粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

この方法論の全体的な目標は、不均一なフローセルと静的バイオフィルムのミクロドメイン内の実際の論理特性を測定する方法を示すことです。この方法は、特定のメトリクスコンポーネント、さまざまな種、または化合物がバイオフィルム神経学にどのように影響するか、shereなどの物理的な力に対するその応答をテストするなど、バイオフィルム分野の学に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。空間分解能の高い非破壊技術であり、生物学研究所に標準装備されている機器で実施することができます。

テキストプロトコルに従って、滅菌水中の蛍光マイクロスフェアをマイクロ遠心チューブに分注してアジ化ナトリウムを除去し、フローフードなどの滅菌環境下でチューブを5分間スピンダウンし、スーパーネイトを除去し、1ミリリットルの増殖培地を使用してマイクロスフェアを再懸濁します。次に、フロー細胞培養のために残りの増殖培地にマイクロスフェアを添加します。マイクロウェルチャンバーで成長させたバイオフィルムの静的培養セットアップのテキストプロトコルに従ってフロー細胞培養をセットアップし、10マイクロリットルのオーバーナイト培養物を1ミリリットルの成長に加えて、マイクロ遠心チューブで一晩培養を100倍希釈します。

ミクロスフェアを含む培地。次に、希釈した培養物を使用してマイクロウェルチャンバーを充填し、静的条件下で摂氏37度でインキュベートします。3日目と5日目は、蠕動ポンプからのフローをオフにし、フローセルのセットアップを顕微鏡室に持ち込みます。

次に、フローセルチャンバーの入口と出口の近くにチューブをクランプして、流れからのドリフトを防ぎます。フローセルを正立顕微鏡のステージに置き、40 倍の油対物レンズと蛍光顕微鏡を使用して、マイクロコロニーや平坦な未分化層などのさまざまな場所でバイオフィルムに埋め込まれたマイクロスフェアの動きを記録し、時間的および空間的な調査を行います。短い時間スケールで発生するイベントの場合は、短いビデオを高速なフレーム レートで録画し、ダイナミクスを高速化します 長いイベントの場合は、フレーム レートを遅くして長いビデオをキャプチャします。

ダイナミクスが遅い場合は、CZI や Tiff など、フィジーの画像 J で読み取れる適切な形式でビデオを保存します。ドリフトが発生していないことを確認します。完成したビデオをスクロールして、パーティクルが同時に同じ方向に移動するのではなく、その動きがランダムであることを確認します。

顕微鏡ステージからフローセルを取り外し、蠕動ポンプを再起動してバイオフィルムの培養を続けます。録画したビデオの粒子追跡軌道を取得するには、フィジーを開いてファイルをロードします プラグインメニューで、追跡とトラックメイトを選択します。初期キャリブレーション設定で解像度とフレームレートのパラメータを確認または調整して、ビデオパラメータと一致するようにします粒子を検出するには、LOG検出器を選択し、粒子径としきい値を入力します。

たとえば、1000 です。プレビューボタンを確認し、ビデオをスクロールして、紫色の円がビデオ全体のパーティクルを追っていることを確認します。しきい値を増やします。

空きスペースに紫色の円が表示されている場合は、しきい値を小さくします。十分な粒子が検出されない場合は、[次へ] ボタンをクリックして粒子の検出を完了します。最初のパーティクル検出が問題なく、パーティクルを追加または削除する必要がない場合は、[次へ] ボタンをクリックします 次の 3 つのウィンドウでは、初期しきい値設定で、ビューを選択し、調整なしのフィルターを選択します。

次に、Select A tracker methodウィンドウのオプションバーで、simple LAP trackerを選択します。粒子がバイオフィルム内で焦点から外れることはめったになく、簡単に追跡できるため、推奨または低リンクとギャップ閉鎖の最大距離値を使用してクリックします。次に。ビデオをスクロールして、パーティクルが trackmate によって描画されたトラックをたどっていること、および不要なトラックや欠落しているトラックがないことを確認して、パーティクル トラッキングが適切であることを確認してください。

個々のトラッキング結果に基づいてパーティクルを除外するために、さまざまなフィルターが用意されています。これが不要な場合は、最終ウィンドウに移動し、ドロップダウンメニューから[アクション]を選択し、[トラックをXMLファイルにエクスポート]を選択して、[実行]をクリックします。フォルダを選択し、トラックを MATLAB に保存します。

粒子の軌跡のXMLファイルをインポートするには、ファイルセットのパスを選択し、Fijiパッケージで使用可能なscriptsフォルダを追加して、粒子の軌跡解析を実行します。まず、MSD アナライザーをダウンロードします。at msd analyzer フォルダーを抽出し、MATLAB パスに属するフォルダーにドロップします。

MATLAB を起動し、次のように入力してアナライザーを起動します。マイクロメートルと秒は、ビデオの物理的な空間と時間の単位です。次に、次のように入力してパーティクルの軌跡をインポートします。ここで、クリップ Z は Z 次元を削除します。A 2D ビデオとスケールの場合、T は時間次元の単位をフレームから秒にスケールし、トラックを追加してパーティクルの軌跡をプロットします。

次のように入力し、ここに示すコマンドを使用して粒子の平均二乗変位またはMSDSを計算します。各粒子の MSDS をプロットするには、Figure と MA のドット プロット msd を使用します。次に、同じカテゴリの他のビデオの粒子の軌跡を組み合わせます。

import trajectory コマンドを使用して軌跡をインポートし、先ほど示したように msds をプロットして計算し、アンサンブル平均または平均全体の曲線をプロットします。次のように入力します。次に、Y 軸と X 軸を線形スケールから対数スケールに変更します。

遅延時間が長い曲線の領域や、動的誤差から急激に上昇する曲線の領域を削除するには、ブラシ ツールを使用して曲線の終点を選択します。また、ツールメニューでブラッシングを選択します。Easy FITTをインストールし、図ウィンドウのeasyメニューからMATLABを再起動した後、unbredを削除してください。

テキスト プロトコルに従って、N が推定拡散指数アルファである [Show fit Power A x X to the N] を選択して、MSD 曲線をべき乗則に適合させます。次に、他の場所または時間で新しい粒子のmsdsを計算するには、現在の粒子の軌跡とmsdsを破棄するためにclearと入力します。異なるバイオフィルム株のさまざまな場所および異なる時点における粒子のさまざまなMSD曲線を計算した後、曲線をコピーして1つのグラフに貼り付けます。

比較のために、曲線を選択し、ツールに移動して中央値範囲などのデータ統計を確認します。ビードのMSDは、Jがクリープコンプライアンスに等しいこの式に示されている関係に従って、ビードが埋め込まれている材料のクリープコンプライアンスJFTに比例します。Dは粒子径に等しく、KBは船頭の直径に等しくなります。

一定の大文字の T は温度に等しく、小文字の T は時間に等しくなります。これらの実験では、野生型PアローサおよびデルタPE A変異株のさまざまなバイオフィルム領域(ボイド、プレーン、マイクロコロニーを含む)の粘弾性特性を調査しました。ボイド中の粒子のMSDをコントロールとして用い、純粋な媒体中の粒子のMSDと同等であった。

対照的に、バイオフィルムに閉じ込められた粒子は固定位置で振動し、MSD値は典型的なA粘弾性材料から、野生型およびデルタペレによって形成されたバイオフィルムの強弾性ゲルまで、粒子のMSDに幅がありました。その日、3つのマイクロコロニーは時間に対して時間とは無関係であり、脚は0.1秒から10秒で、マイクロコロニーが弾力性があることを示しています。対応する粒子msdsから計算したクリープコンプライアンスの中央値は、それぞれ10の4.3倍、負の2パスカルから負の2パスカル、10の3.6倍、負の2パスカルから負の1パスカルに対してそれぞれでした。

5日目までに、野生型株のマイクロコロニーのクリープコンプライアンスは、負の10倍の2.5倍に増加し、パスカルは負のものに対して、マトリックス内の効果的な架橋の減少を示しましたデルタP-S-L-B-C-D変異株によって形成されたバイオフィルムは、3日目以降にマイクロコロニーを発達させる厚い平面であまり分化せず、開発が遅れました。MSD値から、バイオフィルムは野生型およびデルタペレ株よりも架橋効果がはるかに低かった。より多くのビデオの分析がMSD曲線に新しい情報を追加しない場合、マイクロドメインから十分な統計が取得されます。

微生物学は、表面の化学的性質やサイズが異なるさまざまな粒子を用いて行うことが重要です。健康を調査するために、手順に追加の実験が追加される場合があります。物理的な力は、純粋なまたは化学処理は、バイオフィルム放射線学微生物学は、マイクロメートルスケールで他の方法で容易に取得できない構造情報を抽出します。

このビデオを見れば、粒子を追跡し、そのmsdsを分析し、バイオフィルムの拡散指数を取得する方法についてよく理解できるはずです。細菌性病原体を扱う作業は危険な場合があることを忘れないでください。すべての廃棄物はオートクレーブ処理され、適切に処分されなければなりません。