細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

以下の一連の実験の全体的な目的は、P melaninの産生および酸化ストレスへの感受性に対するNTBCの影響を明らかにするとともに、抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）を決定することです。まず、細菌培養液にNTBCを添加し、p melaninの産生を減少させる濃度を決定します。次に、細菌培養液をNTBCおよび抗生物質で処理し、NTBC処理が抗生物質のMICに影響を与えるかどうかを確認します。

NTPC処理後の培養物を過酸化水素に曝露させ、酸化ストレスへの感受性を判定します。NTPC処理の結果、生殖細菌をNTPCで処理すると、色素産生が減少し、酸化ストレスへの感受性が高まることが、酸化ストレス応答スポットプレートおよびマイクロタイターMICアッセイによってそれぞれ示されました。生存菌数計測やディスク拡散法などの既存の方法に対する酸化ストレススポットプレート法の主な利点は、他のアッセイで使用される高濃度の過酸化水素ではなく、より低濃度の過酸化水素を使用できる点にあります。一般的に、当研究室の抗生物質MIC判定法に不慣れな方は、ピペッティング技術の精度不足によって反復試行間にばらつきが生じ、困難に直面することがあります。

この変動性により、抗菌薬のMICを正確に決定することが困難になる場合があります。MIC測定の1日前に、テストする菌株のLB培地（添加ありおよびなし）での培養を準備します。

2,4-ジニトロ-2,4-トリエチルベンゾイルシクロヘキサン-1,3-ジオン（NTBC）。本デモンストレーションでは、代表的な濃度として300 µMのNTBCを使用します。適切なNTBC濃度を決定するためのタイトレーション方法はプロトコルの本文に記載されています。培養物を37 °Cでエアレーションしながら一晩インキュベートし、翌日に操作を行います。

MICアッセイ用に、LB＋NTBCおよびLB＋DMSOのマスター溶液を調製します。1株につき1種類の抗生物質をテストするため、2 mLのLBに600 µMのNTBCを加え、混合します。NTBCマスター溶液の調製において、NTBCを600 µMの濃度で添加するのは、接種物を加えた際に2倍に希釈されるためです。

最終濃度が300 micromolarとなるように、2 mLのLBに同量の溶媒であるDMSOを加え、混合してNO NTBCマスター溶液を作製します。これら2つのマスター溶液は、抗生物質ストック溶液の調製および96ウェルプレートでの希釈系列の設定に使用します。次に、LB+NTBCまたはLB+DMSOマスター溶液を用いて、抗生物質溶液を調製します。

Gentamycin（± NTBC）ストック溶液を64 µg/mLで調製します。KANAMYCIN（± NTBC）ストック溶液を256 µg/mLで調製します。tobramycin（± NTB）ストック溶液を8 µg/mLで調製します。

2倍濃度の抗生物質溶液を調製した後、96ウェルプレートのA列の各ウェルに、各抗生物質溶液を100 µLずつ分注します。例えば、ジェンタマイシンを1〜4番、カナマイシンを5〜8番、トブラマイシンを9〜12番のウェルに分注します。次に、96ウェルプレートのB列からH列に、LB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液を50 µLずつ加えます。この際、1枚のプレートをLB + NTBC、もう1枚をLB + DMSOとします。マイクロピペットを用いて、A列からB列に溶液を50 µL移し、抗生物質の2倍連続希釈を行います。溶液を混合し、ピペットチップを交換した後、B列からC列に溶液を50 µL移します。G列の希釈まで、残りの列でこの操作を繰り返します。最後に、その列から50 µLの溶液を取り除き、廃棄します。

細菌増殖の抗生物質なしコントロールとしてH行を使用します。培地中に存在するラニンを除去するためにすべての培養液を洗浄した後、オーバーナイト培養物を回収します。培養液のOD 600を測定し、マルチチャンネルマイクロピペットを用いてLB培地でオーバーナイト培養物を希釈します。

希釈した細菌培養液を適切なウェルに50 µLずつ加えます。各菌株および抗生物質濃度につき3つのウェルに細菌を加えます。細菌汚染のコントロールとして、4番目のウェルにLBを50 µL加えます。

96ウェルプレートをパラフィルムで密閉し、翌日まで37°Cで約24時間インキュベートします。プレートを目視で確認し、ウェル内の細菌の増殖を調べます。MICは、各菌株の3つの反復試料すべてにおいて細菌の増殖が認められない最小の抗菌薬濃度です。

この手順を開始するために、以前に示したように、NTBCを含むおよび含まないLB培地で、テストする菌株のオーバーナイト培養を行います。翌日、酸化ストレス剤として過酸化水素を含むLB APLを調製します。まず、LBアグロフラスコを融解し、室温で培地を約50 degrees Celsiusまで冷却します。

次に、冷却した培地に過酸化水素を目的の濃度で直接添加します。フラスコを回旋させ、0から1 mMまでの範囲の過酸化水素濃度になるように混合します。開始点としてはミリモル濃度が適切です。

すぐにプレートに分注し、表面を火炎滅菌して気泡を除去します。LBアガールの100 millilitersあたり4枚のプレートが得られます。プレートに過酸化水素濃度を記入します。

プレートの蓋を開けた状態で、ファンを回したバイオハザード対策用クリーンベンチ内に30分間置き、プレートから過剰な水分を取り除きます。プレートは当日中に使用してください。プレートの乾燥待機時間を利用して、洗浄および測定を行います。

オーバーナイト培養液のOD 600を、テストする菌株セットの中で最も低いOD 600の値に揃えます。これを行うには、全量1 mLで最も低いOD 600まで希釈するために必要な培養液量を算出します。例えば、ある培養液のOD 600が3であり、菌株セットの中の最低OD 600が2.5である場合、以下の計算を行います。その結果、必要な培養液量は0.833 mLとなるため、0.833 mLの培養液をマイクロ遠心チューブに入れます。

次に、培養液の総量を1ミリリットルにするために必要なLB+NTBCまたはLB+DMSOの量を算出します。この例では、その量は0.167ミリリットルになります。ボルテックスで混合し、NTBCまたはDMSOの濃度を一定に保ったまま培養します。規格化された overnight 培養液をPBS+NTBCまたはPBS+DMSOで10倍段階希釈します。テストする菌株数に応じて、PBS+NTBCおよびPBS+DMSOのストック溶液を調製します。1菌株あたりの1セットの希釈について、300 µMのNTBCまたは同量のDMSOをPBSと混合し、総量を720 µLにします。10⁻¹から10⁻⁷までの段階希釈用にラベルを貼った適切なマイクロ遠心チューブに、PBS+NTBCまたはPBS+DMSOを90 µLずつ加えます。

培養液10 µLを適切な10⁻¹希釈管に加え、ボルテックスで混合し、その10⁻¹希釈液10 µLを10⁻²希釈管に移します。希釈のたびにピペットチップを交換し、すべての希釈が完了するまでこれを繰り返します。10⁻³から10⁻⁷までの希釈液を5 µLずつ、過酸化水素添加LVプレートに2連でスポットします。

各菌株につき、ピペットチップを1本使用します。最も希釈されたものから順にスポットして播種する場合、液体がプレートに完全に乾燥するまで、プレートを傾けたり傾斜させたりしないでください。菌株に応じて、プレートを37°Cで24～48時間インキュベートします。

十分な大きさのコロニーが出現したら、トランスイルミネーター上のCCDカメラを用いてプレートを撮影します。NTBC滴定により、NTBCがp aerogenにおけるp melanin産生を抑制できるかを確認し、本手法で示す追加のアッセイに使用するために、p melanin産生を消失または抑制させるNTBC濃度を特定しました。NTBCはp melanin産生株においてPY melanin産生を用量依存的に抑制しましたが、p melaninを産生しない株の色素産生には影響を与えませんでした。

この表は、NTBC処理の有無および各種抗菌薬を用いて、異なる P. aerogen 菌株について測定したMICアッセイの結果を示しています。MICは、細菌の増殖を抑制した最小の抗菌薬濃度として記録されました。テストした菌株において、NTBC処理は抗菌薬のMICに影響を与えませんでした。また、NTBC処理の有無で、メラニン産生株および非産生株の酸化ストレス応答に関するスポットプレートアッセイを実施しました。

0 mM 過酸化水素プレートにより、すべての菌株が適切に希釈されていることが示されました。また、PIOメラニン産生菌をNTBCで処理した際に、酸化ストレスへの感受性の増大が観察されました。PIOメラニンを産生しない菌株は、PIOメラニンを産生する菌株よりも酸化ストレスに対して高い感受性を示しました。このビデオを視聴することで、酸化ストレスへの感受性および抗生物質のMIC（最小発育阻止濃度）を測定し、NTBC処理がPIOメラニン産生に及ぼす影響を決定する方法について十分に理解できるはずです。