Name: 粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 58 s
Description: 学ぶ 粒子追跡マイクロレオロジーによるバイオフィルムの粘弾性特性測定法。蛍光微粒子を用いて微視的機械的特性を非破壊的に解析し、マトリックス成分の役割と物理的応答を明らかにする。

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この研究は優秀プログラムのその研究センターの下で教育シンガポール国立研究財団と省によってサポートされ、スタートアップ助成ナンヤン工科大学から（M4330002.C70）、およびACRFティア2（MOE2014-T2-2-172）教育省、シンガポールから。著者は、このプロトコルのデモに参加するためジョーイヤムクオックHoongに感謝します。

1.バイオフィルム栽培<ol><li>細菌株の作製<ol><li> 1日前にバイオフィルムの栽培に、凍結した細菌培養物からの適切な成長培地2mlを接種することにより、浮遊性細菌培養液を準備します。ムコイドPのルリア-ブロス培地（10gのL -1のNaCl、10グラムL -1の酵母抽出物、および10gのL -1トリプトン）を使用します緑膿菌とそのΔ ペルとΔPSL欠損変異株。 37℃、200 rpmで振とうした条件で一晩インキュベートします。分光光度計を用いて0.40のOD 600に一晩培養を希釈します。 </li><li>好ましくは、分解することなく、フローセルを撮像する顕微鏡部屋にすることができる移動局またはトロリーに、以前に記載14されたフローセルのセットアップを組み立てます。 </li><li> 2 Lまたは各フローセル5 Lボトルに無菌成長培地を準備します。最少培地M9（48ミリモルの Na 2 HPO 4、22 mMのを使用してくださいKH 2 PO 4、19 mMのNH 4 Clで、9のNaCl、2mMのMgSO 4を、および0.1mMのCaCl 2）Pの 0.04％グルコース（重量/容量）および0.2％（重量/容量）カザミノ酸）を補充し緑膿菌は、セルバイオフィルムを流します。 </li><li>マイクロ遠心チューブに小分け蛍光マイクロスフェアおよび9,391.2 gで遠心分離器で5分間滅菌H 2 Oにスピンダウン。前2 Lまたは5 L培地ボトルに増殖培地に添加するアジ化ナトリウム（消毒剤）を除去するために1ミリリットルの増殖培地中で上清と再懸濁を削除します。 注：マイクロスフェアの異なるサイズが異なる濃度で来て、指示に応じて希釈してください。例えば、2.18×10 6マイクロml -1の各粒子サイズのを与えるために直径1.0μmのマイクロスフェアの120μlを、0.5μmの直径のミクロスフェアと成長培地の2リットルに0.2μmの直径のミクロスフェアの0.96μlの15μlのを分散させます。 </li><li> upstを培地ボトルを取り付けフローセルの連増殖培地全体設定を通って流れることを可能にします。流れを停止し、フローセルチャンバーに希釈した一晩培養を注入。細菌が約5.5×10 -3 Mの秒 -1、または蠕動ポンプで8回転数の流量で成長培地の流れを継続する前に1時間カバーガラスの基層にアタッチすることを許可します。 注：バイオフィルムは、通常3-7日、室温（25℃）で栽培されています。 </li><li>また、静的な文化のセットアップのために、粒子と1ミリリットルの成長培地に一晩培養物10μlを加えることによって、微量遠心管中で一晩培養を100倍に希釈します。フローバイオフィルムに使用されるものに比べて約500倍の静的培養のための増殖培地中の粒子濃度を増やしフローセルバイオフィルムを常に補充される（例えば、増殖培地10mlに1.0μmの直径の球の600μLを洗浄し、再懸濁）粒子が、静置培養ではありません。 <ol><li> 200を追加します。1; 8ウェルスライドチャンバーに粒子と希釈し一晩培養物のリットル。静的な条件の下で、37℃でインキュベートします。バイオフィルムは、通常、1日に栽培されています。バイオフィルムは、1日以上成長させると粒子と新鮮な増殖培地で毎日過ごした成長培地を交換してください。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.顕微鏡<ol><li> 3日目と5日、蠕動ポンプからの流れを切り、顕微鏡室にフローセルのセットアップを持って来ます。フローからドリフト（環境の変化によって、系統誤差の原因）を防止するために、フローセルチャンバーの入口と出口の近くにチューブを固定します。正立顕微鏡の顕微鏡ステージ上にフローセルを置きます。 注：マイクロウェルのイメージングのために倒立顕微鏡を使用してください。 </li><li>以下のために（3日目および5）さまざまな場所（微小コロニーとフラット未分化層）で、別の日に、バイオフィルムに埋め込まれたマイクロスフェアの動きのビデオを取るために40倍油浸対物レンズで蛍光顕微鏡を使用してください時間的・空間的な調査。長い時間をかけてイベントを調査するために、短い時間スケール（高速ダイナミクス毎秒25〜50フレームのフレームレートで例えば 1.5〜3分ビデオ）内で発生するイベント、低いフレームレートで長い動画を調査するために、高いフレームレートで短いビデオを撮影スケール（2.5〜5フレーム/遅いダイナミクスのための秒のフレームレートで例えば 15〜30分間のビデオ）。 注：ビデオは、典型的には5~10の粒子を含み、ファイルサイズ、典型的に1.0から2.5 GBのです。大きい微小コロニーは、より多くの粒子を保持することができます。各カテゴリの5-10動画（異なる微小コロニーのとフラット未分化層内の異なる場所の例 5-10ビデオ）を取ります。バイオフィルムマイクロコロニー、チャネル、ボイドやフラット未分化の層から成ってもよい異種のアーキテクチャを有しています。 </li><li>フィジー/ ImageJの（例えばCZI、TIF）で読み取ることができる適切な形式で動画を保存します。 </li><li>完成したVIDをスクロールしてドリフトのためのビデオをチェックEO粒子が同時に同じ方向に移動しないことを観察します。ドリフトは、Zステージの動き、フローセル内の電流、除振台、空気圧や温度変化の不均衡によって引き起こされ得ます。正しいマイナー通常顕微鏡ソフトウェアを備えた後処理技術を使用して漂流。ドリフトを補正することはできませんここで任意のビデオを破棄します。解像度（ピクセル/ UM）、フレーム、時間数：粒子追跡解析時に必要とされている以下のパラメータを、記録しておきます。 </li><li>顕微鏡ステージからフローセルを取り外し、バイオフィルムを栽培継続する蠕動ポンプを再起動します。 </li></ol> 3.粒子追跡解析<ol><li>オープンソースソフトウェア（ImageJの）にプラグインTrackMateを使用することにより、粒子の軌跡を取得します。フィジーでダウンロード<a href="http://fiji.sc/Fiji">http://fiji.sc/Fiji。</a>フィジーでビデオを開き、プラグインメニューの下、トラッキングとTrackMateを選択します。 </li><li>目の設定を確認するか、調整Eウィンドウステップ2.4​​に記録されたビデオのパラメータを一致させるために、初期キャリブレーション設定を示唆しています。 </li><li> ImageJのを使用してTrackMate中の粒子を検出します。 <ol><li> （例えば1000）のログ検出器」、入力された粒子径およびしきい値を選択します。紫色の円は、ビデオ全体の粒子に従うことを確認するには、「プレビュー」ボタンをクリックしながら、映像をスクロールします。必要に応じて直径値としきい値を調整します。紫色の円は空のスペースに表示された場合のしきい値を大きくします。十分ではない粒子が検出された場合のしきい値を減らします。検出に粒子を完了するために、次のボタンをクリックします。 </li><li> 「初期しきい値」で検出された粒子を追加または削除するオプションが提示された場合、次のボタンをクリックし、[ビューを選択 &#39;と初期粒子検出が良好であった場合は調整せずに続行するには、Windows「フィルタを選択」を。 </li><li> OPTIの「簡易LAPトラッカー」を選択します「トラッカー方法を選択]ウィンドウのバーに粒子はほとんどバイオフィルムに焦点の外に移動しないと簡単に追跡されます。提案し、低リンクとギャップ閉鎖最大距離値を使用して、次へをクリックします。 </li><li>その粒子追跡は、粒子がTrackMateによって描かれたトラックに従うこと、および不要なまたは不足しているトラックがないことを確認するためにビデオをスクロールすることにより、良好であることを確認してください。さまざまなフィルタリングステップをスキップします。 「アクションを選択」最後のウィンドウに移動します。ドロップダウンメニューから「xmlファイルにエクスポートトラック」を選択し、「実行」をクリックします。トラックを保存するフォルダを選択してください。 注：粒子軌跡とマイクロレオロジーの使用を分析するためのパブリックドメインで利用できる様々なプログラムがあります。 msdanalyzerとTrackArtは、MATLAB環境で実行粒子トラッキング解析プログラムの一例です。 </li></ol></li><li>のメニューで選択することで、xmlファイル内の粒子軌跡をインポートするためにMATLABを準備MATLABファイル&gt; ...パスを設定し、フィジーのパッケージに使用可能なスクリプトフォルダを追加します。 </li><li> msdanalyzerと粒子軌跡を分析するために、zipファイルまたはtar.gzファイルへのリンクをダウンロードat <a href="http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories">http://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/40692-mean-square-displacement-analysis-of-particles-trajectories</a> . <ol><li> @msdanalyzerフォルダ15を抽出し、MATLABパスに属するフォルダにドロップします（ 例：C： Documents and Settings &lt;ユーザー名&gt; マイドキュメントは、MATLABを）。 MATLABを起動し、入力してアナライザを開始： MA = msdanalyzer（2、「ええと &#39;、&#39;秒 &#39;） UMと秒は、ビデオ内の物理的な空間と時間の単位である場合。 <ol><li>次のように入力して、粒子の軌道をインポートします。 [トラック、MD] = importTrackMateTracks（ &#39;ファイル名.xml&#39;、 &#39;C​​LIPZ」; &#39;scaleT&#39;） MA = ma.addAll（トラック）; ここで「CLIPZ」は、2D映像のためのZディメンションを削除し、「scaleT」。 </li><li>使用してグラフ上に軌跡をプロットします。 ma.plotTracks; ma.labelPlotTracks; </li><li>使用して粒子のMSDのを計算します。 MA = ma.computeMSD。 ma.msd </li><li>各粒子のMSDのをプロットします。 図 ma.plotMSD </li><li> ）3.5.1.4に3.5.1.1を繰り返して、同一categery（3日目に野生型微小コロニーに埋め込 ​​ま例えば粒子）の他のビデオから粒子軌跡を組み合わせます。 </li><li>アンサンブル平均または全ての曲線の平均値をプロットします。 ma.plotMeanMSD リニアから対数スケールにy軸とx軸を変更します。長いラグタイムで、MSD曲線はより長い時間スケールでの不十分な統計にノイジーになります。 MSD曲線はまた、動的エラーに急激に上昇することがあります。曲線のこれらの領域は、ブラシツールを使用して除去することができ&gt;曲線の終点を選択し、選択 &#39;ブラッシング」するツールメニューの「ブラシのかけていないと削除」。 </li></ol></li><li>でEzyfitをダウンロード<a href="http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/">http://www.fast.u-psud.fr/ezyfit/</a>とMATLABパスに属するフォルダにEzyfitを追加する（ 例：C： Documents and Settings &lt;ユーザー名&gt; マイドキュメントは、MATLABを）。インストールefmenu MATLABワークスペースを入力してEzyfitメニューをインストールします。 FigureウィンドウにEzyfitメニューを使ってMATLABを再起動します。 Ezyfitメニュー」が表示フィット&#39;&gt;&#39;パワー&#39;&gt;&#39; * X ^ n &#39;の中で選択することで、べき乗則にMSDカーブフィットは、nは、推定拡散指数 αでした。 注：msdanalyzerは、MSDカーブのフィッティングのためのMatlabの曲線フィッティングツールボックスが必要です。 Ezyfitはカーブフィッティングを行うことができ、代替とフリーソフトウェアです。 </li><li>他の場所や時間に新しい粒子のMSDを計算するためのクリア現在の粒子軌跡とのMSD： 明確な</LI&gt; <li>媒体中の粒子の様々な平均MSD曲線（コントロール）を算出した後、および微小コロニーと様々な株の未分化領域、比較のために1つのグラフにカーブをコピーして貼り付けます。試料の剛性と低いMSD値で増加を架橋。フラット曲線は低いαを持っており、サンプルが高いαで急勾配の曲線よりも弾力性があります。 </li><li>カーブを選択し、そのような中央値と範囲として、データ統計を見て、「ツール」を参照してください。ビーズのMSDは、ビーズが関係に応じて埋め込 ​​まれた材料のJ（t）はクリープコンプライアンスに比例し、 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/53093/53093eq1.jpg" /> ここで、J =クリープコンプライアンス、D =粒子径、k個のB =ボルツマン定数、T =温度と t =時間。 </li></ol></li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

マイクロレオロジーは、微生物バイオフィルムなどの異種システム、で地元のレオロジー測定のための便利なツールです。これは、複数の時点にわたって同じ生物学的サンプル中のレオロジーの変化のリアルタイム監視を可能にする、非破壊的技術です。このプロトコルでは、粒子追跡マイクロレオロジーは、それらが弾力性とバイオフィルムマトリックスの効果的な架橋をどのように影響するかを調べるために、ペルとPSLエキソポリサッカライドの変異体に適用しました。ペルは、粘弾性と緩いバイオフィルムを好むのに対し、PSLは、高い有効な架橋を有する弾性バイオフィルムの開発を促進します。両方のエキソポリサッカライドを製造する場合、バイオフィルムの微小コロニーは、ペル以上のPSLの減少と一致して、バイオフィルムが成熟するにつれて少なく効果的に架橋になります。 異なる細菌種によって形成されたバイオフィルムは、異なるEPS組成を有します。ムコイドPの EPS本研究で用いた緑膿菌の株主consi<html>エキソポリサッカライド16のSTS。他の種は、EPSの彼らの主要な構成...

ほとんどの細菌細胞は、両方のプランクトン（自由生活）と成長1の表面に付着した（固着）モードを採用することができます。成長の表面接続モードでは、細菌細胞が分泌し、バイオフィルムを形成するために、細胞外高分子物質（EPS）を大量に身を包みます。 EPSは、主にタンパク質、エキソポリサッカライド、外DNAで構成され、バイオフィルム形成2に不可欠です。これは、細菌が空間的に区別するために使用することが可能な物理的な足場として機能し、有害な環境条件と宿主応答から細菌を保護します。 EPSのさまざまなコンポーネントは、バイオフィルム形成3で異なる役割を持っており、EPSの成分の発現の変化は劇的にバイオフィルム構造体4 を改造することができます。 EPS成分も分子5のシグナルとして機能することができ、最近の研究では、それらの移動およびバイオフィルム差分を案内するために微生物細胞と相互作用する特定のEPSのコンポーネントを示していますerentiation 6-8。 EPSの研究は大きく、EPS 9,10の特定のコンポーネントで欠損変異によって生成したバイオフィルムの形態学的な分析に基づいて進んでいます。また、EPSは通常、マクロスケール（バルク特性評価）11で特徴づけられます。形態学的には、しかし、定量的なディテールやバルク特性評価を欠いて、平均値を返し、バイオフィルムの異質内に存在する詳細を失うことができます分析します。マイクロスケールでのEPSのメカニック特性のリアルタイム特性評価に進行する増加傾向が存在することになります。このプロトコルは、粒子追跡マイクロレオロジーは、 緑膿菌バイオフィルム4の粘弾性および有効な架橋のマトリックス成 ​​分ペルとPSLエキソポリサッカライドの時空間的効果を決定することができる方法を示しています。 パッシブマイクロレオロジーは、簡単かつ安価であるRH日付12,13の材料の空間microrheologicalサンプリングの最高のスループットを提供eology方法。受動的なマイクロレオロジーでは、プローブ球体は、サンプル中に配置され、熱エネルギー（k BはT）によって駆動されるそれらのブラウン運動は、ビデオ顕微鏡が続きます。いくつかの粒子が同時に追跡することができ、粒子の時間依存座標は、従来のランダムウォークに従ってください。したがって、平均して、粒子は、同じ位置にとどまります。しかし、粒子の変位の標準偏差または平均二乗変位（MSD）は、ゼロではありません。粘性流体が流れているので、時間が進むにつれて、粘性流体中の粒子のMSDは、直線的に増加します。これとは対照的に、粘弾性又は弾性物質で見られる高分子架橋は、彼らが流れに抵抗するのに役立ち、かつ粒子がMSD曲線（ 図1A）でプラトーにつながる、その変位の限らになります。この観察は、関係を次のMSDαt <sαは、物質の弾性と粘性の寄与の割合を関連している拡散指数であるα、&gt;アップ。 MSDはまた、恒久的に上に変形する材料の傾向である、クリープコンプライアンスを計算するために使用することができる粘性流体にα= 1、粘弾性物質で0 &lt;α&lt;1、及び弾性物質でα= 0で移動する粒子について時間とは、どのように簡単に材料のスプレッドを推定します。 粒子の大きさ、密度、および表面化学はmicrorheological実験の正確な適用に重要である（この場合、バイオフィルムマトリックスのポリマーは、 図1Bを参照）について検討システムに関して選択されます。まず、粒子は、粒子自体よりもはるかに小さい構造を持つ物質のレオロジーを測定します。物質の構造は、粒子、額面の動きと同様の規模のものである場合ticleは、個々の構造の形状や向きによって乱されます。しかし、粒子の周囲の構造が非常に小さい場合、この効果は小さく、粒子（ 図1B）に均質な環境を提示し、平均化。第二に、粒子の密度は、媒体（1.05グラムml -1の水性媒体のための）沈降を回避し、慣性力が無視できるようにしていることのようになります。ポリスチレンラテックス粒子のほとんどは、上記の基準を満たしています。運動は、物質の構造と熱エネルギーとの衝突によって駆動される、ランダムであれば、粒子のMSDのレオロジー解釈にのみ有効ですとして理想的には、粒子がバイオフィルムマトリックスのポリマーと相互作用しません。これは、プローブ粒子は、プレバイオフィルムの成長表面に結合するか、バウンスする傾向があるかどうかをチェックすることによって観察することができます。しかし、バイオフィルムへの魅力の欠如にもかかわらず、粒子がマトリックスに組み込むことができる必要があります。また、バイオフィルムの物理化学的不均一性は、異なる粒子は、バイオフィルムの異なる領域におけるプローブとして、より適している可能性があります。したがって、異なるサイズおよび表面化学の粒子は、バイオフィルムに適用されるべきです。 このように、粒子のMSDは、異なる成分がレオロジーに寄与し、バイオフィルムの拡散方法に関する有用な情報を提供することができます。さらに、異なるプローブの使用は1つがバイオフィルムの空間の物理化学的不均一性に関する情報を導出することができます。この方法は、バイオフィルムの機械的特性に影響抗菌治療を試験するために使用される、またはバイオフィルムの機械的特性は、別の種の導入によって変更されたかを調査するために、混合種バイオフィルムに適用することができます。粒子のMSDはまた、バイオフィルムの分散を特徴付けるために有用であり得ます。このような研究は、潜在的にAバイオフィルムの治療を改善する、バイオフィルムの我々の理解に役立つであろうND便利な活動のためのバイオフィルムのエンジニアリング。

<table><tbody><tr><td>フルオロスフィア</td><td>Invitrogen</td><td>F-8821</td><td>1.0 &#956;m カルボン酸修飾を有する赤色蛍光 (580/605) マイクロスフェア</td></tr><tr><td>Zeiss Axio Imager M1</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>エピ蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>Masterflex L/S デジタルドライブ 07523-80</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td>蠕動ポンプ</td></tr><tr><td>Flow Cell Chambers</td><td>デンマーク工科大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バブルトラップ</td><td>デンマーク工科大学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコーンチューブ</td><td>ダウコーニング</td><td></td>外<td>径3 mm、1&nbsp;mm内径</td></tr><tr><td>透明ポリプロピレンプラスチックコネクタ&nbsp;</td><td>コール・パーマー</td><td>06365-83</td><td>1/16 in.(1.588ミリメートル)</td></tr><tr><td>バインダークリップ</td><td></td><td></td><td>チューブ</td></tr><tr><td>カバースリップ</td>をクランプする <td>Thermo Scientific&trade;Nunc&trade;</td><td>50 x 24 mm</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ 3 ml</td><td>テルモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 &nbsp;Gニードル</td><td>テルモ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &nbsp;L ストレージ/メディアボトル</td><td>VWR&reg;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バイオフィルムのセットアップを保持するための</td><td>トロリー</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

細菌細胞は、細胞外高分子物質(EPS)に自分自身を包み込むことにより、バイオフィルムとして知られる表面付着バイオフィルムコミュニティを形成することができます。EPSは、細菌細胞を収容する物理的および保護的な足場として機能し、タンパク質、外多糖類、DNAなどのさまざまな材料で構成されています。EPSの組成は変化する可能性があり、これによりバイオフィルムのメカニズム特性が再モデル化され、環境の手がかりに対する応答として、ストリーマーなどの代替バイオフィルム構造がさらに開発またはサポートされます。それにもかかわらず、EPSコンポーネントがバイオフィルムの機械的特性と機能にどのように寄与するかについての定量的な説明はほとんどありません。物質の流れを研究するレオロジーは、多くのバイオフィルムが流動条件で成長し、常にせん断応力にさらされるため、バイオフィルムに特に関連性があります。また、表面上のバイオフィルムの広がりに関する測定と洞察も提供します。ここでは、粒子追跡マイクロレオロジーを使用して、開発中のバイオフィルムのさまざまな部分におけるさまざまなマトリックス成分の粘弾性と効果的な架橋の役割を調べます。このアプローチにより、研究者はバイオフィルムのメカニズム特性をマイクロスケールで測定することができ、バイオフィルムの制御とエンジニアリングに役立つ情報が得られる可能性があります。

ボイド（バイオフィルム上記培地）、平野（細胞の未分化フラット層）と微小コロニーを（ 図2A内のラベルを参照してください）含まバイオフィルム、の異なる領域におけるバイオフィルムの局所的な粘弾性特性を調べました。日3〜5の成熟の間のバイオフィルムの粘弾性特性の経時変化も測定しました。空隙中の粒子のMSDは、純粋な媒体中での粒子のMSDに制御匹敵として使用しました。これとは対照的に、バイオフィルムの中に閉じ込め粒子が固定された位置で振動とMSDの値は、粘弾性材料の代表的なものから強く弾性ゲル（ 図3）の範囲でした。 ムコイドP.緑膿菌野生型およびそのΔ ペル変異株 （ 図2Aおよび図2B）は、それらのバイオフィルムで3日目までに細い平野に散在する微小コロニーを開発しました。 3日目のプレーンは、あまりにも薄かったですレオロジー特性の調査。ムコイドP.によって形成されたバイオフィルムの両方で3微小コロニー日に緑膿菌野生...

Particle-tracking microrheologyは、材料の粘弾性を調査します。ここでは、この手法を使用して、細菌バイオフィルムのさまざまなマトリックス成分の粘弾性、クリープコンプライアンス、および効果的な架橋の役割を決定します。マトリックスは、バクテリアによって分泌される高分子物質とその成分がバイオフィルムの構造と機械的特性を決定します。

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

この手法の全体的な目的は、不均一なフローセルおよび静的バイオフィルムのマイクロドメイン内における実際の論理的特性を測定する方法を示すことです。この方法は、特定の指標成分、異なる種または化合物がバイオフィルムの神経学にどのように影響するか、またせん断力などの物理的な力に対する反応をテストするなど、バイオフィルム分野における学問上の重要な疑問に答えるのに役立ちます。これは高い空間分解能を持つ非破壊的な手法であり、生物学研究室にある標準的な装置で実施可能です。テキストプロトコルに従い、一晩培養した細菌培養液、備品、およびフローセル設定用の培地を準備した後、アジ化ナトリウムを除去するため、滅菌水中の蛍光マイクロビーズをマイクロ遠心チューブに分注し、フローフードなどの滅菌環境下でチューブを5分間遠心分離します。上清を除去し、1 mLの増殖培地を用いてマイクロビーズを再懸濁させます。その後、フローセル培養用の残りの増殖培地にマイクロビーズを加えます。テキストプロトコルに従ってフローセル培養をセットアップし、マイクロウェルチャンバー内で増殖させたバイオフィルム用の静置培養設定を行います。マイクロ遠心チューブに10 µLの一晩培養液を1 mLの増殖培地に加えることで、一晩培養液を100倍に希釈します。マイクロスフィアを含む培地。次に、希釈した培養液を用いてマイクロウェルチャンバーを満たし、37 °Cで静置条件下でインキュベートする。3日目と5日目に、ペリスタルティックポンプの流れを停止させ、フローセル装置を顕微鏡室に移動させる。次に、流れによるドリフトを防ぐため、フローセルチャンバーの入口と出口付近のチューブをクランプします。フローセルを倒立顕微鏡のステージ上に設置し、40倍油浸対物レンズと蛍光顕微鏡を用いて、時間的および空間的な調査のために、マイクロコロニーや平坦な未分化層など、バイオフィルム内のさまざまな位置におけるマイクロ spheres の動きを記録します。短時間で発生するイベントについては、高速なダイナミクスを捉えるためにフレームレートを上げて短時間の動画を記録します。より長いイベントについては、フレームレートを下げて長時間の動画をキャプチャします。ダイナミクスが遅い場合は、CZIまたはTiffなど、Fiji ImageJで読み取り可能な適切な形式でビデオを保存してください。ドリフトが発生していないか確認します。完了したビデオをスクロールして、粒子が同時に同じ方向に移動せず、ランダムに運動していることを確認してください。フローセルを顕微鏡ステージから取り外し、ペリスタルティックポンプを再始動してバイオフィルムの培養を継続します。記録したビデオから粒子追跡のトラジェトリーを取得するには、Fijiを開き、ファイルをロードします。プラグインメニューから「Tracking」を選択し、「TrackMate」を選択します。最初のキャリブレーション設定で、解像度とフレームレートのパラメータを確認または調整し、ビデオのパラメータと一致させます。粒子を検出するには、「LOG detector」を選択し、粒子の直径と閾値を入力します。例として、1000に設定します。プレビューボタンを確認し、ビデオをスクロールして、紫色の円がビデオ全体を通じて粒子を追跡していることを確認してください。閾値を上げます。空いたスペースに紫色の円が表示される場合は、閾値を下げてください。粒子の検出数が不十分な場合は、「次へ」ボタンをクリックして粒子の検出を完了させてください。最初の粒子検出結果に満足し、粒子の追加や削除の必要がない場合は、「次へ」ボタンをクリックします。続く3つのウィンドウ（初期閾値設定、ビューの選択、フィルターの選択）では、調整を行わずに選択してください。次に、「select A tracker method」ウィンドウのオプションバーで、「simple LAP tracker」を選択します。バイオフィルム内では粒子がフォーカス外に移動することは稀で追跡が容易であるため、推奨値または低めの「linking」および「gap closing max distance」値を設定し、「Next」をクリックします。ビデオをスクロールして、粒子がTrackMateによって描かれたトラックに従っているか、また不要なトラックや欠落したトラックがないかを確認し、粒子追跡が適切に行われているかチェックしてください。個々のトラッキング結果に基づいて粒子を除外するための、さまざまなフィルターが用意されています。これらが必要ない場合は、最後のウィンドウに進み、ドロップダウンメニューから「action」を選択し、「export tracks to XML file」を選択して「execute」をクリックしてください。フォルダを選択し、matlabにトラックを保存します。ファイルセットのパスを選択して粒子軌跡のXMLファイルをインポートする準備をし、粒子軌跡解析を実行するためにFijiパッケージに付属しているスクリプトフォルダを追加します。まず、MSD analyzerをダウンロードしてください。msd analyzerフォルダを解凍し、MATLABパスに含まれるフォルダにドロップします。MATLABを起動し、ビデオ内の物理的な空間単位をマイクロメートル、時間単位を秒として、次のように入力してアナライザーを開始します。次に、次のように入力して粒子の軌跡をインポートします。ここで、clip ZによりZ次元が除去されます。2次元ビデオとスケールに合わせて、Tを用いて時間次元の単位をフレームから秒に変換し、tracksを追加して粒子の軌跡をプロットします。以下を入力し、ここに示すコマンドを使用して粒子の平均二乗変位（MSD）を算出します。各粒子のMSDをプロットするには、figureおよびMA dot plot msdを使用してください。その後、同じカテゴリーの他のビデオから粒子の軌跡を統合します。import trajectoryコマンドを使用してトラジェクトリーをインポートし、先ほど示したようにmsdをプロットおよび計算することで、アンサンブル平均または全体の平均曲線をプロットします。以下を入力してください。その後、Y軸とX軸を線形スケールから対数スケールに変更します。ラグタイムが長い領域や、ダイナミックエラーにより急激に上昇している曲線の領域を除去するには、ブラシツールを使用して曲線の末端を選択します。次に、ツールメニューから「brushing」を選択してください。easyFITTをインストールし、フィギュアウィンドウにeasyメニューが表示される状態でMATLABを再起動した後、unbredを除去してください。テキストプロトコルに従い、「show fit power A times X to the N」を選択してMSD曲線をべき乗則に適合させます。ここでNは推定拡散指数αです。次に、他の位置または時間における新しい粒子のMSDを算出するには、「clear」と入力して現在の粒子軌跡とMSDを破棄します。異なるバイオフィルム株の様々な位置および異なる時間点における粒子の様々なMSD曲線を算出した後、それらの曲線をコピーして1つのグラフに貼り付けます。比較のために、曲線を選択し、「ツール」へ進んで、中央値範囲などのデータ統計を確認します。ビーズのMSDは、以下の式に示される関係に従い、ビーズが埋め込まれている材料のクリープコンプライアンスJFTに比例します。ここで、Jはクリープコンプライアンス、Dは粒子径、KBはボートマン定数（boatman's）を表します。大文字のTは温度、小文字のtは時間を表します。これらの実験では、空隙、平面、マイクロコロニーを含む、野生型P. arosaおよびdelta PE A変異株の異なるバイオフィルム領域における粘弾性特性を調査しました。空隙中の粒子のMSDを対照として用い、これは純粋な培地中の粒子のMSDと同等でした。対照的に、バイオフィルム内に捕捉された粒子は固定位置で振動しており、MSD値は、野生型およびdelta Pele株によって形成されたバイオフィルムにおいて、典型的な粘弾性材料から強弾性ゲルまでの範囲に及びました。3日目のマイクロコロニーにおける粒子のMSDは、0.1秒から10秒の時間スケールにおいて時間に依存せず、これはマイクロコロニーが弾性的であることを示しています。対応する粒子のMSDから算出されたクリープコンプライアンスの中央値は、それぞれ4.3 × 10⁻² Pa⁻¹および3.6 × 10⁻² Pa⁻¹でした。5日目までに、野生株におけるマイクロコロニーのクリープコンプライアンスは 2.5 × 10⁻¹ Pa⁻¹ まで増加し、マトリックス内の有効な架橋の減少が示されました。delta P-S-L-B-C-D 変異株によって形成されたバイオフィルムは、分化が進まず、発達が遅延し、3日目以降にマイクロコロニーが形成される厚い平面状の構造となりました。MSD値から、これらのバイオフィルムは野生株やdelta Pele株よりも架橋効率が大幅に低いことが分かりました。より多くのビデオを解析してもMSD曲線に新たな情報は得られなかったため、十分な統計量はマイクロドメインから取得しています。表面化学特性やサイズが異なる幅広い粒子を用いて微生物学的な解析を行うことが重要です。健康状態を調査するために、手順にさらなる実験を追加する場合もあります。せん断力などの物理的な力や化学的処理は、バイオフィルムの放射線学的特性に影響を与えます。微生物学的な抽出により、マイクロメートルスケールにおいて他の手法では容易に得られない構造情報を取得できます。このビデオを視聴することで、粒子の追跡方法、平均二乗変位（MSD）の分析方法、およびバイオフィルムの拡散指数の算出方法について十分に理解できるはずです。病原細菌を取り扱う際は危険が伴うため、十分にご注意ください。すべての廃棄物はオートクレーブ滅菌し、適切に処理する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: Kurz, D. L., 他 多孔質培地におけるバイオクロッキングを研究するためのマイクロ流体プラットフォーム。 J. Vis. Exp.

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粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

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