サンドイッチ状の微小環境は、Cell /材料の相互作用を活用します
2015年8月4日
次のプロトコルは、二次元(2D)と三次元(3D)の細胞環境の中間段階として使用されるサンドイッチ状の培養物を組み立てる手順を説明しています。設計されたシステムは、顕微鏡、バイオメカニクス、生化学、細胞生物学アッセイに応用できます。
この手順の全体的な目標は、より生理学的に関連性のある3D環境内で細胞の挙動を研究するために、サンドイッチのような培養物を組み立てることです。これは、最初に腹側と背側の基質を調製し、フィブロネクチンなどのタンパク質でコーティングすることによって達成されます。次に、細胞を標準的な2D培養と同様に座らせます。
次に、背側基質をオーバーレイして、細胞が腹側と背側に刺激されるようにします。最後に、創傷治癒アッセイなどの実験を行うことができます。最終的に、サンドイッチ様培養物は、ライブイメージング、免疫蛍光法、細胞抽出など、標準的な2D培養用にすでに開発されている手順によって分析されます。
さらなる分析のため。この文化的手法が既存の3次元システムよりも優れている点は、トポグラフィー、化学、剛性、腹側と背側の両方のタンパク質含有量など、材料相互作用のさまざまなパラメータを研究でき、高い汎用性を提供できることです。リピン、免疫蛍光、細胞抽出などの一部の3次元システムでは妨げられる可能性のある実験手順が簡単に実行できます ヒュームフード内で作業する溶媒鋳造によりポリ乳酸またはPLLAのフラットフィルムを生成するには、100ミリリットルのクロロホルムに2グラムのPLLAを添加し、室温で約3時間または完全に溶解するまで攪拌します。
ガラスのペトリ皿にステンレス製のワッシャーを置きます。次に、200マイクロリットルのPLLA溶液をワッシャーに加えます。皿を覆うためにいくつかの穴のあるアルミホイルを使用し、PLLAを室温で30分間ゆっくりと蒸発させます。
次に、微量の溶媒を蒸発させるために、サンプルを摂氏120度で5分間加熱します。次に、サンプルを室温で約30分間冷却した後、18.2メガオームセンチメートルの水を使用して皿内のサンプルを覆い、室温で8分間インキュベートします。インキュベーション後、かみそりの刃を使用してワッシャーをペトリ皿から剥がします。
次に、ピンセットを使用してワッシャーの端から欠陥を取り除き、サンプルを自然乾燥させます。PLLAは加水分解貯蔵により分解されるため、真空中のサンプルは実験日まで乾燥します。さらに、ELLA繊維はテキストプロトコルに従って製造でき、無菌培養フードの下の背側基質として使用できます。
カルシウムおよびマグネシウムを含むドコスPBSまたはDPBS中のFI ninを1ミリリットルあたり20マイクログラムをサンプルに加え、タンパク質コーティング後1時間室温でインキュベートします。DPBSを使用してサンプルを2回洗浄し、ガラスカバースリップで次のシード細胞を使用する準備ができるまで、Pカルシウムとマグネシウムを含むDPBSに保存し、摂氏37度で5%二酸化炭素で3時間インキュベートして、細胞が腹側基質に付着できるようにします。次に、サンプルを12ウェルプレートの新しいウェルに移します。
ピンセットを使用して、背側基質を細胞上に慎重に重ねます。次に、1ミリリットルの培地を追加します。ワッシャーの重量により、背側基板が浮くのを防ぎます。
サンプルを5%の二酸化炭素で摂氏37度に戻し、週に2回培地を交換して、サンドイッチのような培養物内の細胞移動を研究します。先に示したように腹側と背側の基質をフィブロネクチンでコーティングした後、ガラスカバー上のシード細胞を高密度で滑り込ませ、サンプルをインキュベートし、細胞が合流するのを待ちます。次に、ピペットチップを使用して細胞単層を引っ掻き、ギャップで区切られた2つの細胞集団を作成します。
腹側に着座した基質を、タイムラプス取得に適しており、背側基質が内部に収まるのに十分な大きさの新しいウェルに入れます。次に、前に示したようにピンセットで、背側基質を細胞に重ね、培地を補充します。サンプルをタイムラプス顕微鏡の下に置き、20分ごとにギャップクロージャーの画像をキャプチャします。
画像Jのmito BOなどのソフトウェアを使用して、サンドイッチのギャップクロージャを分析します。文化のように。硫酸塩は、背側受容体が刺激される時間と背側相互作用の特性に大きく依存します。
例えば、ここで見られるように、ハイドロゲルなどの他の3Dシステムと同様に、背側エレクトロスピニングPLLAファイバーは、フィブロネクチンでコーティングされている場合、細胞のアライメントを指示しますが、BSAのような非接着性タンパク質でコーティングされている場合には、細胞のアライメントを指示しません。さらに、プレーンな背側PLLAを用いたサンドイッチ様培養は、C 2つのC 12細胞を用いた筋形成レベルの増加を引き起こしました。これは背側の生物学的刺激にも依存します。
このビデオで示されているように、異なる背側タンパク質との相互作用により異なる分化率が得られるため、創傷治癒アッセイでサンドイッチのような培養物内を移動する線維芽細胞は、細胞に比べて細長い形態を採用し、移動距離が短くなります。3Dフィブロネクチンおよびコラーゲンゲルと同様の2D基質上で培養します。サンドイッチのような培養は、2D条件と比較して細胞媒介性ECM再編成を増加させます。
このプロセスは、背側の機械的刺激と細胞骨格の安定性に依存しています。BLEsのような収縮性抑制剤の使用がプロセスを妨げたので S 大丈夫ですので、このビデオを見た後、サンドイッチのような培養物を組み立てる方法について明確に理解しているはずです。この手法は、疾患モデル、開発研究、薬物試験への応用を含め、反応医療やがんのための微小環境のような3Dを設計することができます。
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概要
このプロトコルでは、2Dおよび3Dの細胞環境を橋渡しするためのサンドイッチ様培養の構築について概説します。これらのエンジニアリングシステムは、さまざまな生物学的アッセイに適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 生化学
- 顕微鏡法
背景
- サンドイッチ様培養は、細胞挙動の研究においてより生理学的に適切な環境を提供します。
- この培養法により、腹側と背側の両面から細胞に二重刺激を与えることが可能です。
- 標準的な2D培養技術をこれらのシステムに適応させることができます。
- 適用例としては、創傷治癒アッセイやライブイメージングが挙げられます。
研究目的
- 細胞研究にとってより適切な3D環境を構築すること。
- 二重刺激条件下での細胞挙動を分析すること。
- 確立された2D分析手法を3D環境での利用を容易にすること。
使用した手法
- フィブロネクチンなどのタンパク質を用いた基材の調製およびコーティング。
- 標準的な2D培養と同様の細胞播種。
- 細胞を刺激するための背面基材の重ね合わせ。
- 創傷治癒アッセイやライブイメージングなどの解析の実施。
主な結果
- サンドイッチ状培養の構築に成功。
- 細胞挙動に対する二重刺激効果を実証。
- 2D解析手法を3D培養へ適応。
- より複雑な環境における細胞応答に関する知見。
結論
- サンドイッチ様培養は、細胞挙動の研究を促進します。
- これらのシステムは、2D環境と3D環境の隔たりを埋めることができます。
- さまざまな生物学的アッセイへのさらなる応用が期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
サンドイッチ様培養は、両面からの受容体刺激を可能にすることで、過度に簡略化された2Dモデルと複雑な3Dシステムとの間のトランスレーショナルギャップを解消します。この手法は、既存の2D解析ワークフローとの互換性を維持しつつ、生理学的妥当性を向上させます。また、in vivoでの細胞外マトリックス相互作用を模倣した調整可能な微小環境を提供することで、ターゲットバリデーションや表現型スクリーニングにおける初期段階のメカニズム的なリスク低減を支援します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：腹側と背側の受容体を同時に刺激することで治療仮説の検証を可能にし、経路特異的なシグナルの寄与を明確にする。
- 運用的価値：制御された再現性のある形式で、細胞挙動に影響を与える微小環境変数を分離し、機能的ターゲットのリスク低減を支援する。
- 予測的価値：細胞挙動を3Dに近い表現型へと移行させることで、in vivoの反応との整合性を高め、ターゲット結合への信頼性を向上させる。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値：腹側と背側の両表面において材料特性（トポグラフィー、剛性、タンパク質コーティング）の体系的なスクリーニングを可能にし、最適な生物活性界面を特定できる。
- 運用の価値：特殊な3Dイメージングや抽出プロトコルを必要とせず、既存の2D互換読み取り手法（例：創傷治癒、免疫蛍光染色）を活用することで、アッセイの標準化を促進する。
- 拡張性：腹側の条件を一定に保ちながら、背側基質のバリエーションを並行してテストできるため、中スループットのスクリーニングキャンペーンを支援する。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：2Dスクリーニングから3Dに関連した表現型評価まで分析の一貫性を維持することで、創薬探索ステージと前臨床ステージを橋渡しします。
- メカニズム解明におけるリスク低減：腹側のみの刺激による解釈を混乱させ得る背側の微小環境入力を制御することで、ターゲット変調研究における曖昧さを軽減します。
- 疾患モデルの妥当性：双方向のシグナリングが表現型の結果に影響を与える線維症や癌における、間質・上皮相互作用のモデリングを支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、ターゲットバリデーションアッセイを強化し、リード化合物同定前のバイオマテリアルと細胞の相互作用における構造活性相関研究を可能にすることで、初期のディスカバリーワークフローに統合されます。
- 探索生物学：腹側および背側のキューを独立して調整することで、インテグリンシグナル伝達、メカノトランスダクション、およびマトリックスリモデリングに関する仮説検証を可能にします。
- スクリーニング：ハイコンテンツイメージングプラットフォームと互換性のある、定量的で再現性のある表現型出力（例：移動速度、配向、ECM再編成）を提供します。
- 分析：ギャップ閉鎖率や細胞骨格組織などの測定可能な従属変数を生成し、材料条件間の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：コラーゲンゲルなどの3Dマトリックスで観察される細胞表現型（例：伸長した形態、方向性移動）を再現することで、前臨床研究との連続性を促進します。
- 企業での再利用：細胞型やタンパク質コーティングに応じて適応可能なモジュール式プラットフォームとして機能し、新しいターゲットやバイオマテリアルを探索する際の再バリデーションの必要性を低減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：腹側のみの過度に簡略化された刺激モデルによる偽陽性を減少させることで、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を向上させます。
- 運用的価値：播種、染色、およびイメージングに確立された2Dプロトコルを利用可能にすることで、再現性と標準化を強化します。
- 戦略的価値：2Dでは見落とされる可能性のある、微小環境に依存したターゲットの有効性を明らかにすることで、パイプラインのより早期段階でのgo/no-go決定に寄与します。
- ポートフォリオへの影響：組織の複雑性をより正確に反映した二重刺激条件下でのパフォーマンスに基づき、ターゲットやバイオマテリアルのリスク調整済み優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 背腹方向の刺激を一定に保つため、細胞培養、タンパク質コーティング、および微小環境工学に関する専門知識が必要です。
- 再現性のある背側基質（PLLAフィルムやファイバーなど）を作製するため、溶媒キャスト装置および無菌クリーンベンチへのアクセスに依存します。
- 混乱を招く変動を避けるため、腹側および背側の表面におけるタンパク質コーティング濃度とインキュベーション時間を標準化する必要があります。
- 背側基質の完全性を損なう可能性のある、非接着性または分解速度の速いバイオマテリアルへ拡張する場合、適応に関する検討が必要です。
- 後続のイメージングにおいて背側基質に光学的な透明性が求められるため、不透明または散乱性の高い材料の使用は制限されます。
