coating%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Preparation of solid-supported lipid bilayers by spin-coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li>
<li>Tamm, L. K., McConnell, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Supported phospholipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 47, 105-113 (1985).</li>
<li>Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+supported+planar+bilayers+by+fusion+of+vesicles+to+supported+phospholipid+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Formation of supported planar bilayers by fusion of vesicles to supported phospholipid monolayers.</a> Biochim Biophys Acta. 1103, 307-316 (1992).</li>
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<li>Cho, N. -J., Jackman, J. A., Liu, M., Frank, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-Driven+assembly+of+various+supported+lipid+platforms%3A+A+comparative+study+on+silicon+oxide+and+titanium+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">pH-Driven assembly of various supported lipid platforms: A comparative study on silicon oxide and titanium oxide.</a> Langmuir. 27, 3739-3748 (2011).</li>
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<li>Jackman, J. A., Choi, J. -H., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+osmotic+pressure+on+adhesion+of+lipid+vesicles+to+solid+supports%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Influence of osmotic pressure on adhesion of lipid vesicles to solid supports.</a> Langmuir. 29, 11375-11384 (2013).</li>
<li>Rossetti, F. F., Bally, M., Michel, R., Textor, M., Reviakine, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+titanium+dioxide+and+phosphatidyl+serine-containing+liposomes%3A+formation+and+patterning+of+supported+phospholipid+bilayers+on+the+surface+of+a+medically+relevant+material%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Interactions between titanium dioxide and phosphatidyl serine-containing liposomes: formation and patterning of supported phospholipid bilayers on the surface of a medically relevant material.</a> Langmuir. 21, 6443-6450 (1021).</li>
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<li>Wallin, M., Choi, J. -H., Kim, S. O., Cho, N. -J., Andersson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-induced+formation+of+a+tethered+lipid+bilayer+membrane+on+mesoporous+silica%5BTitle%5D)+AND+%22European+Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Peptide-induced formation of a tethered lipid bilayer membrane on mesoporous silica.</a> European Biophysics Journal. , 1-10 (2014).</li>
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<li>Tabaei, S. R., Jackman, J. A., Kim, S. -O., Zhdanov, V. P., Cho, N. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Assisted+Lipid+Self-Assembly+at+Hydrophilic+Surfaces%3A+Factors+Influencing+the+Formation+of+Supported+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Solvent-Assisted Lipid Self-Assembly at Hydrophilic Surfaces: Factors Influencing the Formation of Supported Membranes.</a> Langmuir. 31, 3125-3134 (2015).</li>
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</ol>

著者らには、開示すべき競合する金銭的利益はありません。

この作業では、溶媒交換手順は、アルコール中の脂質（イソプロパノール、エタノール、又はn-プロパノール）は、固体支持体と共にインキュベートし、次いでアルコールを直列に駆動するために、水性緩衝液に徐々に置換された提示され相転移の最終的ラメラ相の脂質二重層24を生成します 。この方法は、このような小胞融合法に難治性である金、などの表面上に支持された脂質二分子層の製造を可能にすることが示されています。 最適な脂質濃度範囲（0.1 - 0.5 mg / mlの）は、これまで試験された標準的な実験形式で完全な二層形成のための決定されました。二重層の0.1 mg / mlの、個別の、微小パッチ以下の脂質濃度で形成されました。一方、0.1 mg / mlのより高い濃度およびより低いで0.5 mg / mlの、完全かつ均一な二重層が形成されます。この範囲より上の脂質濃度で、流体二重層は依然としてverifiとして形成しましたFRAP解析により編、しかし、蛍光顕微鏡は、二層の上に追加の脂質構造の存在を明らかにする。驚くべきことに、これらの追加の脂質構造の形態は、QCM-D分析によって決定されるように、インキュベーション工程の間に使用したアルコールに依存しました。エタノールの場合には、比較的高ΔFおよびΔDシフトが吸着小胞の層に対して得られたQCM-Dの署名に似ています。イソプロパノール又はn-プロパノールの代わりに使用した場合ΔDがかなり高かった、Δfは、二重層（-40ヘルツまでの間-30 F最終Δ）が期待値よりもわずかに高かったです。このようなQCM-D応答は、（場合によっては蛍光顕微鏡によって可視など）膜表面から外側に突出する延長脂質構造（例えば、蠕虫状ミセル）のために予想されます。 溶媒交換の速度は、エスペック重要であり得る別の重要なパラメータであります低い脂質濃度（例えば、0.1 mg / mlで）を使用しているときially。低脂質濃度で迅速な溶媒交換は、不完全な二重層の形成につながることができます。本論文では、QCM-D測定（Q-センスE4測定室）、約100マイクロリットル/分の流量のために使用される標準的な測定室では、再現性の高い完全な二重層形成に適していました。他の形状及び容積を有するフローセルの場合、最適な流量が変化してもよく、経験的に、本明細書に推奨される手順に基づいて決定されなければなりません。 小胞の融合に難治性である表面上に支持された脂質二重層を形成することに加えて、SALBにより複雑な組成を有する支持された膜の製造にドアを開け、破裂することができる脂質小胞の必要性を回避するために使用することができます。例示的な実施例の組成物として、コレステロールの高い割合を有する脂質混合物を調べました。コレステロールはmammの重要な構成要素でありますalian細胞膜、およびその画分は、（赤血球中など ）、膜脂質組成の45〜50モル％に近づけることができます。このように、人間の細胞膜を代表する脂質二重層であっても単純なモデルは、コレステロールを含むべきです。 小胞の融合のみ10-15％のコレステロールを含有する流体の脂質二重層を製造するために使用することができるが（QCM-Dの測定によって定量し、最大57モル％）、SALB方法は、コレステロールの高い画分を含む流体の脂質二重層を形成することができる36。コレステロールのレベルはさらに（63モル％まで）上昇したときしかし、ストライプ状の領域37を観察しました。共同既存のドメインは、空気 - 水界面におけるコレステロール/リン脂質単層の相図にβ地域で観察されたものを連想させる液体でした。 全体として、SALB方法は私は特に、サポートされている脂質二重層を形成するためのシンプルかつ効率的なアプローチであることが示されています従来のベシクル融合法の範囲を超えて、n個のケース。これまで、QCM-D法と蛍光顕微鏡検査は、主にSALB法により形成されたサポートされている脂質二重層を特徴付けるために使用されました。 、39,40、フーリエ変換赤外分光法41、X線42と中性子反射率43ができる表面プラズモン共鳴（SPR）38を含む技術は、前方表面感受性分析測定の広い範囲を見ると、原子間力顕微鏡（AFM）さらに特徴付け、単純および複雑な二層構成はSALB方法により調製研究するために使用されます。これらの新興の機能はシンプルで堅牢な実験プロトコルを利用することにより、人工細胞膜を探索することができます科学者のより多くの扉を開きます。

固体サポート脂質二重層1（SLB）は、二層の厚さ、二次元脂質拡散率、および膜関連生体分子をホストする機能として、生体膜の基本的な特性を保持する汎用性の高いプラットフォームです。 、天然の細胞膜の複雑さのために、この単純なプラットフォームは、ラフト形成2、4,5結合タンパク質結合3、ウイルスおよびウイルス様粒子のような膜関連プロセスの in vitro研究のための効率的なプラットフォームとして機能することが示されています、およびセル6シグナリング 。固体支持体に近接して形成され、SLBプラットフォームは、内部全反射顕微鏡（TIRF）、水晶振動子マイクロ散逸（QCM-D）、及びインピーダンス分光法のような表面に敏感な測定技術の範囲と互換性があります。 いくつかの方法は、気泡を含む、のSLBの異なるタイプを生成するために開発されていますサブミクロンサイズの脂質スポットのための崩壊7およびディップペンナノリソグラフィー8、スピンコーティング二重層スタックとラングミュア-ブロジェット（LB）10とフルスパン、単一の脂質二重層コーティングのための小胞融合（VF）11のために9。 VFの方法は、連続的な脂質二重層を形成するために、固体支持体とその後の自発的破裂および融合に小型単層小胞の吸着で構成されています。しかし、生理的条件下で、自発的な小胞の破壊は、主として二酸化ケイ素、ガラス、マイカなどのシリコン系材料に限定されています。また、小胞の破裂は、コレステロールまたは負に帯電した脂質の高い画分を含むもののような複雑な脂質組成物の小胞のために自然に発生しません。システムに応じて、小胞の破裂は、さらに、温度12、溶液pH 13、及び塩分14、浸透圧ショック15の実験条件を調整することによって誘導することができます</s圧力16、または例えばCa 2+などの二価イオンの添加アップ&gt;または17あるいは、膜活性AHペプチドはの範囲に小胞の破裂および二重層の形成につながる、吸着された小胞の膜を不安定化するために導入することができます表面18-22。 また、成功した二層の形成は、時間がかかり、特定の膜組成物を達成するの​​は困難であることができる、小さな単層小胞のよく制御集団の調製を必要とします。したがって、最適なケースでは、その高い効率にもかかわらず（例えば、小胞23の大規模な凍結融解の前処理後）、小胞の融合の一般的なアプリケーションは、適切な基板と膜の組成物の範囲によって制限されます。 溶剤補助脂質二重層（SALB）メソッド24-28脂質小胞を必要としない代替製造技術です。この方法は、堆積Oに基づいていますSLBの形成を誘発するために、水性緩衝溶液と、この溶媒の段階的な交換に続いて水混和性有機溶媒の存在下で固体表面へのF脂質分子。溶媒交換工程中に、脂質、有機溶媒、及び水の三成分混合物は、固体基板上にバルク溶液とSLBにおけるラメラ相構造の形成をもたらす増大水画分と直列の相転移を受けます。重要なことは、この自己組織化ルートは通常のSLBに吸着された小胞の形質転換のための律速段階である小胞の破裂、の必要性を回避します。プロトコルは、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、クロム、インジウムスズ酸化物、金を含む多種多様な表面に適用可能です。本稿でおよび添付のビデオで、SALBとベシクル融合法による脂質沈着の比較が示されています。特に、実験パラメータの影響を含む脂質濃度、流速、及びSALB法により形成された二層の品質に水混和性有機溶媒の選択は、説明されています。作製のSLBの分析的特徴付けは、（FRAP）技術を光退色後QCM-D、蛍光顕微鏡、蛍光回復することによって行われます。 QCM-Dの監視はケラーとKasemo 29によって行わ先駆的研究以来、広く定量的二重層の形成を研究するために使用されている、表面に敏感な質量測定法です。蛍光顕微鏡は、膜の均一性の検査だけでなく、膜ドメインの可視化を可能にします。 FRAP技術は、流体膜の本質的な特性であるSLB、中の脂質分子の横方向の移動性を決定するための標準的なツールです。 この研究の最初の部分は、二酸化ケイ素と金に二重層形成を試みるように適用SALBとベシクル融合法のQCM-Dの分析を含みます。第二部では、SALB方法でコレステロール濃度の範囲を含むサポートされている膜の調製および特性が示されており、その結果は、小胞融合法によって得られたものと比較します。

<table><tbody><tr><td>QCM-D 二酸化ケイ素コーティング基板</td><td>QSense AB,&nbsp;</td><td></td><td></td>スウェーデン</tr><tr><td>QCM-D金メッキ基板</td><td>QSense AB,&nbsp;</td><td></td><td></td>スウェーデン</tr><tr><td>Q-Sense E4モジュール</td><td>QSense AB,&nbsp;</td><td></td><td></td>スウェーデン</tr><tr><td>プラズマクリーナー、PDC-32G</td><td>ハリックプラズマ、イサカ、ニューヨーク</td><td>PDC-001(115V)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>850375P</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミンローダミンBスルホニル)(アンモニウム塩) (Rh-PE)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>810150P</td><td></td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>700000P</td><td></td></tr><tr><td>メチル-&β;-シクロデキストリン</td><td>シグマ&nbsp;</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>673773</tr><tr><td>エタノール</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>459844</tr><tr><td>n-プロパノール</td><td>シグマ&nbsp;</td><td></td><td></td>279544</tr><tr><td>スティッキースライド I 0.1 ルアー</td><td>IBIDI</td><td>81128</td><td></td></tr><tr><td>エルボ 1/8インチ</td><td>コールパー</td><td>マー30505-70</td><td></td></tr><tr><td>シリコンチューブ1.6&#160;mm ID</td><td>IBIDI</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Reglo Digital M2-2/12 蠕動ポンプ</td><td>Ismatec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>71725</td><td></td></tr></tbody></table>

溶剤アシスト脂質二重（salb）法による生体膜の作製

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

細胞膜を模倣するためには、サポートされている脂質二重層（SLB）は、固体基材に生体適合性および生物機能性を付与しながら、膜関連プロセスの in vitroでの調査に有効に魅力的なプラットフォームです。リン脂質小胞の自発的な吸着と破裂はのSLBを形成するための最も一般的に使用される方法です。しかし、生理的条件下で、小胞融合（VF）は、脂質組成物および固体支持体のサブセットのみに限定されます。ここでは、小胞を必要としないのSLBを形成するために、溶剤支援脂質二重層（SALB）の形成法と呼ばれるワンステップの一般的な手順を説明します。 SALB方法は、水混和性有機溶媒 （例えば、イソプロパノール）とSLBの形成を誘発するために、水性緩衝液とのその後の溶媒交換の存在下で固体表面上に脂質分子の堆積を伴います。連続溶媒交換ステップはのアプリケーションを可能にします表面感受性バイオセンサーの広い範囲を使用して、二重層の形成とその後の変化を監視するのに適したフロースルー構成の方法。 SALB方法は、小胞融合に難治性であるものを含む疎水性固​​体表面の広い範囲でのSLBを製造するために使用することができます。また、ベシクル融合法を用いて調製することができない脂質組成物からなるのSLBの製造を可能にします。ここで、我々は2つ​​の例示的な親水性表面、二酸化ケイ素と金のSALBと従来のベシクル融合法を用いて得られた結果を比較します。 SALB方法により調製高品​​質の二重層を調製するための実験条件を最適化するために、成膜工程における有機溶媒の種類などの様々なパラメータの効果は、溶媒交換の速度、および脂質濃度は、トラブルシューティングのヒントと一緒に説明されています。コレステロールの高い画分を含む支持された膜の形成も悪魔です膜構成の広い範囲のためのSALB技術の技術的能力を強調し、SALB方法でtrated。

私たちは、脂質小胞を使用せずに、固体基板上にサポートされている脂質二重層を形成するための実験プロトコルを提示します。我々は、様々な生物学的用途のためのコレステロールに富むドメインと脂質二酸化ケイ素と金の二重層と同様に支持された膜を形成するために、一段階法を示しています。

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

本手順の全体的な目的は、溶媒補助脂質二重層法を用いて支持膜を作製することです。この手法は、脂質や膜タンパク質の基本的性質の解明など、膜生物学分野における重要な課題への回答に寄与し、創薬や分子診断などの応用を可能にします。この技術の主な利点は、従来の手法では不可能であった、多くのケースにおいて支持脂質を層ごとに作製できる点にあります。この手順は扱いやすく、サンプルの前処理も最小限で済みます。この技術は、膜タンパク質などの重要な薬剤標的の解析を可能にするため、治療や診断への応用が期待されます。また、本手法は材料科学への応用のためのバイオコンパチブルな基材の作製にも利用可能です。本手法の着想は、従来の膜作製法の困難さについて議論した際に得られました。本手順を実証することで、当研究室の大学院生にとって有用で簡便な手法を提供することを目指しています。まず、DOPC脂質パウダーをイソプロパノール溶液に溶解し、10 mg/mLの脂質ストック溶液を調製します。次に、ローダミン標識DOPE脂質パウダーをイソプロパノール溶液に溶解し、1 mg/mLの脂質ストック溶液を調製します。イソプロパノール中でストック溶液を希釈・混合し、蛍光観察、顕微鏡観察、および光退色後蛍光回復（FRAP）実験に必要な最終濃度の脂質混合液を調製します。この際、脂質混合液に0.5重量%のRドメイン標識DOPEを含める必要があります。このイソプロパノール製脂質混合液を、マイクロ流体チャネルが満たされるまで注入します。その後、ガラス表面上で脂質混合液を約10分間インキュベートします。塩交換は非常に低い流速で行う必要があります。そうしないと、二層膜の品質が低下します。ペリスタティックポンプを用いて、非常に低い流速で脂質溶液を水または緩衝液で徐々に置換してください。その後、コレステロール濃縮支持膜を形成させるため、過剰量の緩衝液でチャネル内を十分に洗浄し、残留しているイソプロパノールを除去します。DOPC、脂質コレステロール、およびrho domine（ラベル化DOPE脂質）を含むストック溶液を調製するため、まずそれぞれの粉末をイソプロパノールに溶解し、次に膜流動性アッセイを行うために前述と同様のプロトコルを繰り返します。まず、ガラススライドを1%硫酸ナトリウムESAL溶液に10分間浸します。その後、スライドを脱イオン水で十分に洗浄し、エタノールでリンスします。窒素気流を緩やかに当ててスライドを乾燥させます。次に、酸素プラズマチャンバー内で、最高無線周波数出力で30秒間、スライドを酸素プラズマにさらします。続いて、ピンセットを用いて底面のない市販のマイクロ流体チャンバーの保護フィルムを剥がし、ガラススライドをチャンバーの粘着面に貼り付けます。コネクターとチューブをチャンバーの入口および出口の位置に取り付け、マイクロ流路を顕微鏡ステージ上に配置します。前回と同様に、0.5重量%のrhoドミネおよび標識DOPE脂質を含む、目的の脂質組成を用いてマイクロ流路内に蛍光標識支持脂質二重層を形成します。次に、60倍油浸対物レンズを用いて二重層平面を特定します。画像をキャプチャするために、まず光退色前に2枚のプレブリーチ画像を取得します。レーザーの強度が安定するまでウォーミングアップを行います。次に、532 nm、100 mWのレーザービームを用いて、直径30 µmの円形スポットをフォトブリーチングします。フォトブリーチング直後にコレステロール定量を行うため、漂白箇所の回復と蛍光強度を追跡し、2分間、1秒ごとに一連の画像をキャプチャします。まず、酸素プラズマチャンバー内にて、最大高周波出力で30秒間、二酸化ケイ素コーティングされた水晶振動子センサーチップを酸素プラズマにさらします。チップをチャンバーから取り出し、直ちに測定チャンバーに取り付けます。本実験では、Q Sense E4A 4チャンネル水晶振動子マイクロバランスを使用しています。適切な取り付けを確認するため、検体と空気の周波数および散逸を測定します。そのためには、qofソフトウェアプログラムを実行します。「Acquisition」をクリックし、新しく表示されたウィンドウで「Setup Measurement」を選択して、3、5、7、9、11、および13の倍音にチェックを入れます。次に [find and run] をクリックします。共鳴スペクトルを確認するため、温度を 24 °C に設定してください。適切に装着されたことが確認できたら、ペリスタルティックポンプを始動させ、ソフトウェアプログラム上でバッファー溶液を 100 µL/min の流速で測定チャンバー内に流します。[acquisition] をクリックし、[restart measurement] を選択して、共鳴周波数とエネルギー散逸信号を記録します。安定したベースラインが得られるまでこの手順を繰り返します。周波数シフトおよび散逸シフトを確認します。脂質を含まないイソプロパノールを10分間注入します。続いて、DOPC脂質とコレステロールを任意のモル比で混合し、イソプロパノール中で総脂質濃度 0.5 mg/mL とした溶液を10分間注入します。次に、バッファーを 100 µL/min の流速で20分間注入します。その後、バッファーで調製した 1 mM メチルβシクロデキストリン溶液を、周波数信号が安定した値に達するまで注入します。メチルβ-シクロデキストリン処理ステップによって引き起こされる相対的な正の周波数シフトを測定し、テキストプロトコルに従ってコレステロールとDOPC脂質の質量を算出します。次に、DOPC脂質とコレステロールの分子量を考慮して、支持脂質二層膜におけるコレステロールのモル分率を算出します。ここでは、SAL法を用いてガラス表面上に形成された、0.5重量%のルミニン標識DOPE脂質を含むDOPC脂質二層膜の代表的な蛍光顕微鏡像を示します。光退色後蛍光回復実験では、ほぼ完全な蛍光回復が認められ、脂質二重層の側方流動性が示されました。ここでは、支持二重層形成における周波数シフトおよび散逸シフトの代表的なQCMD曲線を示します。SAL法を用いることで、最終的な共鳴周波数シフトと散逸シフトが得られ、これは平面状の二重層が形成されたことに対応しています。適切に実施すれば、この手法は30分で完了させることができます。このビデオを視聴することで、溶媒補助脂質二重層法を用いて支持バイオ膜を作製する方法について十分に理解できるはずです。この手順を行う際は、実験前に新鮮な脂質溶液を調製すること、および実験系に合わせて溶媒交換速度を最適化することが重要です。本手順に従った後、膜ドメインの形成などの追加の問いに答えるために、原子間力顕微鏡などの他の手法を併用することができます。

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Research

JoVE Journal

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