内皮細胞捕捉および保持のための強磁性ベアメタルステント

本実験の全体的な目的は、磁性ナノ粒子で標識された血管内皮細胞を捕捉し保持することが可能な強磁性ベアメタルステントを開発することである。これは、CAD（コンピュータ支援設計）およびFEA（有限要素解析）ソフトウェアを用いて2205ステンレス鋼ステントを設計し、クリンピング（圧着）および拡張時におけるステント材料と構造の機械的挙動を適切に把握することで達成される。次に、作製したステントを機械的にクリンピングおよび拡張させ、機械的完全性を実証し、さらにステントの磁場保持能を検討することで、磁気挙動を検証する。

その後、ブタにステントを植え込み、磁性ナノ粒子でラベル化した血管内皮細胞を投与して、冠状動脈循環における細胞の捕捉と保持を確認します。その結果、in vivo実験から摘出した血管の組織学的解析により、本研究で開発した強磁性ステントが磁気ラベル化された血管内皮細胞を捕捉し、保持できることが示されました。迅速な内皮化は治癒を促進し、血液適合性を向上させるため、この技術の意義はさまざまな心血管デバイスの開発へと展開されます。

一般的に、本手法を初めて行う方は、ステント設計に不可欠なCADおよびFEA手順の複雑さに苦労することがあり、また、細胞培養も初心者には困難な場合があります。厳格な無菌環境を維持することが極めて重要であるため、我々はステントの治癒能力を向上させることを目的とし、磁力を用いて生細胞をステントに付着させるというアイデアを考案しました。クリンピングおよび拡張時の材料挙動の複雑さや、ステントへの磁気的な細胞捕捉という手法の新規性から、ステントの開発および細胞定着のステップを習得することは困難であるため、本手法を視覚的に提示することが不可欠です。

まず、CADソフトウェアを使用して、壁厚をステントストラットの厚さと等しく設定した押し出しボスベース機能を選択し、押し出し中空シリンダーを作成します。押し出しシリンダーに接する別のスケッチ平面上に、ステントパターンを設計します。展開パターンの幅を、押し出し中空シリンダーの円周と一致させてください。

ラップ機能を使用して、展開図のデザインを中空シリンダーに転写します。パーツをネイティブ形式およびFEA用にエクスポートするためのACEs形式で保存します。有限要素解析を行うには、ACEs形式で保存したソリッドジオメトリをFEAソフトウェアのパーツモジュールにインポートし、ソフトウェアのパーツモデラーでさらに解析を行います。ステントと同軸に2つの解析用シリンダーをモデル化します。アセンブリモデラーのインスタンスツリー項目をダブルクリックし、FEAソフトウェアのメッシュモジュールを用いて、パーツを相対位置にアセンブリします。

要素を、低減積分を用いた20節点六面体要素として指定します。モデルツリーのインタラクションプロパティ内で、要素サイズを指定し、ステントのメッシュを作成します。ステントと2つのシリンダーのそれぞれとの間に、摩擦のない剛体接触ペアを指定します。

2205ステンレス鋼のELAs opl応力-ひずみ挙動をステントモデルに割り当てます。境界条件を定義し、まず外筒を1 mmまで圧縮してクリンピングをシミュレートします。その後、外筒を取り除き、クリンピングされたステントの緩和をシミュレートします。

膨張をシミュレートするために内筒を3mmまで拡張し、最後に内筒を取り除いてステントのリコイルをシミュレートします。シミュレーションが完了したら、結果ファイルを開き、結果の後処理を行って主ひずみを検討します。材料の破断限界である20%未満の主ひずみを達成するように、ステントの設計を繰り返し改善します。

2205ステンレス鋼チューブを入手し、ドラフトチャンバー内で適切な保護具を着用して、本文のプロトコルに従いステントをカットします。電解研磨済みステントの表面を不動態化させるため、ステントを50%塩酸に10分間浸漬させ、続いて10%炭酸水素ナトリウムにさらに10分間浸漬させて酸洗い（アシッドピックリング）を完了させます。エタノール、次いで脱イオン水を用いてステントを洗浄します。その後、ステントのクリンピング試験を行うため、ステントと3つ折りバルーンを用意します。

ハンドヘルドクリンピングツールを用い、ハンドルを押し込んでステントをバルーン上にクリンピング（圧着）します。顕微鏡下でクリンピングされたステントを観察し、均一にクリンピングされているか、および破損の兆候がないかを確認した後、水を用いて3層バルーンを加圧し、ステントを設計径である3 mmまで拡張させます。強力なネオジム磁石を使用し、拡張したステントに微小な破断がないか、および均一に拡張しているかを検査します。

ステントの直径方向を磁力線に沿わせ、平らな面のいずれかにステントを固定して直径方向に磁化させます。あるいは、ステントの軸を磁力線に沿わせ、円筒面（側辺）に沿ってステントを固定し、軸方向に磁化させます。強力な磁石の近くにステントを約1分間保持してください。

磁化を行うため、ステントを個別にガラス製マンドレルに取り付け、次にそのガラス製マンドレルを磁気プローブ固定具の精密チャックに取り付けます。磁気プローブ固定具のX、Y、Zステージを用いて、表面に触れないように磁気マイクロセンサープローブをステントの近くに精密に配置します。ステントから十分離れた位置で磁気マイクロセンサーのベースライン値を測定し、その後、x、y、Zステージを使用してプローブを配置し、ステント表面の残留磁場を測定します。

本文のプロトコルに従ってブタ末梢血から内皮細胞出芽細胞（EOC）を誘導した後、T 75フラスコ内で細胞が約80%コンフルエントになるまで培養します。超常磁性酸化鉄ナノ粒子（pyon）を合成した後、細胞培養液中のEOCに200 micrograms per milliliterの濃度でpyonを添加します。37 degree Celsiusで16時間インキュベートします。

細胞培養液を静かに吸引し、フラスコに10 millilitersのPBSを加えます。その後、静かに揺らして吸引します。メーカーの指示に従って細胞を染色するため、10 millilitersの培養液にCM DAIなどの蛍光染料を5 micrograms per milliliter加え、37 degrees Celsiusで30分間インキュベートします。

前回と同様にPBSを用いて細胞を穏やかに洗浄し、次に0.25% trypsin EDTA溶液を加えて37 °Cで5分間インキュベートし、フラスコから細胞を剥離させます。細胞懸濁液を15 mLコニカルチューブに移します。PBSを加えて液量を調整し、500 ×gで5分間遠心分離して、上清を捨てた後に細胞をペレット化させます。

PBSを用いて、細胞を100万から200万 cells/mLの濃度で再懸濁します。in vitro細胞研究では、ガラスカバースリップの表面の直上にステントを保持するための簡単な固定具を設計・作製してください。電磁脱磁器を用いてステントを脱磁させるか、あるいは強力なネオジム磁石を用いてステントを直径方向または軸方向に磁化させます。PBSに懸濁させたspy on labeled e oocを、軸方向磁化、直径方向磁化、または非磁化コントロールステントが入ったディッシュにピペットで分注します。

次に、倒立蛍光顕微鏡画像を用いて、PBSに懸濁させたEOCを含むステントを準備します。抗血小板薬を投与し、本文のプロトコルに従って麻酔をかけた4頭の健康なヨークシャー種豚に対し、標準的な心臓カテーテル法を用いて、磁化ステント1本と非磁化ステント1本を右冠状動脈（RCA）に留置します。ガイドワイヤーを使用してオーバーザワイヤーバルーンでバルーンとステントを前進させた後、留置したステントの近位側でRCA内の血流を遮断します。その後、2分間かけて、s-scionsで標識し4 mLのPBSに懸濁させた約200万個の自家EOCを中央カテーテル経由で注入します。さらに2分間の遮断時間を経た後、RCAの血流を再開させ、ステントを回収して組織学的解析を行います。ここに示す本文のプロトコルによれば、FEAに基づく反復的なステント設計により、主ひずみが20%でクリンプおよび拡張可能なステントが導き出されました。これは、究極ひずみの30%を下回る値です。

レーザーカットおよび電解研磨を施し、トリフルバルーンカテーテルでクリンプした後、トリフルバルーンを用いて3 mmまで拡張させたステントに、破断の兆候は見られなかった。変形したステントの画像はFEAで算出された変形と良好に一致しており、また顕微鏡写真においても、残留磁場測定の結果から予想された通り破断は認められなかった。標識された細胞のSPYは、軸方向に磁化したステントにおいては優先的にベンセグメントに引き寄せられ、直線セグメントにはより均一に引き寄せられた。

直径方向に磁化されたステントにおいて、組織学的画像ではステントストラット付近に鉄染色が認められ、7日間の植え込み期間中にEOCがステントに誘引され、保持されたことが確認されました。この手順を試みる際は、不適切な入力パラメータを用いた場合のFEAおよびCADの概念を理解することが重要です。パラメータが不適切であると、剛性が高すぎるか、あるいはステント破断の傾向があるといった、誤ったステント設計となってしまいます。

この手順に従ってください。ステントの長期的な耐久性と生体適合性はどのようなものであるか、といった追加の疑問に答えるために、加速疲労試験や毒性試験などの他の手法を実施することも可能です。数年にわたる開発を経て、現在、豚モデルで検証された機能的な技術が確立されています。

このビデオを視聴することで、強磁性ステントの開発方法、および磁気ラベル化された動脈細胞の捕捉と保持の試験方法について十分に理解することができます。