マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

この手順の全体的な目標は、in vivo での炎症中の白血球、内皮細胞、血小板白血球の相互作用を調査することです。これは、まず前処理を行い、マウスに目的の物質を投与し、血液細胞に回腸ループを標識し、次に付随する間膜血管を外部化し、選択した間膜静脈内で起こるSTO細胞相互作用を生体内顕微鏡で画像化することによって達成されます。最終的には、白血球と血小板と内皮または血小板との間の相互作用を分析できます。

この方法は、炎症の異なるモデル中または関心のあるさまざまな前処理後に、どのような種類の白血球内皮または血小板白血球の相互作用がin vivoで発生するかなど、炎症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。イントラバイタルイメージングの4時間前に、1キログラムあたり20ミリグラムのLPS IPを16〜20グラムの4〜6週齢の雄マウスに注入して、模擬細菌性炎症反応を誘発します。このとき、プラスチックチャンバーと中間組織を加湿するために、摂氏37度の水浴で0.9%生理食塩水を予温します。

次に、LPS処理マウスでつま先をつまむ反応がないことから適切な麻酔の深さを確認し、その後、動物サイズに軟膏を塗布し、シェーバーで腹部を覆い、70%エタノールを浸したガーゼで抜け毛を取り除きます。次に、小さな湾曲した鉗子とハサミを使用して腹部を開き、上腹部血管を特定し、線状アルバ領域の腹膜を開いて血管を保護します。腹腔内に予熱生理食塩水を数滴塗布して組織の湿潤を保ち、続いて50マイクロリットルのロッドドミン6Gを眼窩後から注入して循環血液細胞を標識します。

次に、マウスを10センチメートルのシャーレに入れ、イリウムのループを外部に出し、隔分で予熱生理食塩水を投与して、組織を湿らせます。生体内顕微鏡で炎症反応を視覚化するには、マウスを顕微鏡の下に置き、直径200〜300マイクロメートルの腸静脈を視野に入れ、周囲の脂肪ができるだけ見えないようにします。適切な顕微鏡ソフトウェアを使用します。

マウスごとに4つの異なる静脈で1分間、血液細胞内皮の相互作用を記録します。次に、細胞間応答を解析して安定していることを確認し、個々の血流条件を入力します。転がる白血球の数を定量化するには、静脈に垂直線を引き、この線を横切るすべての白血球を1分間に手動でカウントします。

転がり速度を決定するには、50マイクロメートル間隔で静脈を通る2本の垂直線を引き、1つの白血球が内皮上を安定して転がりながら線間を横切るのにかかる時間を測定します。白血球の接着力を測定するには、静脈に200×200マイクロメートルの正方形を描きます。次に、30秒間正方形内で目に見える動きがない、しっかりと付着した白血球を手動で数えます。

最後に、血小板白血球の相互作用を定量化するために、1つの白血球に結合した血小板の数を手動でカウントします。未処理の動物では、手技自体によりある程度の活性化は見られますが、未処理の白血球のゆっくりとした転がりや固い接着はほとんどありません。実際、LPSに挑戦したマウスでは、循環血液細胞の転がり速度が低下すると、転がる白血球と付着する白血球の数が多くなります。

この実験では、フルオキセチンによる急性腹腔内治療の直後に、追加のLPSチャレンジなしで生体内顕微鏡検査が行われました。フルオキセチン処理動物における強固に付着した白血球の数が多く、転がり速度が低いことは、急性フルオキセチン治療が白血球内皮相互作用に及ぼす影響を示していることに注意してください。.さらに、LPS誘発性腹膜炎中の血小板白血球と腸間膜静脈との相互作用のこの代表的な画像で観察されるように、白血球周囲の血小板のチッティング、およびこれらの複合体と血管壁との相互作用が観察できます。

このビデオを見れば、白血球内皮と血小板白血球の相互作用を調査するための内腔顕微鏡検査の方法について十分に理解できるはずです。