Name: マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: 学ぶマウス腸間膜静脈での生体顕微鏡法を用いた炎症時の白血球・内皮細胞および血小板・白血球相互作用の可視化手法。この方法により、炎症過程における細胞動態をリアルタイムで観察し、免疫応答メカニズムの解明に貢献します。

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この作業は、ドイツ研究振興協会(DU 1190/3-1)の支援を受けました。

全ての動物実験は、ドイツ動物保護法（TierSchG）に準拠して行きました。 FELASA（www.felasa.eu/guidelines.php）と全国動物福祉本体GV-SOLAS条約（www.gv-solas.de/index.html）で定義されているようにマウスが収容され、良好な動物の慣行に従って取り扱われました。フライブルク大学の動物福祉委員会だけでなく、自治体（Regierungspräsidiumフライブルク）は、すべての動物実験を承認しました。 1.動物の取り扱い、準備および炎症の誘導<ol><li> 16〜20グラムの重量範囲で6週齢の雄マウス - 4を使用してください。注：マウスは古いまたは重い場合、それらは顕微鏡観察を制限する、血管の周囲の過剰な脂肪を提示します。 </li><li>手術前にすべてのツールと​​顕微鏡テーブルを滅菌します。 </li><li>注入の20mg / kgのLPS（リポポリサッカライド）を腹腔内4細菌inflammを誘導するために生きているマウスに、顕微鏡の前に時間エーション。 </li><li>プラスチック容器および腸間膜組織を加湿するために37℃の水浴中で0.9％食塩水を予熱します。 </li><li>右の顕微鏡の手順の前に腹腔内ケタミンの注射（100mg / kg）およびキシラジン（5mg / kg）でマウスを麻酔。別の麻酔は、 例えば、2％イソフルラン吸入を用いることができます。反射刺激（しっかり圧でつま先やテールピンチ）に対する応答の喪失によって、適切な麻酔を確認してください。 </li><li>シェーバーを使用して腹部を脱毛するとエタノール70％で飽和したガーゼで抜け毛を取り除きます。 </li><li>麻酔下にある間、乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を適用します。 </li></ol> 2.手術<ol><li> 70％エタノールを用いて腹部を滅菌します。この方法は、滅菌方法ではなく、実験の終了時に致死的である可能性があります。 </li><li>正中開腹術を実行します。小さな、湾曲鉗子と小さなハサミを使用して腹部の皮膚を開きます。エピを特定gastrical血管や血管を保護するために、白線の領域で腹膜を開きます。 </li><li>湿った組織を維持するために腹腔内に予め加温した生理食塩水を数滴を適用します。 </li><li> 9,10前に説明したように眼窩50μlのローダミン6G（1mg / ml）を注入することにより、蛍光ラベルの白血球と血小板。 </li><li>直径10cmのペトリ皿にileumandの場所それのループを体外に出すし、37℃を適用することにより、湿った組織を維持することを確認してくださいは、生理食塩水（0.9％）、他のすべての分を予め加温しました。 </li></ol> 3.生体顕微鏡<ol><li>顕微鏡の下にマウスを置き、200の直径を有する腸間膜静脈を持って - ビューの中央には300μm。目に見える脂肪周囲と容器を選択してください。 </li><li>それによって内皮の刺激を避ける腸間膜血管を触れないでください。慎重回腸ループを処理します。 </li><li>血液細胞 - 内皮相互作用を可視化倒立または正立顕微鏡、顕微鏡ソフトウェアを使用して、カメラで。マウスあたり4つの異なる静脈の1分間の録音血液細胞 - 内皮相互作用。 </li><li>イメージング実験の完了後に頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 </li></ol> 4.分析<ol><li>分析をオフラインで実行し、すべてのパラメータに対して盲目に。任意の適切なソフトウェアプログラムを用いて分析を行います。 </li><li>管腔内の血液細胞の流れに焦点を当て、高時間分解能のシネクリップで安定しており、interindividually同等の血流状態（最大フレームレート）を確認してください。 </li><li>ローリング白血球数を定量化します。そのための静脈を介して垂直線を描画し、1分でこのラインを交差するすべての白血球をカウントします。 </li><li>一つの白血球を安定して内皮上を転動しながら、50μmの距離を通過するのに必要な時間を測定することにより、圧延速度を決定。これを行うには、50ミクロンtの距離で2つの垂直線を描きます静脈hrough。 <ol><li>代表的な白血球が必要な時間（マイクロメートル/秒）を介して、50ミクロンを分割しother.Calculate行への白血球の速度を得るために必要な時間を測定します。 </li></ol></li><li> 0.04ミリメートル2のフィールドに白血球の接着を測定します。これを行うには、静脈に200μmの辺の長さの正方形を描画します。 <ol><li>この正方形の中に、30秒間、目に見える動きとして定義されてしっかりと付着性白血球を、数えます。 </li></ol></li><li>血小板 - 白血球の相互作用を定量化するために、1つの白血球に結合した血小板の数を数えます。 </li></ol>

<ol><li>Lehr, H. A., Vollmar, B., Vajkoczy, P., Menger, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+fluorescence+microscopy+for+the+study+of+leukocyte+interaction+with+platelets+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Intravital fluorescence microscopy for the study of leukocyte interaction with platelets and endothelial cells.</a> Methods in enzymology. 300, 462-481 (1999).</li>
<li>Atherton, A., Born, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+investigations+of+the+adhesiveness+of+circulating+polymorphonuclear+leucocytes+to+blood+vessel+walls%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative investigations of the adhesiveness of circulating polymorphonuclear leucocytes to blood vessel walls.</a> The Journal of physiology. 222, 447-474 (1972).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+stimulates+platelet+receptor+shedding+by+tumor+necrosis+factor-alpha-converting+enzyme+%28ADAM17%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Serotonin stimulates platelet receptor shedding by tumor necrosis factor-alpha-converting enzyme (ADAM17).</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 7, 1163-1171 (2009).</li>
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<li>Baez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+cremaster+muscle+preparation+for+the+study+of+blood+vessels+by+in+vivo+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+research%22%5BJournal%5D)">An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy.</a> Microvascular research. 5, 384-394 (1973).</li>
<li>Leister, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+peritoneal+cavity+chamber+for+intravital+microscopy+of+the+liver+under+conditions+of+pneumoperitoneum%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+endoscopy%22%5BJournal%5D)">A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum.</a> Surgical endoscopy. 17, 939-942 (2003).</li>
<li>Duerschmied, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+serotonin+promotes+the+recruitment+of+neutrophils+to+sites+of+acute+inflammation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelet serotonin promotes the recruitment of neutrophils to sites of acute inflammation in mice.</a> Blood. 121, 1008-1015 (2013).</li>
<li>Herr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+fluoxetine+treatment+induces+slow+rolling+of+leukocytes+on+endothelium+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Acute fluoxetine treatment induces slow rolling of leukocytes on endothelium in mice.</a> PloS one. 9, e88316(2014).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retro-orbital+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab animal. 40, 155-160 (2011).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+animal%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab animal. 37, 26-32 (2008).</li>
<li>Duerschmied, D., Bode, C., Ahrens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+functions+of+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Immune functions of platelets.</a> Thrombosis and haemostasis. 112, 678-691 (2014).</li>
<li>Wagner, D. D., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vessel+wall+and+its+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The vessel wall and its interactions.</a> Blood. 111, 5271-5281 (2008).</li>
<li>Gawaz, M., Fateh-Moghadam, S., Pilz, G., Gurland, H. J., Werdan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+activation+and+interaction+with+leucocytes+in+patients+with+sepsis+or+multiple+organ+failure%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet activation and interaction with leucocytes in patients with sepsis or multiple organ failure.</a> European journal of clinical investigation. 25, 843-851 (1995).</li>
<li>Sarma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+platelet+binding+to+circulating+monocytes+in+acute+coronary+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Increased platelet binding to circulating monocytes in acute coronary syndromes.</a> Circulation. 105, 2166-2171 (2002).</li>
<li>Sumagin, R., Sarelius, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+activation+of+arterioles+and+venules+alters+distribution+and+levels+of+ICAM-1+and+affects+leukocyte-endothelial+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Heart+and+circulatory+physiology%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha activation of arterioles and venules alters distribution and levels of ICAM-1 and affects leukocyte-endothelial cell interactions.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 291, H2116-H2125 (2006).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本明細書中で、我々は、in vivoでのマウスの腸間膜静脈の生体顕微鏡の製造及び性能を記載します。この方法は、私たちに生体内で直接白血球-内皮細胞および血小板-内皮相互作用11を観察する機会を与えてくれます。 内皮を炎症に対する初期応答として活性化されますと、ローリング、接着および遊出12で得られた白血球と血小板と相互作用します。しかし、白血球はまた、血小板が、いわゆるフォーミングと相互作用、血小板、白血球複合体、主に血小板、好中球の複合体（PNCs）および血小板-単球の複合体（PMCの）13,14。これらの相互作用が観察され、この方法で定量することができます。 さらに、この技術は、（血小板/白血球の相互作用の後に、例えば ）VCAM-1またはICAM-1 15のようなマーカーを用いて内皮の活性化を調査することができます。 手順自体の物理的な刺激は、...

このプロトコルの目的は、炎症状態の下で白血球 - 内皮細胞および白血球、血小板の相互作用を直接観察するために生きているマウスにおける腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査の簡略化された手法を記述することです。 生体顕微鏡は、炎症性白血球動員および機能を理解するために些細なしかし重要ではありません炎症状態1,2、下のin vivoでの白血球-内皮相互作用を研究するために開発されました。私たちはこのプロトコルで説明した方法は、以前に公開された刊行物に基づいて開発されました。公開されたものに成長して血栓3に並行して、血小板の取り込みを可視化と同様に、以前の4、体外に腸間膜静脈を透過光顕微鏡で観察されます。例えばラット5やマウスの肝臓およびラット6の精巣挙筋としてイントラ不可欠な顕微鏡の他の様々なモデルがあります。腸間膜静脈の生体内顕微鏡法が開発され、いくつかのグループによって以前の研究に適用されています。非神経セロトニンの欠損しているマウス、およびその血小板セロトニン薬理学的に長期的により枯渇したマウスとの調査結果を比較して - / - 我々は、野生型マウスとトリプトファンhydroxylase1（TPH1）との間の白血球動員の違いを観察するためにこの技術を使用していますアプリケーション選択的セロトニン再取り込み阻害剤フルオキセチン7。また、急性フルオキセチン処置8後に白血球-内皮相互作用を検討しました。 このプロトコルでは、このモデルは迅速に行うことができるので、腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査に焦点を当てて、白血球 - 内皮細胞および血小板 - 白血球の相互作用の有効な測定を可能にします。これは、はるかに困難な、時間のかかる、骨、肝臓、皮膚、または精巣挙筋のような他の臓器の生体内顕微鏡検査です。モードここで説明するlは、このようなリポ多糖の腹腔内注射のような炎症性刺激、とそれをchallengeing後の炎症性細胞間相互作用の再現性の評価に最適です。

<table><tbody><tr><td>ローダミン 6G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp;989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌由来のリポ多糖類 055:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2637&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

生体顕微鏡は、生きている動物における異なる領域と血管内の異なるプロセスを研究するために使用することができる方法です。このプロトコルでは、我々は腸間膜静脈の生体顕微鏡を説明します。これは、再現性のある結果がインビボで白血球-内皮相互作用を示すと共に、短時間で行うことができます。我々は、内皮細胞のLPSチャレンジ後の炎症の設定について説明します。しかし、このモデルでは1は、細菌の化学的または生物学的のように、炎症性状態の多くの異なる種類を適用し、薬剤の投与と生きている動物に対するその直接効果と白血球動員への影響を調査することができます。このプロトコルは、異なるマウスの処置および血管における炎症反応に及ぼす影響の数に正常に適用されました。ここで、我々は、蛍光ローダミン6Gでこれらを標識することにより、白血球と血小板の可視化について説明します。さらに、特定のイメージングは​​、PEとすることができます対象となる蛍光標識された分子を用いてrformed。

このプロトコールに記載された実験設定の概要を図1に示されている。これは、生体顕微鏡で観察することができる、体外回腸ループと血管を有するマウスを示す。 図2に起因して、未処理の動物における活性化の特定の程度を示します手順自体。しかし、ほとんどない低速圧延またはLPS処置マウスと比較して、白血球の強固な接着性がある。また、野生型マウスのいずれかの飲料水または未処理のマウスに3週間のフルオキセチンで処置した。 図2A-における生体顕微鏡の異なる結果を示した図2図2F-Hのマウスは、ほかに、LPSで処理しながらCは 、LPSによる任意のさらなる炎症挑戦せずに結果を示します。圧延速度がLPSチャレンジ後に減少している間ここでは、ローリング、付着白血球の高い数字を見ることができます。これらの実験では、我々は、血小板セロトニンがCであることを示すことができました炎症7の白血球動員の最初のステップのためにrucial。 <p class="jove_con...

この簡略化されたマウスの腸間膜静脈の生体内顕微鏡検査は、白血球-内皮および血小板-白血球の相互作用を観察するためのさまざまな炎症モデルで使用できます。

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

本手順の目的は、生体内（in vivo）の炎症時における白血球、内皮細胞、および血小板の相互作用を調査することです。まずマウスに目的物質を前処理し、血球を標識します。次に、回腸ループおよびそれに付随する腸間膜血管を体外に露出させ、選択した腸間膜静脈内で起こる細胞間相互作用をバイタル顕微鏡を用いてイメージングします。最終的に、白血球および血小板と、内皮細胞または互いの間での相互作用を解析することが可能です。この手法は、炎症分野における重要な疑問、例えば、さまざまな炎症モデル中や関心のある異なる前処理後に、生体内でどのような白血球-内皮細胞間または血小板-白血球間の相互作用が起こるかといった問いに答えるのに役立ちます。生体内イメージングの4時間前に、16〜20 g、4〜6週齢の雄マウスに20 mg/kgのLPSを腹腔内（IP）投与し、擬似的な細菌性炎症反応を誘導します。同時に、プラスチックチャンバーと腸間膜組織を加湿するため、0.9%生理食塩水を37 °Cのウォーターバスで予熱しておきます。次に、LPS処理したマウスの足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認し、適切な麻酔深度であることを確かめます。その後、動物の体表に軟膏を塗布し、シェーバーで腹部を脱毛し、70% ethanolを浸したガーゼで残った毛を取り除きます。次に、小型の曲型鉗子と鋏を用いて腹部を切開し、心上腹壁動脈を同定し、血管を保護しながら白線領域の腹膜を開きます。組織を湿潤に保つため、あらかじめ温めておいた生理食塩水を腹腔内に数滴滴下し、続いて循環血球を標識するために50 µLのRhodamine 6Gを眼窩後静脈から注射します。次に、マウスを10 cmのペトリ皿に入れ、回腸の一部を体外に露出させ、組織を湿潤に保つため、1分おきに予熱した生理食塩水を投与します。生体顕微鏡を用いて炎症反応を可視化するため、マウスを顕微鏡の下に配置し、直径200〜300 µmで周囲の脂肪が可能な限り少ない腸間膜静脈を視野に入れます。この際、適切な顕微鏡ソフトウェアを使用してください。マウス1匹につき4つの異なる静脈において、血球と血管内皮の相互作用を1分間記録します。次に、細胞間の応答を分析し、個々の血流条件が安定していることを確認します。ローリング白血球の数を定量化するには、静脈に垂直線を引き、1分間にその線を通過するすべての白血球を手動でカウントします。ローリング速度を決定するには、血管内に50 µm間隔で2本の垂直線を引いた後、単一の白血球が内皮上で安定してローリングしながらこれらの線の間を通過するのにかかる時間を測定します。白血球の接着を測定するには、血管内に200 µm四方の正方形を描きます。その後、正方形内で30秒間目に見える動きがない、強固に接着した白血球を手動でカウントします。最後に、血小板と白血球の相互作用を定量化するため、1つの白血球に結合している血小板の数を手動でカウントします。処置自体の影響により、未処理の動物でもある程度の活性化が見られますが、未処理の白血球においてスローローリングや強固な接着はほとんど認められません。実際、LPS投与マウスでは、循環血液細胞のローリング速度の低下とともに、ローリングおよび接着白血球数の増加が観察されます。この実験では、フルオキセチンの急性腹腔内投与直後に、追加のLPS刺激を行わずに生体内顕微鏡観察を実施しました。フルオキセチン投与群では、強固に付着した白血球数が増加し、ローリング速度が低下しており、急性のフルオキセチン投与が白血球と内皮細胞の相互作用に影響を与えることが示されています。さらに、LPS誘発性腹膜炎における腸間膜静脈での血小板・白血球相互作用を示すこの代表的な画像に見られるように、白血球の周囲に血小板が集積していること、およびこれらの複合体と血管壁との相互作用が観察されます。このビデオを視聴することで、白血球と血管内皮細胞および白血球と血小板の相互作用を調べるための intravital microscopy の実施方法について十分に理解することができます。

intravital-microscopy-leukocyte-endothelial-platelet-leukocyte

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マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

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