微小電極アレイへの3Dエンジニア神経文化のインタフェース：革新的なインビトロ実験モデル

この手順の全体的な目標は、微小電極アレイに結合したin vitro 3次元ニューロンネットワークの新しいモデルを提示することです。これは、まずコンディショニングを行い、MEAの中央部分をポリデリジンとラミニンの混合溶液でコーティングし、次にマイクロビーズを接着タンパク質、ラミニン、ポリリジンでコーティングすることで達成されます。第2のステップは、処理されたマイクロビーズの懸濁液をマルチウェルプレート上に分散させ、そこで自己組織化して均一な層を形成することです。

手順の3番目のステップは、2Dニューロンネットワークを作成するために、2Dニューロンネットワークを作成するために、1平方ミリメートルあたり2000細胞の密度でMEAの活性領域に細胞を播種することです。めっき後6〜8時間で懸濁液がマルチウェルプレートからMEAに移され、マイクロビーズが六角形のコンパクトな構造で自己組織化されます。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して3Dネットワークを視覚化し、MEA上で成長した従来の2Dニューロンネットワークと比較します。

この手法は、in vitro BDI次元細胞培養などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、BDI次元モデルでは、体細胞と成長円錐が平らになり、アンドンとライズが全方向に広がることができないことです。さらに、バースト活動はBDI次元ネットワークの電気生理学的ダイナミクスを支配する一方で、3次元ネットワークでは、ランダムなスペック活動も共存します。この手法のアイデアを思いついたのは、2008年にNature Method誌に掲載されたSophie Pottoの研究論文で、MICROBITSを足場として使用して3次元のneネットワークを構築したのがきっかけでした。

その後、この方法を私に適合させて、最初の3次元in vitro記録を行いました。PDMSエラストマーを調製するには、シャーレ内で硬化剤とポリマーを1対9の体積比で混合します。次に、混合物を振って真空チャンバーに10分間置き、気泡を取り除きます。

PDMS制約を作成するには、PDMS材料を成形器に挿入し、その後、摂氏120度のオーブンに30分間入れます。PDMS 制約は、めっきの前日に、外径が 22.0 mm と 3.0 mm の円柱の形状にし、高さが 650 マイクロメートルである必要があります。実体顕微鏡でマスクをMEAの活性領域に結合し、PDMSマスクを摂氏120度のオーブンで滅菌します。

次に、70%エタノールの円錐形バイアルでガラスマイクロビーズを2時間滅菌し、30分ごとに回転させて後ですべてのマイクロビーズを露出させます。バイアルからエタノール溶液を取り出し、滅菌水でマイクロビーズを2回すすぎます。次に、PDMSマスクで区切られたMEA領域の中央部を、ポリリジンとラミニンの混合溶液24マイクロリットルで0.05マイクログラム/ミリリットルでコンディショニングします。

マイクロビーズに接着タンパク質、ラミネート、ポリリジンを0.05マイクログラム/ミリリットルでコーティングします。その後、それらをインキュベーターに摂氏37度で一晩置くと、安定して長持ちするニューロンネットワークが得られます。その後、処理したマイクロビーズの懸濁液をメンブレンインサート付きのマルチウェルプレートに分散させ、そこでビーズが自己組織化して均一な層を形成します。

次に、メンブレンの各ウェルに0.5ミリリットルの培地を入れます。このステップでニューロンをプレーティングする準備ができるまで、摂氏37度と二酸化炭素5%のインキュベーターに入れます。E 18妊娠した雌ラットを犠牲にした後、ラットの胚を取得し、次に各ラットの胚からカバカンピを取り除きます。

それらを氷のように冷たいハンクスに入れます。カルシウムとマグネシウムを含まないバランスの取れた塩溶液。次に、0.05%のDNAを含む0.125%のトリンハンクス溶液で組織を37°Cで18〜20分間解離します。

その後、ペオールピペットで上清を取り除きます。10%FBSを含む培地を5分間添加して、酵素消化を停止します。次に、FBSで培地を取り出し、成長培地、そのサプリメントである1%L-グルタミン、ゲンタマイシンで10マイクログラム/ミリリットルで一度洗浄します。

その後、メディアを取り外します。500マイクロリットルの成長で再び補充します。中程度。そのサプリメントは、1ミリリットルあたり10マイクログラムの1%L-グルタミンとゲンタマイシンです。

細胞の乳白色の懸濁液が明らかになるまで、細いPEピペットで組織ペレットを機械的に解離します。その後、少量の細胞懸濁液を増殖培地で希釈して、最終容量2.0ミリリットルを得ます。得られた細胞濃度をヘモサイトメーターチャンバーでカウントします。

次に、この濃度を1〜5の比率で希釈して、マイクロリットルあたり600〜700細胞の所望の細胞濃度を得る。PDMS制約で定義されたMEAの活性領域に、1平方ミリメートルあたり2000細胞の密度で細胞を播種し、2Dニューロンネットワークを作成します。次に、MEAデバイスを摂氏37度で5%加湿二酸化炭素雰囲気のインキュベーターに入れます。

3D培養の構築のための準備ステップを完了するために、160マイクロリットルの懸濁液を600〜700細胞/マイクロリットルの細胞濃度でマルチウェルプレートの内側に配置されたマイクロビーズ単層の表面に分配します。次に、マルチウェルプレートを37°Cの5%加湿二酸化炭素雰囲気のインキュベーターに置き、めっき後6〜8時間で、マイクロビーズとニューロンを含む懸濁液の30〜40マイクロリットルをPDMS制約で区切られたMEAの領域に移します。各移し替えの後、マイクロビーズが六角形の構造で自己組織化するまで約30分待ちます。

すべての層が堆積し、PDMS制約で区切られた領域の上部に300マイクロリットルの媒体で自発的に組み立てられると。MEAに結合した3D構造をインキュベーターに37°C、5%二酸化炭素で48時間置く。その後、in vitroで3週間後にそのサプリメントと共に1ミリリットルの成長培地を添加すると、示されているPDMS制約もなく3D構造が安定である。

これは、MEA サーフェスに結合された 1 層のビーズの DIC イメージです。黒い点の位置は、電極の空間レイアウトを表しています。赤色の信号で反射されるMAP 2の免疫蛍光染色は、MEAの電極面に直接結合したマイクロビーズの周囲のニューロンの樹状突起分葉とADAの分布を示しています。

この画像は、成熟した有糸分裂後のニューロンで発現する新しいNに対してニューロンが標識される高度に相互接続されたネットワークを示す、A 3D培養のZackシーケンスの最大投影を示しています。また、gabaの場合、海馬ネットワークの代表的な電気生理学的記録を3D構成で示します。そして、これは海馬ネットワークの代表的な電気生理学的記録を2D構成で示しています。

習得すれば、この手順は7時間で完了します。ただし、この手順には異なる日に実行されたいくつかのステップがあるため、手順全体を実現するための時間見積もりは単なる目安にすぎないことに注意してください。この手順を試みる際には、まずニューロン利尿薬の2D層をmeaの電極にプレートし、次いでマイクロビットおよびニューロンの懸濁液をマルチウェルプレートからmeaに非常に慎重に移すことを覚えておくことが重要である。

この手法は、計算論的神経科学の分野の研究者が、ネットワーク接続が創発的なネットワークダイナミクスをどのように形成できるかを探求する道を開きました。このビデオを見れば、マイクロ電極アレイに結合したin vitroの3次元ニューロンネットワークを構築する方法についてよく理解できるはずです。