Name: 関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 37 s
Description: 学ぶ、3Dバイオミメティックハイドロゲルを用いた関節軟骨細胞の培養と増殖法。ヒト関節軟骨のin vitro生成と細胞成熟評価に応用でき、再生医療や軟骨修復戦略の発展に貢献します。

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著者は、資金提供のためにスタンフォード大学整形外科部門とスタンフォード・コールター翻訳シードグラントに感謝したいと思います。J.H.L.は、全米科学財団大学院フェローシップとDARE博士フェローシップの支援に感謝します。

すべての実験は、スタンフォード大学の人間の被験者のガイドラインに沿って行われ、治験審査委員会のプロトコルを承認しました。 1.関節軟骨細胞の単離<ol><li>人工膝関節全置換術の際に廃棄された組織から軟骨を取得し、以前に説明したように8解剖。 </li><li>視覚滑らかな表面のための軟骨サンプルの内側または外側大腿骨顆を選択して、軟骨下骨に影響を与えることなく、4〜5ミリメ​​ートルの軟骨生検を除去するためにメスを介して軟骨の表面に切り込みを入れます。 </li><li>精製されたコラゲナーゼでO / N処理と組織の酵素解離によって細胞外マトリックスから軟骨細胞を分離します。 37℃での軟骨細胞の増殖培地にコラゲナーゼII（125 U / ml）およびコラゲナーゼIV（160 U / ml）を1：1の比を使用してください。 </li><li>翌日、70を介して分離した細胞を含む消化された組織をフィルタリングミリメートル孔径ナイロンメッシュ。 5分間600×gでDMEM / F12と遠心の20mlで2回洗浄します。 </li><li>プレート10％ウシ胎児血清（FBS）、25 / mlのアスコルビン酸、2mM L-グルタミン、抗菌剤を補充したDMEM / F12中に再懸濁以下、1×10 6細胞 / 60mm培養ディッシュの密度で単離された軟骨細胞（100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25 / mlのファンギゾン）。プレートを37℃で維持し、生体模倣ヒドロゲルでカプセル化の前に、高密度の単層としての一次軟骨細胞培養を維持します。 </li></ol> 2.バイオミメティックハイドロゲルの作製注：この方法は、DPBS中で、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW 5,000グラム/モル）、コンドロイチン硫酸 - メタクリレート（CS-MA）を含有する生体模倣ヒドロゲルの合成を可能にします。光開始剤の添加は、光活性化架橋を可能にします。最終のヒドロゲル組成物は、7％の重さが含まれW / V CS-MAの3％、および重量/体積の光開始剤の0.05％、PEGDAの（w / v）のT /体積。 <ol><li>メタクリレート基でCSポリマーを官能することにより、CS-MAを合成します。 <ol><li> MESの1.952グラムおよび脱イオン水200ml中のNaClの5.84グラム（DIH 2 O）を溶解させて緩衝50mMの2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）の溶液及び0.5 M塩化ナトリウム（食塩）を準備します。緩衝液中のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩を5g溶解します。 </li><li> （：EDC = 1：2 NHSのモル比）を0.532グラム（4.62ミリモル）のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および1.771グラム（9.24ミリモル）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル） - カルボジイミド塩酸塩（EDC）を加えます5分間溶液と、撹拌。 </li><li>溶液を24時間、室温で反応を維持する（2：1：EDC：NHS AEMA = 1のモル比）0.765グラム（4.62ミリモル）の2-アミノエチルメタクリレート（AEMA）を加えます。 </li><li>透析チューブ（12-14 kDaのMWCO）を使用して、4日間脱イオン水（DIH 2 O）に対する透析により混合物を精製します。 </li><li> Pをフィルタリング0.22μmのフィルターを通してurified解決し、デシケーター、真空O / Nでの溶液を含むオープンチューブを配置します。すべてのチューブは、光から保護されていることを確認します。光と湿気から保護-20℃で溶解したポリマーを保管してください。 </li></ol></li></ol> 3.細胞のカプセル化<ol><li> （セルを含んだ3Dハイドロゲルを打ち抜くための）PCRフィルムと円筒形ロッドをオートクレーブUV光の下で組織培養フードで0.2μmのフィルタ処理70％エタノールに浸漬して、カスタムメイドの円筒状のゲル型を滅菌します。 </li><li>漏れを防止するために、気泡や隙間なくオートクレーブPCR膜とゲル型の底部を密封します。無菌の150mmプレートに保管してください。 </li><li>前生体模倣ヒドロゲル中の細胞カプセル化する日は、コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼIV溶液中のO / N処理と高密度軟骨細胞単層を解離します。軟骨細胞の増殖培地に各コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼVI mlの160 U / 125 U / mlで使用37℃。 </li><li> 50 mlチューブに取り、5％重量/容積、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW = 5,000グラム/モル）（w / v）の3％重量/体積コンドロイチン硫酸 - メタクリレート（CS-MA）を追加し、そしてDPBS中のV光開始剤/ wの0.05％。溶液を混合し、それを脇に保つためにボルテックスチューブ。光からチューブを保護します。 </li><li> 50mlのファルコンチューブに解離した細胞を回収し、5分間460×gでカウントし、遠心します。吸引物は、すべてのセルチューブからメディア及び15×10 6細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁するために上記混合ゲル材料を追加します。気泡の形成を回避しながら、徹底的に30回にそれを混ぜます。 </li><li>ピペット72カスタムメイドの円筒状のゲル型に細胞ヒドロゲル懸濁液又は単独のヒドロゲルのμL、5分間3ミリワット/ m 2のUV光（波長365nm）への暴露によりゲル化を誘導します。無細胞内容のいくつかのヒドロゲル溶液を準備します。将来の生化学的および機械的試験のための陰性対照として、これらの構築物を使用してください。 Measu紫外線強度計でUV光の強度を再。強度を調整するには、UV光源とゲル中のヒドロゲル足場の間の距離を変更します。 注：ヒドロゲルは、CSが含まれているため、無細胞の寄与は細胞のGAGのみを表現するために、細胞を含んだヒドロゲルの生化学GAG含有量から差し引かれます。 </li><li>オフイージーピール用のフィルムをカットするメスを使用して、慎重に取り外し。円筒状の棒の助けを借りて、未重合ゲルとゆるい細胞を洗い流し、無菌DPBS 5mlで6ウェルプレートにゲルを押し出します。 </li><li>培養物を各ウェルに軟骨細胞増殖培地1.5 mlを含有する24ウェルプレート中の細胞を含んだハイドロゲル。ウェルに洗浄ヒドロゲルを転送するために使い捨てへらを使用してください。 </li><li>生存性/細胞毒性キットを使ってライブ死んで染色後24時間カプセル化することによって、細胞の生存率を評価します。文化新鮮な軟骨細胞GROへの変更3-6週間のセルを含んだヒドロゲルおよび空のヒドロゲル2日ごとに解析のために回収する前にメディアWTH。 </li></ol> 4. RNA抽出および遺伝子発現解析<ol><li>慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。 </li><li>無菌のへらの助けを借りて、きれいな1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブに各ヒドロゲルを転送し、各チューブにトライ試薬の250μlを添加します。 RNAを単離するために、メーカーの指示に従ってください。 </li><li>各サンプルからのRNAの単離および定量化の使用後は、それを1μgと高容量cDNAを逆転写キットを用いてcDNAに逆転写を行います。 </li><li>定量的PCRのために興味のある遺伝子の発現の検査のためのTaqMan遺伝子発現アレイを使用しています。 GAPDHの内部遺伝子発現レベルを正規化します。 </li><li> PCR条件のために10に続くウラシルDNAグリコシラーゼを用いた以前のアンプリコンを、不活性化するために50℃で2分間のインキュベーションを含みます60; 95℃でのインキュベーションminのTaqポリメラーゼを活性化します。その後、95℃で15秒間からなる40サイクルのPCRを行い、60℃で1分間。 </li></ol> 5.生化学分析<ol><li>各セルヒドロゲルの構築のためのDNAと以下のように硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）の生産を定量化します。 </li><li>慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。空のチューブを計量し、ティッシュペーパーの上にブロッティングした後、内部にヒドロゲルを入れて、ヒドロゲルの重量または湿重量を記録します。 </li><li>酵素消化のために別々の1.5mlのエッペンドルフチュー​​ブ中で-20℃で各ハイドロゲルを凍結し、後で（GAG用）（DNA用）ピコグリーンアッセイおよびジメチルメチレンブルーアッセイを実行するために、消化産物の一部を使用しています。 </li><li>ヒドロゲルの酵素消化のためpapainase溶液を調製します。 <ol><li>まずナトリウムphosphatの7.1グラムを計量することによりPBEバッファを用意Eの二塩基性（ の Na 2 HPO 4）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA-2ナトリウム）を1.6g。 、のdH 2 O 500mlに溶解し、pHを6.5に調整し、0.22 mmのフィルターを介して精製した溶液を濾過します。 </li><li> PBEバッファー20ml中のL-システインの0.035グラムを溶解します。溶液および滅菌パパイン酵素を100μlをフィルタリングします。 </li></ol></li><li>準備ができてアッセイを実施する場合には、-20°Cからチューブを取り、凍結されたヒドロゲルに準備パパイン溶液を300μlを添加します。乳鉢と乳棒を用いてゲルを粉砕し、モータ乳棒でよく混ぜます。 </li><li>追加のパパイン溶液で500μlにボリュームを持参してください。対照ゲルと同じ手順を実行します。 16時間3,9、60℃でインキュベートします。消化されたヒドロゲルを含む溶液は、従って、DNAおよびGAGの定量のために使用することができます。標準以下の製造業者のPRとしてラムダファージDNAとのピコグリーンアッセイを用いてDNA含量を測定otocol。 </li><li> 1,9-ジメチルメチレンブルー（DMMB）標準10としてサメのコンドロイチン硫酸と色素結合アッセイを使用して硫酸化GAG含有量を定量化します。対応湿重量のために、GAGの量を分割することにより、GAGの内容を決定します。 </li></ol> 6.機械的試験<ol><li> 10 Nロードセルを取り付けたインストロン5944試験システムを用いて、一軸圧縮試験を行います。 <ol><li> インビトロ培養の希望日後、細胞ヒドロゲル足場および無細胞制御ハイドロゲルの圧縮試験を行います。 </li><li> RTでPBS浴中で標本を水没し、負荷条件の下で軟骨組織が ​​経験する生理学的な歪みは10〜20％であると報告されているので、15％の最大ひずみ11,12に1％のひずみ/秒の速度で圧縮します13,14。 </li></ol></li><li>三次多項式を用いたひずみ曲線と曲線フィット対ストレスを作成します。 COMPRを決定15％の歪み値でカーブフィット式から能格接線係数。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコールで報告されたように、3Dヒドロゲルは、通常、単層培養物15で遭遇する線維軟骨細胞への細胞脱分化の過程を回避し、培養中の軟骨細胞表現型を維持することができます。また、chondrocytes-ヒドロゲル構築物の長期培養は、年齢や疾患に関連する本質的な細胞機能を維持し、良好な環境を明らかにしました。 3次元生体模倣ヒドロゲルの使用は、いくつかの利点を有します。まず、コンドロイチン硫酸（CS）、関節軟骨に見出される主要なコンポーネントを含めることは、コンドロイチナーゼを分泌することによってヒドロゲルマトリックスを分解し、新たに合成された軟骨細胞外マトリックス5、16を敷設するために細胞を可能にします。また、CSが示されています関節炎の関節における抗炎症特性を有すること。生体模倣ヒドロゲルはまた、軟骨修復における細胞送達のための足場材料として用いることができ、化学的に修飾することができますより良い組織生体材料統合17,18を容易にします 。 PEG-CSのヒドロゲルの使用は、長期的な軟骨細胞の文化や生化学的および機械的特性を評価することができます。ここでは、このプラットフォームは、軟骨工学のための最適な細胞タイプを定義するために、分化した軟骨細胞のさまざまなソースの比較分析のために有用であることができる方法を示しています。興味深いことに、ヒドロゲルにカプセル化された軟骨細胞は、それらの固有の能力に応じて生存したままと増殖します。 図2に示すように、ヒドロゲル組成物は、実際には、健康な若年成人軟骨細胞の増殖を支持する。グリコサミノグリカン（GAGによって評価機能細胞外マトリックスの沈着によって示されるように記述さヒドロゲルの組成及び構造はまた、軟骨組織の形成を促進します）定量。 追加の利点は、軟骨細胞ハイドロゲル構造物であります新たに形成された軟骨組織の機械的特性について評価することができます。一軸圧縮試験は、比較のために無細胞ヒドロゲル上で実行されるべきであることに注意してください。ヒドロゲルは、実際には、CSによる部分の剛性に固有の剛性を有します。負荷条件下で軟骨組織が ​​経験する生理学的な歪みが10~20であることが報告されているので（歪み率1％/ sで）5〜20％の一軸圧縮歪みが軟骨組織11,12の機械的試験に適用することができます％13,14。機械的試験への細胞を含んだし、無細胞ヒドロゲルの両方の応答は、培養エンドポイントで評価しました。私たちは、OA軟骨細胞を含む構築物の低い剛性とは対照的に、成人および若年性の軟骨細胞を含む構築物の同等の剛性を観察し、上記の例では。細胞 - ヒドロゲル構造体の機械的特性は、機能的特性の評価を可能にします細胞成熟性の詳細な分析を与えるに形成された組織。 結論として、軟骨組織を生成するために、別の軟骨細胞集団の可能性を研究するための3次元生体模倣ヒドロゲルの使用は、広く適用することができます。ここで説明したin vitro試験のほかに、細胞を含んだ構成物のin vivoでの移植は生理的な文脈で細胞成熟と再生可能性を研究するために想定することができます。追加の生体模倣因子とヒドロゲルプラットフォームのさらなる修飾はまた、軟骨細胞の増殖および成熟を最適化するように想定することができます。

その限られた自己修復能力により、人間の関節軟骨は頻繁に不可逆的な損傷を受けます。現在、関節軟骨損傷の治療のための効率的な細胞ベースのアプローチの開発に広範な努力が注がれています。これらの細胞ベースの治療の成功は、最適な細胞源の選択とその再生能力の維持に大きく依存しています。軟骨細胞は軟骨修復の一般的な細胞源ですが、供給が限られており、2D単層培養でのin vitro拡大中に脱分化できるため、硝子軟骨の生成が制限されます1。
このプロトコルの目的は、異なる年齢と病状のヒト軟骨細胞のin vitro比較研究のための3次元ハイドロゲルプラットフォームを確立することです。従来の二次元(2D)培養とは異なり、三次元(3D)ハイドロゲルは軟骨細胞の形態と表現型を維持し、軟骨細胞が軟骨組織を産生することを可能にする生理学的に適切な環境を提供します2,3。ハイドロゲルは、軟骨細胞培養のための3D物理的構造を提供するだけでなく、天然軟骨細胞外マトリックス(ECM)の機能を模倣しています。具体的には、コンドロイチン硫酸メタクリレートの包含は、分泌されたパラクリン因子4の潜在的な貯蔵庫を提供し、細胞媒介性分解およびマトリックス代謝回転5を可能にする。アガロースゲルやアルギン酸ゲルなど、多くの3Dハイドロゲル培養システムがさまざまな研究で広く利用されていますが、私たちは軟骨細胞培養にいくつかの明確な利点を持つ生体模倣3D培養システムを使用しています。コンドロイチン硫酸(CS)は関節軟骨に豊富に存在する成分であり、PEG-CSハイドロゲルは軟骨形成表現型を維持し、さらには強化し、細胞媒介性マトリックスの分解と代謝回転を促進することが示されています2,5。さらに、ハイドロゲル足場の機械的特性は、PEGの濃度を変更することによって容易に調節できるため、軟骨細胞または関連細胞型の再生能力をさらに高めるために利用することができる6,7。PEG/CSMAは生体適合性も備えているため、軟骨欠損などに直接臨床応用できる可能性があります。このシステムの限界は、その複雑さと、アガロースのような単純なシステムと比較して細胞生存率に影響を与える可能性のある光重合の使用ですが、軟骨細胞培養の利点は潜在的な限界を上回ります。
3Dハイドロゲル培養は、細胞表現型(遺伝子発現、タンパク質免疫染色)および機能的結果(軟骨マトリックス産生の定量化、機械的試験)の評価のための従来のアッセイに適合します。この好ましい3D環境は、長期3D培養における3つの異なる年齢集団からのヒト軟骨細胞の組織再生能を比較するためにテストされました。
結果は、表現型と機能的アッセイの両方を通じて評価されました。幼若、成体、OA軟骨細胞は、3D生体模倣ハイドロゲル培養で異なる応答を示しました。3週間後および6週間後、軟骨原性遺伝子発現は若年および成人の軟骨細胞でアップレギュレーションされましたが、OA軟骨細胞ではダウンレギュレーションされました。アグリカン、II型コラーゲン、グリコサミノグリカン(GAG)などの軟骨組織成分の沈着は、若年および成体の軟骨細胞で高かったが、OA軟骨細胞では高かった。得られた軟骨構造の圧縮弾性率も同様の傾向を示しました。結論として、幼体軟骨細胞と成体軟骨細胞の両方が、ハイドロゲル中での3D培養で最大6週間まで軟骨形成および軟骨基質の性質を示しました。対照的に、変形性関節症の軟骨細胞は、軟骨の表現型の喪失と、堅牢な軟骨を生成する能力が最小限であることを明らかにしました。

<table><tbody><tr><td>若年性軟骨細胞(Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>ロンザ</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>成体軟骨細胞(Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System)</td><td>ロンザ</td><td>CC-2550</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(エチレングリコールジアクリレート)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-1000-1g</td><td></td></tr><tr><td>2-モルフォリノエタンスルホン酸</td><td>Sigma</td><td>M5287</td><td></td></tr><tr><td>光開始剤</td><td>イルガキュレ&nbsp;</td><td>2959</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>S9888コン</td><td></td></tr><tr><td>ドロイチン硫酸ナトリウム塩&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>C9819</td><td></td></tr><tr><td>N-ヒドロキシスクシンイミド&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>130672</td><td></td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩</td><td>シグマ</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノエチルメタクリレート</td><td>シグマ</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>透析チューブ</td><td>スペクトラムラボラトリーズ&nbsp;</td><td>132700</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2</td><td>ワージントン バイオケミカル&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004177</tr><tr><td>コラゲナーゼ4</td><td>ワージントン生化学&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004189</tr><tr><td>DMEM/F12培地</td><td>HyClone、Thermo Scientific&nbsp;</td><td>SH3002301&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>生死アッセイ</td><td>Life Technologies</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/L3224">L3224</a></td><td></td></tr><tr><td>Tri 試薬</td><td>Life Technologies</td><td>AM9738</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit</td><td>Invitrogen</td><td><a href="https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/P11496">P11496</a></td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>シグマ</td><td>C1276</td><td></td></tr><tr><td>1,9-ジメチルメチレンブルー&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>インスツルメンツ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UVライト機器 - XX-15LW ベンチランプ、365 nm</td><td>UVP</td><td>95-0042-07</td><td></td></tr><tr><td>インストロン5944試験システム&nbsp;</td><td>インストロンコーポレーション</td><td>E5940</td><td></td></tr></tbody></table>

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3dハイドロゲルの足場

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

人間の関節軟骨は損傷を受けやすく、自己修復と再生の可能性が限られています。軟骨組織を操作するための細胞ベースの戦略は、関節軟骨を修復するための有望な解決策を提供します。組織修復に最適な細胞源を選択するためには、組織改変軟骨の生物学的および生体力学的差異を異なる細胞源によって体系的に調べるための適切な培養プラットフォームを開発することが重要です。ここでは、3次元(3D)生体模倣ハイドロゲル培養プラットフォームを適用して、若年、成人、および変形性関節症(OA)軟骨細胞の軟骨再生の可能性を体系的に調べました。3D生体模倣ハイドロゲルは、合成成分のポリ(エチレングリコール)と生理活性成分のコンドロイチン硫酸で構成されており、軟骨細胞のin vitro培養に生理学的に適切な微小環境を提供します。さらに、この足場は、生体内での軟骨修復のための細胞送達に潜在的に使用され得る。スキャフォールドで操作された軟骨組織は、定量的な遺伝子発現、免疫蛍光染色、生化学的アッセイ、および機械的試験を使用して評価できます。これらの結果を利用して、遺伝子発現レベルと、遺伝子発現レベル、および操作された軟骨組織の生化学的および生体力学的特性の両方で、さまざまな年齢の軟骨細胞の異なる再生能力を特徴付けることができました。3D培養モデルは、正常な発生段階または異常な発生段階から、軟骨細胞と前駆細胞の間の分子的および機能的な違いを調査するために適用できます。

PEGおよびCS部分を含有する生理活性ヒドロゲル（ 図1）は、ヒト関節軟骨細胞2,3,5,7の文化と成熟のための理想的なプラットフォームを表します。異なる年齢および疾患状態の軟骨細胞は記載された方法を用いて培養し、それらの表現型、遺伝子発現、生成、軟骨組織の生化学的および機械的特性のために分析することができます。三軟骨細胞サンプル、若年6ヶ月、adult- 34年と74年osteoarthritic-は、3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後に回収しました。遺伝子発現は、正常な軟骨細胞の分析、若年および成人の両方が、軟骨細胞遺伝子COL2A1およびCOL6A1の発現の増加を示しました。 COL6A1（ 図2）の発現を維持し、良好なバイオミメティック環境で培養されているにもかかわらず、軟骨形成表現型の損失を示しながら逆に、病気の軟骨細胞は、COL2A1の劇的な減少を示しました。 CS-PEGヒドロゲルはまた、軟骨細胞、増殖PEGおよびCSの既存のマトリックスを消化し、その細胞周囲および細胞外マトリックスを堆積させる、成熟した軟骨組織の主要な構成要素のための動的な環境として働きます。これらの能力を考えると、 インビトロ培養の3週間後の軟骨細胞の拡大は、ピコグリーン色素とDNAを定量することによって推定することができます。細胞の三つのグループの比較分析は、OA軟骨細胞は、培養の1日目に比べて劇的な減少を示しながら、少年と成人の集団の細胞密度が変化しなかったことを示しています。 DNA含量の損失はまた、長期培養（ 図3）の間の可能な細胞死を示唆している他のOA軟骨細胞のためではなく、観察されました。分泌されたマトリックスは、培養の3週間後に終点段階でDMMB色素結合アッセイにより硫酸化GAG含有量として定量化しました。 GAG含量はrecorとしてヒドロゲルの湿重量によって正規化されますDED酵素消化および無細胞の貢献の前に減算されます。 図4に示すように、軟骨は、3Dヒドロゲルにおける培養の3週間GAGの同様の有意な量の堆積します。 物理的な足場の存在は、一軸圧縮試験の2,3を通じてサンプルの生体力学的特性を評価することができます。無細胞ヒドロゲルは、圧縮弾性率の低下を受けている間、細胞を含んだ構築物は、培養3週間後（ 図4）の後に、圧縮弾性率を維持しました。表現型は、ここで説明する生化学的および生体力学的分析は、エンジニアリング軟骨のための異なった軟骨細胞集団の可能性を評価し、理解するのに有用です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig1.jpg" /> 図3Dの軟骨細胞CUL 1. PEG-CS生体模倣ヒドロゲルチャー。軟骨細胞は、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA）およびコンドロイチン硫酸-メタクリレート（CS-MA）を含む混合物中に再懸濁し、カスタムメイドの円筒ゲルモールド内に鋳造されています。 UV露光した後、ゲルを型から収集され、細胞の生存率がライブ死んで染色後24時間カプセル化することによって評価される固化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig2.jpg" /> 3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養したヒト軟骨細胞における軟骨形成の遺伝子の発現を図2。少年、成人およびOA軟骨細胞による軟骨マーカーCOL2A1とCOL6A1の定量的遺伝子発現3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後。値は、1日目誤差Bでの遺伝子の発現レベルに正規化されていますARSは、平均±SDを表します。 P、両側スチューデントt検定によって決定される* &lt;0.05。 Smeriglio らから変更された。2 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig3.jpg" /> 3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養したヒト軟骨細胞における図3のDNA含有量。3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後、少年、成人およびOA軟骨細胞におけるピコグリーンアッセイによるDNA定量。値は、1日目にDNAレベルに正規化されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig3large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53085/53085fig4.jpg" /> &lt;BR /&gt; 図4のGAG含有量測定と1日目と3次元バイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後のヒト軟骨細胞の一軸圧縮試験を行った。1日目とで培養3週間後の軟骨細胞におけるDMMBアッセイによって（A）のGAG定量3Dバイオミメティックハイドロゲル。値は重量（WW）を濡らすように正規化され、μgの/ gと表現した。1日目と3次元バイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後の無細胞と細胞を含んだヒドロゲルの（B）圧縮弾性率（kPaで）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53085/53085fig4large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a>

軟骨修復は満たされていない医学的課題であり、ヒトの関節軟骨を操作するための細胞ベースのアプローチは有望な解決策です。ここでは、ヒト関節軟骨細胞の拡大と成熟のための理想的なツールとして、3次元(3D)生体模倣ハイドロゲルについて説明します。

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

本手順の総合的な目的は、3Dバイオミメティックハイドロゲル培養を行い、関節軟骨細胞を増殖させてヒト関節軟骨を生成することである。これはまず、人工膝関節全置換術から得られた大腿骨顆部を解剖し、軟骨下骨から軟骨組織を除去し、酵素解離によって細胞外マトリックスから軟骨細胞を単離することで達成される。第2のステップは、バイオミメティックハイドロゲル作製のためのコンドロイチン硫酸メタクリレートポリマーを合成することである。次に、軟骨細胞を3Dバイオミメティックハイドロゲル中に封入し、構築物をin vitroで3〜6週間培養します。最終的に、生化学的試験および機械的試験の両方を用いて、関節軟骨細胞の成長と成熟を示す結果を得ることができます。軟骨細胞の培養に3Dバイオメトリックハイドロゲルプラットフォームを利用する主な利点は、軟骨の天然成分が組み込まれているため、生理学的に適切な微小環境を提供できることです。これにより、軟骨細胞がその生理機能と表現型をより長期間維持できるという利点があります。三次元マトリックスハイドロゲルにバイオアクティブポリマーであるコンドロイチン表面を組み込むことで、軟骨細胞によるマトリックスの分解代謝が可能になります。さらに、ハイドロゲルマトリックスの機械的および生化学的特性を容易に修飾することができます。本手法は、細胞表現型および機能的結果を評価するための従来のアッセイと互換性があります。また、疾患の進行段階に関連する軟骨細胞固有の特性の研究や、生理学的状況における細胞の成熟度および再生能の評価に使用することが可能です。まず、全膝関節置換術の際に通常廃棄される新鮮な軟骨組織を用い、125 units/mLのコラゲナーゼIIと160 units/mLのコラゲナーゼIVを、軟骨成長培地中で等量ずつ混合して解離培地を調製します。滅菌したメスを用いて、大腿骨顆部の平滑な表面から生検検体を採取します。次に、採取した組織を薄いスライス状に削ります。軟骨スライスを、体積比1:3で混合解離培地に加え、ディッシュを37 °Cで一晩静置して、翌日に細胞外マトリックスから軟骨細胞を遊離させます。解離した細胞を含む消化後の組織を、孔径70 micronのナイロンメッシュでろ過します。次に、あらかじめ加温した20 millilitersのD-M-E-M-F 12培地で細胞を2回洗浄し、600 Gで5分間遠心して細胞をペレット化します。続いて、分離した軟骨細胞をヘモサイトメーターで計数します。100万個の細胞を60 mmの培養皿に播種し、サプリメント添加D-M-E-M-F 12培地で満たします。標準的な培養手法に従い、初代軟骨細胞培養物を高密度単層として維持します。1.952 gの2-クロロスルホン酸エチルと5.84 gの塩化ナトリウムを200 mLの脱イオン水に加え、完全に溶解するまで溶液を撹拌することで、コンドロイチン硫酸メタクリレートを合成します。次に、5 gのコンドロイチン硫酸ナトリウムを緩衝液に溶解させます。続いて、0.532 gのN-ヒドロキシコハク酸イミドと1.771 gの1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩を溶液に加え、5分間攪拌します。溶解後、0.765 gの2-アミノエチルメタクリレートを溶液に加え、アルミホイルで遮光した状態で室温で24時間反応させます。12〜14 kDaの分画分子量を持つ透析チューブを用い、脱イオン水に対して4日間透析を行い、最終混合物を精製します。次に、精製した溶液を0.22 µmフィルターでろ過し、-20 °Cで冷凍します。溶液を入れた蓋のないチューブをデシケーターに入れます。アルミホイルで覆って遮光し、一晩真空脱気を行います。溶解させたポリマーは、細胞封入の前日に、光と湿気を遮断するためにパラフィルムとホイルで包み、Falconチューブに入れて-20°Cで保存します。培養した細胞から培地を除去し、細胞を解離培地で覆います。細胞をコラゲナーゼ溶液中で37°Cで一晩インキュベートします。オートクレーブ用PCRフィルムと円筒形ロッドを滅菌し、カスタムメイドの円筒形ゲルモールドを、ティッシュカルチャーフード内のUVライト下で0.2 µmフィルター滅菌した70%エタノールに浸して一晩滅菌します。翌日、モールドをエタノールから取り出し、ティッシュカルチャーフード内で乾燥させます。その後、モールドを滅菌済みの150 mmプレートに配置します。乾燥後、オートクレーブ用PCRフィルムを使用してモールドの底部を密封します。漏れを防ぐため、気泡や隙間が生じないようにしてください。次に、50 mLチューブを用意し、調製したコンドロイチン硫酸メタクリレートを最終濃度3%となるように、ポリエチレングリコールジアクリレートを最終濃度5%となるように、そして光開始剤をDPBS中で重量対容量比5%から最終濃度0.05%となるように、それぞれ加えます。チューブを遮光し、混合液を短時間ボルテックスします。解離した細胞を50 mLのファルコンチューブに回収し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。細胞を460 ×gで5分間遠心してペレット化し、混合ゲル材料を用いて15 million cells/mLの密度で再懸濁します。気泡が形成されないように注意しながら、溶液を30回混合します。次に、細胞入りハイドロゲル懸濁液またはハイドロゲルのみを72 µL、特製の円筒形ゲルモールドにピペットで分注します。ゲルを365 nmのUVライトに3 mW/m²で5分間照射し、ゲル化を誘導します。ゲル化した後、メスでフィルムを切り、慎重に取り除きます。円筒形のロッドを用いてゲルを6ウェルプレートに押し出し、5 mLの滅菌DPBSで洗浄して、未重合のゲルや剥離した細胞を洗い流します。次に、洗浄したハイドロゲルを、各ウェルに1.5 mLのChondrosite増殖培地を含む24ウェルプレートのウェルに移します。ハイドロゲルを37°Cでインキュベートし、2日ごとに培地を交換します。カプセル化から24時間後、標準的な手法を用いて生死染色を行い、細胞生存率を評価します。細胞含有ハイドロゲルおよび空のハイドロゲルを3〜6週間培養した後、回収して解析します。所定の日数のin vitro培養後、サンプルをインキュベーターから取り出し、細胞含有ハイドロゲルスキャフォールドおよび非細胞コントロールハイドロゲルに対して圧縮試験を行います。サンプルを室温で1つずつ、10 Newtonのロードセルを備えた機械的試験システムに接続されたPBSバスに配置します。1秒あたり1%のひずみ速度で、最大ひずみ15%まで圧縮します。機械的試験を分析するために、各サンプルの応力-ひずみ曲線を作成し、曲線フィッティングを行います。3次多項式を用いて、曲線フィッティング方程式からひずみ値15%における圧縮接線弾性率を決定します。3週間の培養後、3Dバイオミメティックハイドロゲルにおける若年および成人の正常軟骨細胞の遺伝子発現解析では、軟骨細胞遺伝子であるcollagen two A oneおよびcollagen six A oneの発現増加が認められました。対照的に、疾患軟骨細胞ではcollagen two A oneが劇的に減少した一方で、collagen six A oneの発現は維持されており、好ましいバイオミメティック環境で培養されたにもかかわらず、軟骨細胞としての表現型が喪失していることが示されました。3週間の培養後、pico green染料を用いたDNA定量によって軟骨細胞の増殖を推定できます。3つの細胞群の比較分析の結果、若年および成人個体群の細胞密度は変化しなかったのに対し、変形性関節症軟骨細胞は培養1日目と比較して劇的に減少したことが示されました。分泌された軟骨細胞マトリックスは、3週間の培養後の硫酸基含有GAG量として定量されました。ここで示されているように、軟骨細胞は3週間の培養期間中にかなりの量のGAGを蓄積しており、これがコントロールと比較して細胞封入ハイドロゲルの機械的特性が向上した要因であると考えられます。この手順を個別の研究に適用するだけでなく、この3Dバイオミメティック・ハイドロゲル培養モデルは、全層軟骨欠損モデルへ容易に展開でき、長期的な関節軟骨再生における機能的および生化学的な成果を特性評価することが可能です。このビデオを視聴することで、膝関節検体からヒト軟骨細胞を単離し、長期的な軟骨培養および軟骨生成のための3次元ハイドロゲルスキャフォールドを作製する方法について十分に理解できたはずです。3D OMEハイドロゲルの活用により、我々や他の研究者は、異なる成熟軟骨細胞集団だけでなく、新規の幹細胞および前駆細胞集団の軟骨形成能を比較することが可能になります。将来的には、これらの技術を拡張してさらなる模倣因子を組み込むことで、軟骨の再生および修復に利用可能な最適なスキャフォールドを構築できる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

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軟骨アガロースゲルの機械的刺激

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模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

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重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

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関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

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