Name: 内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: 学ぶ強磁性ステントによる内皮細胞捕捉法。2205ステンレス鋼製ステントをCADとFEAで設計し、機械的完全性と磁場保持を検証。ブタを用いた生体内実験で細胞保持を確認し、心血管デバイスの治癒促進と血液適合性向上に貢献する。

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著者は、貴重な貢献に対してTyra Witt、Cheri Mueske、Brant Newman、およびMBBS、PhDのPeter J. Psaltis博士に感謝します。 この研究は、欧州地域開発基金(FNUSA-ICRC)の財政的支援を受けました。CZ.1.05/1.100/02.0123)、米国心臓協会科学者開発助成金(AHA#06-35185N)、国立衛生研究所(T32HL007111)、グレインジャーイノベーションファンド–グレインジャー財団。

すべての動物実験は、メイヨークリニックでの動物実験及び利用委員会（IACUC）によって承認されました。 2205ステンレス鋼ステントの1設計と解析<ol><li> CADを使用して、ベアメタルステントの設計<ol><li>ステントストラットの厚さに等しい壁厚に「押し出されたボス/ベース」機能を選択することにより、押し出された中空円筒を行います。 </li><li>押し出された円筒に対して接線方向に異なるスケッチ平面上のステントパターンを設計します。押し出された中空円筒の円周に合わせて、フラットパターンの幅を確認します。 </li><li>ラップ機能を使用して中空シリンダー上にフラットパターン設計を転送します。 </li><li> FEAのためにエクスポートするために、そのネイティブフォーマットでも、ACISフォーマットの一部を保存します。 </li></ol></li><li>ステントモデルの有限要素解析<ol><li>さらにanalysためFEAソフトウェアの一部のモジュールにACIS形式で保存されたソリッドジオメトリをインポートです。 </li><li> FEAソフトウェアの一部モデラーでステントにモデル2の分析シリンダ同軸。外筒は、クリンパと内筒の膨張バルーンをシミュレートするために1mmの初期直径を有するシミュレートするためにステントの直径よりも大きい初期直径を有しています。 </li><li>上記を組み立てる組立モデラーの「インスタンス」ツリー項目をダブルクリックして、相対的な位置で部品を述べました。 </li><li> FEAソフトウェアのメッシュモジュールを使用し、低減積分で20ノードの六面体エレメントとしての要素型を指定し、要素のサイズを指定し、ステントメッシュ。 </li><li>ステントとモデルツリーの「相互作用のプロパティ」で、それぞれ2つの気筒間の摩擦の剛性接点ペアを指定します。 </li><li>ステントモデルに2205ステンレス鋼の弾塑性応力 - ひずみ挙動を割り当てます。 </li><li>まずCをシミュレートする1​​ミリメートルに外筒を圧着するための境界条件を定義します。ステントのリンピン。クリンプステントの緩和をシミュレートするために、外筒を取り外します。展開をシミュレートし、最終的には、ステントの反動をシミュレートするために、内筒を除去するために、3mmの内筒を展開します。 </li><li> 「分析」モデルツリーの項目に割り当てられたプロセッサとRAMの量の数を含む、シミュレーションパラメータを定義し、シミュレーションを実行します。 </li><li>シミュレーションが完了すると、結果は主要な系統を研究し、反復的物質の故障限界未満である20％の主ひずみを達成するために、ステントの設計を改善するために、結果ファイル（filename.odb）及び後処理を開き。 </li></ol></li></ol>圧着および拡張のための2ステントの作製とテスト<ol><li>ステントの製造<ol><li>このようなパイオニアでアクション精密製品等の精密加工会社に銃の掘削および精密研削バーストック材料によって2205ステンレス鋼管を取得し、OHです。 </li><li>レーザー切断と電解研磨のためにこのようなウォーキーガン、イリノイ州のLaserageテクノロジー社としてステント切断会社に精密研磨管とフラットパターンのステント設計を転送します。 </li><li>さらに10分間塩基（10％のNaHCO 3）、続いて10分間、強酸（50％塩酸）でそれらを浸すことにより、電解ステントの表面を不動態化します。注意：適切な保護具を持つとヒュームフードの下に化学物質を扱います。最終的には、エチルアルコールと脱イオン水を用いてステントを洗浄します。このプロセスは、酸洗いと呼ばれています。 </li></ol></li><li>圧着および拡張のために製造のステントのテスト<ol><li>圧着工具、手持ちを使用してつ折りバルーン上にステントを圧着します。ステントと圧着工具でつ折りバルーンを保持します。放射状にバルーン上に圧着されるように、ステントを変形させるためにハンドルを押します。 </li><li>均一な圧着用顕微鏡とによる構造の故障の兆候を使用してクリンプステントを検査塑性変形します。 </li><li>水でつ折りバルーンを加圧して3mmの設計直径にそれを展開します。微細な骨折および均一な拡張のための拡張したステントを調べます。 </li></ol></li></ol>留保磁場用ステントの3キャラクタリゼーション注：2インチ、直径1インチの高さの円筒磁石は、この研究において使用しました。磁石の極は、軸に沿って整列されています。磁石の表面磁束密度は約1であるT. <ol><li>強力なネオジム磁石を使用して、直径又は軸方向にステントを磁化。磁化のため、約1分間の強力な磁石に近いステントを保持します。 </li><li>直径磁化又は軸方向にそれを磁化する磁力線に沿ってその軸と円筒面の隣にステントを保持する磁力線に沿ってその直径を平らな面の一つにステントを保持します。留保磁気金融商品取引法ステントの開発は、少なくとも24時間安定であるが、磁化後できるだけ早くステントを使用することが見出されました。 </li><li>ガラスマンドレル上に個別にステントをマウントして、磁気探査治具の精度チャックにガラスマンドレルをマウントします。磁気マイクロプローブは、正確にXYZを用いて表面に触れることなく、ステントの近くに配置することが可能な磁気探査固定具（ 図4）の組み立てをステージ。 </li><li>遠く離れたステントからの磁気マイクロのベースラインの読みを測定した後、磁気探査治具のXYZステージを使用してプローブを配置することによって、ステントの表面に保持する磁界を測定します。 </li></ol> 4.磁気細胞キャプチャー研究<ol><li>入手細胞、蛍光色素でSPIONおよび染色による標識<ol><li> 5,7で説明したように、ブタの末梢血から内皮成長細胞（EOC）を求めよ。 unti T-75フラスコで培養リットル約80％コンフルエント（5×10 6 6 8×10個の細胞）。 </li><li> 10 nmの直径のマグネタイト （Fe 3 O 4）8,9に記載のように厚さ50nmのポリ（乳酸-コ-グリコール酸）（PLGA）シェルによって囲まれたコアとしてSPIONsを合成します。 </li><li> 37 O℃で16時間、細胞培養培地に200μg/ mlの濃度でSPIONと導出EOCインキュベート</li><li>静かに細胞培養培地を吸引除去します。優しく、フラスコにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10mlを加える揺動し、PBSを吸引することにより細胞を洗浄します。 </li><li>実験中に可視化するための蛍光色素（CM-DiIを）で細胞を染色します。これは、5μL/ mlの濃度で細胞培養培地10mlに染料を添加し、37℃で30分間細胞をインキュベートすることにより、製造業者の指示に従って行われます。 </li><li>ステップ4.1.4のようにPBSで細胞を洗浄し、37℃で5分間、0.25％トリプシン-EDTA溶液3mlでインキュベートフラスコから細胞を持ち上げます。 </li><li>細胞ペレットを形成するために、5分間500×gで15ミリリットルコニカルチューブ、PBSでトップオフ、および遠心分離機に細胞懸濁液を転送します。 </li><li> 1-2x10 6細胞/ mlの濃度でPBS中に細胞ペレットを再懸濁し、数回にし、円錐管からピペッティングにより完全に混和します。 </li></ol></li><li> インビトロ細胞試験<ol><li> （例えば、3D印刷）だけカバーガラスの表面上にステントを保持するための簡単な治具を設計・製作してください。 </li><li>電磁消磁装置を使用してステントを消磁や強いネオジム磁石を使用して、直径又は軸方向にステントを磁化。 </li><li>軸方向に磁化さや直径磁化または非磁化対照ステントを含む皿にPBSに懸濁SPION標識EOCをピペット。画像倒立蛍光顕微鏡を用いて蛍光についてすぐにPBSに懸濁EOCを有するステント。 </li></ol></li></ol><pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 5。 生体内で動物研究<ol><li>ステント移植<ol><li> 4健康ヨークシャーブタからの末梢血を描く- 5,7で説明したように3週間前にそれぞれ移植し、ステントと文化EOCする-約50キロで計量。 </li><li> （毎日アスピリン325mgのクロピドグレル75 mg）を、手術の3日前に開始する抗血小板薬を投与します。 </li><li>該当機関の動物の管理と使用に関するガイドラインに記載されているようにステント移植の日には、筋肉内テラゾール、キシラジン、およびアトロピン（それぞれ5 / 2-3 / 0.05ミリグラム/ kg）で豚を麻酔。 </li><li>挿管と1から2.5パーセントイソフルラン麻酔の吸入に豚を配置します。 </li><li>豚の腹側ネック領域を剃ると、一般的な無菌状態で手続きを行っています。 </li><li>インプラント1は、標準的な心臓カテーテル技術を使用して右冠動脈（RCA）に着磁1非磁性ステント。 <ol><li> Cathete動物のrizationは訓練されたインターベンション心臓病専門医が行ってください。 9フランスの鞘で右頚動脈にアクセスします。 </li><li>ターゲット冠動脈にカニューレを挿入し、透視画像を取得するためにヨード造影色素を注入します。 </li><li>動脈内の0.014インチの標準冠状動脈ガイドワイヤを配置します。このガイドワイヤーを使用して、バルーンやステントを進め、3〜3.5ミリメートルの直径の容器内にステントを展開。 </li></ol></li><li>ワイヤーバルーン上で使用して移植したステントへのRCA近位内の血流を閉塞し、2分間かけて、中央カテーテルを介して4mlのPBSに懸濁SPIONで標識された約2×10 6自家EOCを提供します。 </li><li>追加の閉塞の2分後のRCAへの血流を復元します。 </li><li>回復室に​​動物を移し、それは意識を取り戻したまで密接に動物を監視します。 </li><li>抗血小板薬（アスピリン325mgのクロピドグレル75メートルの管理を継続しますg）を犠牲にするまで、術後。 </li></ol></li><li>ステント植片および組織学<ol><li>該当機関の動物の管理と使用のガイドラインに従って静脈内ペントバルビタールナトリウム（100mg / kg）の致死量を投与し、その後、以前に説明したように、第1の動物を麻酔により7日手術後、動物を安楽死させます。 </li><li>外科的ステント付動脈セグメントを収穫。最低30分間​​10％ホルマリン緩衝液中に外植動脈を修正しました。さらなる組織学的分析のためにホルマリンバッファ内のサンプルを残します。 </li><li>金属ステントと組織学を行うことのできる施設に固定された試料を外部委託しています。この処理の間、サンプルは、メチルメタクリレートに埋め込んされる断面に、鉄粒子のためのプルシアンブルー染色でマロリーの染色技術を使用して組織学的に分析しました。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

私たちは、ベアメタルステントとして機能することが可能とSPION標識内皮細胞を引き付けることができる磁気ステントを開発しました。磁気ステントを伴う以前の研究では、研究者が原因で、強磁性ステント5,10-14の使用不能に磁性材料で作られたニッケル被覆商業ステントおよびコイルまたはメッシュを使用しています。他のグループはまた、ナノ粒子ロード内皮細胞3を標的とするために、市販の304グレードのステンレス鋼ステントの常磁性の性質を使用しています。ニッケルコーティングは、ステントを受けている患者にアレルギー性であってもよく、常磁性のステントは、磁性ナノ粒子3,5を引き付け、維持するために外部磁界を必要としています。したがって、機能的な強磁性ステントの設計および開発は、細胞送達用途だけでなく、他の臨床応用10,15-20のために重要です。 2205ステンレス鋼 - - この研究のために選択された材料の二重の性質はwがそれを作ります強磁性eakly。そのような316Lステンレス鋼（70％）として6,21,22ステントを製造するために使用さ...

ステンレス鋼、コバルトクロム、プラチナクロムなどの血栓形成材料から製造された血管ステントを移植された患者は、どちらもベアメタルステント(BMS)と薬物溶出ステント(DES)の両方であり、血栓形成を防ぐための抗血小板療法が必要です。 BMSは急速に治癒しますが、治癒が不完全であるため、後期再狭窄の影響を受けます。 DESは治癒が遅れるため、長期の抗血小板療法が必要です。 治癒が不完全または遅延した結果として血栓症を避けるために投与される抗血小板療法は、出血リスクの増加につながり、特定の患者には適さない場合があります1,2。 理想的なステントは完全かつ迅速に治癒するため、長期の抗血小板療法や後期の再狭窄を回避できます。 この完全な治癒は、移植後にステントが内皮細胞の単層で急速にコーティングされている場合にのみ達成できます。 ステントを金や他の生体高分子などの生体適合性材料でコーティングすると、血栓抵抗性が改善することが示されていますが、これらの技術のいずれも、内皮細胞でコーティングすることによって可能になる可能性のある理想的な血液適合性を達成しませんでした3,4。
ステントは、循環する前駆細胞を引き寄せることにより、移植後に内皮細胞でコーティングすることができます。 このセルフシーディング技術は、リガンドと抗体を利用することで実現できます。 しかし、この手法は、循環する内皮前駆細胞の数が少ないために制限されています。 有望な戦略は、移植直後の短時間の血流閉塞3,5の間に細胞を直接ステントに送達することです。 この戦略には、血流を回復した後でも細胞を迅速に捕捉し、ステント上に保持する技術が必要です。 私たちは、磁気ステントを使用して、移植後に送達された磁気標識内皮細胞を引き付けて保持する技術を開発しました。 これを達成するためには、磁気標識内皮細胞を捕捉し保持するのに十分な磁気特性を有する機能的BMSが必要である6。
この論文では、2205ステンレス鋼ステントの設計、製造、および試験の方法について説明します。 ステントはCADとFEAを使用して設計されました。 作製したステントをネオジム磁石で着磁し、磁気抵抗マイクロセンサープローブで保持磁場を測定しました。 次に、インビトロ実験中に、ステントを培養皿内で磁気標識細胞捕捉について試験しました。 最後に、ステントを生体内で試験し、4頭のブタに磁性ステントと非磁性ステントを埋め込み、ステント留置動脈を組織学的に分析しました。

<table><tbody><tr><td>2205ステンレス鋼</td><td>カーペンターテクノロジーコーポレーション</td><td></td><td>丸棒ストック材料</td></tr><tr><td>Abaqus</td><td>ダッソーシステム</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>アトロピン</td><td></td><td></td><td>処方薬。</td></tr><tr><td>クロピドグレル</td><td></td><td></td><td>商品名:プラビックス。処方薬。</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Life Technologies</td><td>V-22888</td><td>分子プローブ、ユージーン、または</td></tr><tr><td>内皮成長培地-2</td><td>ロンザ</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド圧着工具</td><td>ブロックワイズ エンジニアリング</td><td>M1-RMC</td><td></td></tr><tr><td>塩酸 (HCl)</td> <td>シグマ アルドリッチ</td><td>MFCD00011324</td><td>注意: プロテクティブ デバイスを着用し、ヒュームフード</td></tr><tr><td>イソフルラン麻酔</td><td>の下でハンドルを着用してくださいPiramal Critical Care, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>NdFeB 磁石 2" Dia x 1" 厚さ</td><td>素晴らしい磁石</td><td>D1000P</td><td>平らな面に極を持つ軸方向に磁化されたディスク磁石</td></tr><tr><td>Over-The-Wire 三つ折りバルーン</td><td></td><td></td><td>市販の OTW 三つ折りバルーンを使用することができます</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10010-023</td><td>一般にPBS</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>として知られているシグマアルドリッチ</td><td>MFCD00003528</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>ゾエティス</td><td></td><td>商業名:スリープアウェイ(26%)、FatalPlus、Beuthanasi。規制物質は、ライセンスを受けた獣医師のみが注文できます</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault systems</td><td></td><td>ソフトウェア</td></tr><tr><td>SpinTJ-020 マイクロセンサー</td><td>MicroMagneitcs Sensible Solutions</td><td></td><td>ロングプローブ STJ-020 マイクロセンサー</td></tr><tr><td>SPION</td><td>Mayo Clinic</td><td></td><td>内部で合成されたナノ粒子 (参照: Lee, S. J. et al. ポリ(D,L latide-co-glycolide) でカプセル化された磁性酸化鉄のナノ粒子磁気共鳴画像造影剤へのそれらの応用。J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004)</td></tr><tr><td>)Telazol</td><td>Zoetis</td><td></td><td>認可された獣医師のみが注文する規制物質</td></tr><tr><td>Trypsin EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td>Gibco, Grand Island, NY</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>Bayer Animal Health</td><td></td><td>商業名: Rompun.認可された獣医によってのみ注文される制御されたサンスタンス</td></tr></tbody></table>

内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention

心血管ステントの急速な内皮化は、ステント血栓症を低減し、出血のリスクを減らすことができる抗血小板療法を回避するために必要とされます。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（SPION）で標識された内皮細胞の伸長（EOC）を取得し、保持するために磁力を使用することの実現可能性は、以前に示されています。しかし、この技術は、迅速な内皮化を証明するために、in vitroおよびin vivo試験に続いて、磁性および生体適合性の材料から機械的に機能的なステントの開発が必要です。我々は、コンピュータ支援設計（CAD）を使用して、2205二相ステンレス鋼から弱い強磁性ステントを開発し、その設計は、さらに、有限要素解析（FEA）を用いて精製しました。ステントの最終的な設計は、機械的圧着し、拡張中に材料の破壊限界以下の主ひずみを示しました。百ステントを作製し、それらのサブセットは、機械的試験のために使用した、RETained磁場測定、 インビトロ細胞取り込み研究及びインビボ移植実験。十ステントは、それらが故障せずに圧着し、膨張サイクルを持続かどうかを確認するために展開するために試験しました。別のステント10は、強力なネオジム磁石を用いて着磁し、その保持磁界を測定しました。ステントは、保持磁力が我々のインビトロ研究においてSPION標識EOCを捕捉するのに十分であったことを示しました。 SPION標識EOCを捕捉および保持を4匹のブタのそれぞれに1着磁ステント1の非磁化対照ステントを移植することにより、大型動物モデルにおいて確認されました。ステント動脈を7日後に外植し、組織学的に分析しました。本研究で開発した弱磁性のステントは、誘致し、迅速な治癒を促進することができるSPION標識内皮細胞を保持することができました。

<html> FEA（ 図1）に基づく反復ステント設計は、圧着し、30％の最終的な株よりも小さい20％の主ひずみを拡張することができ、ステントを示しました。圧着及び拡張試験（ 図2）は 、破壊の徴候を示さありませんでした。変形したステントの写真は、FEA計算された変形と良い一致を示し、また、顕微鏡写真には、骨折に（ 図3）を示さありませんでした。保持磁界測定（ 図4＆5）から予想されるように、SPION標識細胞は、優先的に軸方向に磁化されたステントに曲がったセグメントに引き付けられ、より均一直径磁化ステント（ 図6）内の直線セグメントに魅了されました。組織学の画像は7日間の注入期間（ 図7）の間にステントにEOCの魅力と保持を証明するステント支柱の近くに鉄染色を示しました。 &quot;&gt; <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53100/53100fig1.jpg" /> ...

私たちの目標は、内皮細胞の捕捉のための強磁性体のステントを設計、製造、テストしました。十ステントは、骨折のために試験し、10以上のステント保持磁力を試験しました。最後に、10のステントは、 インビトロで試験したところ、8複数のステントは、細胞捕獲および保持を示すために、4匹のブタに移 ​​植しました。

Rapid endothelialization of cardiovascular stents is needed to reduce stent thrombosis and to avoid anti-platelet therapy which can reduce bleeding risk. ...

本実験の全体的な目的は、磁性ナノ粒子で標識された血管内皮細胞を捕捉し保持することが可能な強磁性ベアメタルステントを開発することである。これは、CAD（コンピュータ支援設計）およびFEA（有限要素解析）ソフトウェアを用いて2205ステンレス鋼ステントを設計し、クリンピング（圧着）および拡張時におけるステント材料と構造の機械的挙動を適切に把握することで達成される。次に、作製したステントを機械的にクリンピングおよび拡張させ、機械的完全性を実証し、さらにステントの磁場保持能を検討することで、磁気挙動を検証する。その後、ブタにステントを植え込み、磁性ナノ粒子でラベル化した血管内皮細胞を投与して、冠状動脈循環における細胞の捕捉と保持を確認します。その結果、in vivo実験から摘出した血管の組織学的解析により、本研究で開発した強磁性ステントが磁気ラベル化された血管内皮細胞を捕捉し、保持できることが示されました。迅速な内皮化は治癒を促進し、血液適合性を向上させるため、この技術の意義はさまざまな心血管デバイスの開発へと展開されます。一般的に、本手法を初めて行う方は、ステント設計に不可欠なCADおよびFEA手順の複雑さに苦労することがあり、また、細胞培養も初心者には困難な場合があります。厳格な無菌環境を維持することが極めて重要であるため、我々はステントの治癒能力を向上させることを目的とし、磁力を用いて生細胞をステントに付着させるというアイデアを考案しました。クリンピングおよび拡張時の材料挙動の複雑さや、ステントへの磁気的な細胞捕捉という手法の新規性から、ステントの開発および細胞定着のステップを習得することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが不可欠です。まず、CADソフトウェアを使用して、壁厚をステントストラットの厚さと等しく設定した押し出しボスベース機能を選択し、押し出し中空シリンダーを作成します。押し出しシリンダーに接する別のスケッチ平面上に、ステントパターンを設計します。展開パターンの幅を、押し出し中空シリンダーの円周と一致させてください。ラップ機能を使用して、展開図のデザインを中空シリンダーに転写します。パーツをネイティブ形式およびFEA用にエクスポートするためのACEs形式で保存します。有限要素解析を行うには、ACEs形式で保存したソリッドジオメトリをFEAソフトウェアのパーツモジュールにインポートし、ソフトウェアのパーツモデラーでさらに解析を行います。ステントと同軸に2つの解析用シリンダーをモデル化します。アセンブリモデラーのインスタンスツリー項目をダブルクリックし、FEAソフトウェアのメッシュモジュールを用いて、パーツを相対位置にアセンブリします。要素を、低減積分を用いた20節点六面体要素として指定します。モデルツリーのインタラクションプロパティ内で、要素サイズを指定し、ステントのメッシュを作成します。ステントと2つのシリンダーのそれぞれとの間に、摩擦のない剛体接触ペアを指定します。2205ステンレス鋼のELAs opl応力-ひずみ挙動をステントモデルに割り当てます。境界条件を定義し、まず外筒を1 mmまで圧縮してクリンピングをシミュレートします。その後、外筒を取り除き、クリンピングされたステントの緩和をシミュレートします。膨張をシミュレートするために内筒を3mmまで拡張し、最後に内筒を取り除いてステントのリコイルをシミュレートします。シミュレーションが完了したら、結果ファイルを開き、結果の後処理を行って主ひずみを検討します。材料の破断限界である20%未満の主ひずみを達成するように、ステントの設計を繰り返し改善します。2205ステンレス鋼チューブを入手し、ドラフトチャンバー内で適切な保護具を着用して、本文のプロトコルに従いステントをカットします。電解研磨済みステントの表面を不動態化させるため、ステントを50%塩酸に10分間浸漬させ、続いて10%炭酸水素ナトリウムにさらに10分間浸漬させて酸洗い（アシッドピックリング）を完了させます。エタノール、次いで脱イオン水を用いてステントを洗浄します。その後、ステントのクリンピング試験を行うため、ステントと3つ折りバルーンを用意します。ハンドヘルドクリンピングツールを用い、ハンドルを押し込んでステントをバルーン上にクリンピング（圧着）します。顕微鏡下でクリンピングされたステントを観察し、均一にクリンピングされているか、および破損の兆候がないかを確認した後、水を用いて3層バルーンを加圧し、ステントを設計径である3 mmまで拡張させます。強力なネオジム磁石を使用し、拡張したステントに微小な破断がないか、および均一に拡張しているかを検査します。ステントの直径方向を磁力線に沿わせ、平らな面のいずれかにステントを固定して直径方向に磁化させます。あるいは、ステントの軸を磁力線に沿わせ、円筒面（側辺）に沿ってステントを固定し、軸方向に磁化させます。強力な磁石の近くにステントを約1分間保持してください。磁化を行うため、ステントを個別にガラス製マンドレルに取り付け、次にそのガラス製マンドレルを磁気プローブ固定具の精密チャックに取り付けます。磁気プローブ固定具のX、Y、Zステージを用いて、表面に触れないように磁気マイクロセンサープローブをステントの近くに精密に配置します。ステントから十分離れた位置で磁気マイクロセンサーのベースライン値を測定し、その後、x、y、Zステージを使用してプローブを配置し、ステント表面の残留磁場を測定します。本文のプロトコルに従ってブタ末梢血から内皮細胞出芽細胞（EOC）を誘導した後、T 75フラスコ内で細胞が約80%コンフルエントになるまで培養します。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（pyon）を合成した後、細胞培養液中のEOCに200 micrograms per milliliterの濃度でpyonを添加します。37 degree Celsiusで16時間インキュベートします。細胞培養液を静かに吸引し、フラスコに10 millilitersのPBSを加えます。その後、静かに揺らして吸引します。メーカーの指示に従って細胞を染色するため、10 millilitersの培養液にCM DAIなどの蛍光染料を5 micrograms per milliliter加え、37 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。前回と同様にPBSを用いて細胞を穏やかに洗浄し、次に0.25% trypsin EDTA溶液を加えて37 °Cで5分間インキュベートし、フラスコから細胞を剥離させます。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。PBSを加えて液量を調整し、500 ×gで5分間遠心分離して、上清を捨てた後に細胞をペレット化させます。PBSを用いて、細胞を100万から200万 cells/mLの濃度で再懸濁します。in vitro細胞研究では、ガラスカバースリップの表面の直上にステントを保持するための簡単な固定具を設計・作製してください。電磁脱磁器を用いてステントを脱磁させるか、あるいは強力なネオジム磁石を用いてステントを直径方向または軸方向に磁化させます。PBSに懸濁させたspy on labeled e oocを、軸方向磁化、直径方向磁化、または非磁化コントロールステントが入ったディッシュにピペットで分注します。次に、倒立蛍光顕微鏡画像を用いて、PBSに懸濁させたEOCを含むステントを準備します。抗血小板薬を投与し、本文のプロトコルに従って麻酔をかけた4頭の健康なヨークシャー種豚に対し、標準的な心臓カテーテル法を用いて、磁化ステント1本と非磁化ステント1本を右冠状動脈（RCA）に留置します。ガイドワイヤーを使用してオーバーザワイヤーバルーンでバルーンとステントを前進させた後、留置したステントの近位側でRCA内の血流を遮断します。その後、2分間かけて、s-scionsで標識し4 mLのPBSに懸濁させた約200万個の自家EOCを中央カテーテル経由で注入します。さらに2分間の遮断時間を経た後、RCAの血流を再開させ、ステントを回収して組織学的解析を行います。ここに示す本文のプロトコルによれば、FEAに基づく反復的なステント設計により、主ひずみが20%でクリンプおよび拡張可能なステントが導き出されました。これは、究極ひずみの30%を下回る値です。レーザーカットおよび電解研磨を施し、トリフルバルーンカテーテルでクリンプした後、トリフルバルーンを用いて3 mmまで拡張させたステントに、破断の兆候は見られなかった。変形したステントの画像はFEAで算出された変形と良好に一致しており、また顕微鏡写真においても、残留磁場測定の結果から予想された通り破断は認められなかった。標識された細胞のSPYは、軸方向に磁化したステントにおいては優先的にベンセグメントに引き寄せられ、直線セグメントにはより均一に引き寄せられた。直径方向に磁化されたステントにおいて、組織学的画像ではステントストラット付近に鉄染色が認められ、7日間の植え込み期間中にEOCがステントに誘引され、保持されたことが確認されました。この手順を試みる際は、不適切な入力パラメータを用いた場合のFEAおよびCADの概念を理解することが重要です。パラメータが不適切であると、剛性が高すぎるか、あるいはステント破断の傾向があるといった、誤ったステント設計となってしまいます。この手順に従ってください。ステントの長期的な耐久性と生体適合性はどのようなものであるか、といった追加の疑問に答えるために、加速疲労試験や毒性試験などの他の手法を実施することも可能です。数年にわたる開発を経て、現在、豚モデルで検証された機能的な技術が確立されています。このビデオを視聴することで、強磁性ステントの開発方法、および磁気ラベル化された動脈細胞の捕捉と保持の試験方法について十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

自己細胞とテスト生体適合性とチタンの血液接触生体材料をシードする方法について説明する。このメソッドは、ブタ静脈cavaeに外科的に移植後数分以内に接種した内皮前駆細胞およびチタンチューブを、使用しています。この手法は、他の多くの埋め込み型医用機器に適応可能です。...

大動物モデルにおける心血管デバイス用自家血管内皮前駆細胞播種技術と生体適合性試験

我々は、FDAに承認された、超常磁性酸化鉄（SPIO）、ferumoxytol（Feraheme）で幹細胞を標識して追跡するためのテクニックを説明します。可視化のために磁気共鳴（MR）イメージングを利用したこの細胞のイメージング技術は、患者の成功または失敗した幹細胞のengraftmentsの長期的な監視と診断のための容易にアクセス可能です。...

Ferumoxytol、FDA承認酸化鉄ナノ粒子で幹細胞のラベリング

マウス頸動脈内ステント移植のモデルが記載されている。他の同様の方法に比べて、この手順が異なる薬剤溶出ステントおよび再狭窄の分子機構に対する血管壁の反応便利な方法で勉強する可能性を提供し、非常に、迅速かつ簡単にアクセスできます。...

再狭窄の研究のための頸動脈内ステント留置のマウスモデル

これらの研究は、アデノウイルス遺伝子ベクターのステントおよびモデルメッシュディスクのコートレス金属表面への可逆的な付着について報告しています。ベクター固定化に使用される架橋剤の加水分解を条件として、形質導入にコンピテントなウイルス粒子が持続的に放出されるため、血管細胞やステント留置動脈において、部位特異的な導入遺伝子の持続的な発現が得られます。...

加水分解性架橋剤を介してアデノウイルスベクターテザーを使用した金属ステント表面からの血管の遺伝子導入

標的細胞送達は、さまざまな生物医学的応用に有用です。...

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

プロトコルでは、バルーン拡張ステントを2つのエレクトロスピニングナノファイバースポリウレタン層の間に挟むことにより、小口径のステントグラフトを製造する方法を提示します。...

エレクトロとバルーン拡張ベアメタルステントを使用した小口径ステントグラフトの作製

コバルトドープマグネトフェリチンの合成とカチオン化のためのプロトコールと、カチオン化マグネトフェリチンで幹細胞を迅速に磁化する方法が紹介されています。...

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

幹細胞から軟骨形成は、培養条件の微調整が必​​要です。ここで、我々は、細胞を集光するための軟骨形成を開始するために不可欠なステップを磁気アプローチを提示します。また、当社は、バイオリアクター内の動的成熟は、細胞の構造に機械的刺激を適用し、軟骨細胞外マトリックスの産生を増強することを示しています。...

軟骨再生のための3次元磁気幹細胞凝集およびバイオリアクター成熟

この原稿は、PEI / MNPベクター及びその磁化により内皮細胞へのmiRの効率的な、非ウイルス送達を記載しています。このように、遺伝的改変に加えて、このアプローチは、磁気細胞ガイダンスやMRIの検出能が可能になります。技術は、治療用細胞製品の特性を改善するために使用することができます。...

準備と<em&gt;インビトロ</em磁化のmiR修飾内皮細胞の&gt;キャラクタリゼーション

この研究では、特定の細胞を標的とする抗体を用いて磁性ナノ材料を生体機能化するためのプロトコルを提供します。その一例として、鉄ナノワイヤを用いてがん細胞を標的としています。...

磁性ナノ材料の生体機能化

ここで提示されるペプチドCD47(pepCD47)をポリビスフォスフォネート化学を用いて金属ステントに付加するためのプロトコルです。pepCD47を用いた金属ステントの機能化は、炎症細胞の付着および活性化を防止し、生体適合性を向上させる。...

CD47由来ペプチド固定化による金属インプラントへの血液媒介性細胞の取り付けの軽減

学ぶ強磁性ステントによる内皮細胞捕捉法。2205ステンレス鋼製ステントをCADとFEAで設計し、機械的完全性と磁場保持を検証。ブタを用いた生体内実験で細胞保持を確認し、心血管デバイスの治癒促進と血液適合性向上に貢献する。

内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

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