Name: 細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 学ぶ細菌のピオメラニン産生阻害と酸化ストレス感受性の評価法。NTBC処理による色素減少と過酸化水素感受性増加を測定し、抗菌薬MICへの影響を解析する技術を習得できます。

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著者は、ダラ・フランクとキャリー・ハーウッドの寛大な貢献に感謝します。ウィスコンシン大学ミルウォーキー研究財団は特許番号8,354,451を保有しています。2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)などの4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ阻害化合物を投与することにより、患者における微生物の感染の進行を治療または阻害することを広く目的とするクレーム。発明者はグラハム・モランとパン・ヘです。本研究は、国立衛生研究所(R00-GM083147)の支援を受けて行われました。University of Washington P. aeruginosa トランスポゾン変異体ライブラリは、NIH P30 DK089507によってサポートされています。

培養培地、抗生物質の調製、及び2- [2-ニトロ-4-（トリフルオロメチル）ベンゾイル] -1,3-シクロヘキサンジオン（NTBC） <ol><li>適切なボリュームにLBブロス（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、H 2 O中 0.25％のNaCl）、アリコートを行います。オートクレーブにより滅菌します。室温で保管してください。 </li><li> 250 mlのフラスコに100 mlのLB寒天培地（1％トリプトン、0.5％酵母エキス、0.25％のNaCl、H 2 O中の1.5％寒天）を作ります。室温でオートクレーブとストアによって滅菌します。寒天プレートに注ぐ前に溶けていることを確認します。 注：LB寒天100mlを含有するフラスコを4板が得られます。 LB寒天培地の量は、アッセイに必要なプレートの数に対応するように変更することができます。 </li><li> PBS（137mMの塩化ナトリウム、2.7のKCl、10mMのの Na 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4）16ください。室温でオートクレーブまたは濾過し、ストアによって滅菌します。 </li><li>ゲンタマイシンのための抗生物質のストック溶液を準備し、カナマイシン、Dトブラマイシン。 <ol><li> Pの適切な抗生物質ストック濃度を準備100 mg / mlのゲンタマイシン、30 mg / mlのカナマイシン、および10mg / mlのトブラマイシンを含む緑膿菌菌株 。 4℃の水、フィルター滅菌し（0.2ミクロン）、および店舗での抗生物質を溶解します。研究細菌に応じて抗生物質および濃度を変更します。 </li></ol></li><li> NTBCストック溶液を準備します。 DMSOの400μlのNTBC 10mgを溶解します。これは、75.9 mMのNTBCの濃度が得られます。 -20℃で保存NTBC原液。必要に応じて室温でソリューションを解凍します。 注：NTBCの異なるソースは、溶解度の差があります。メーカーの推奨に基づいて、NTBCを溶解し、それに応じてステップ1.5を調整するためにする適切な車両を決定します。 </li></ol>細菌株の2 NTBC滴定<ol><li>テストされる株の一晩培養を設定します。 16×150 mmの試験管に2 mlのLBブロスを加えますS（1株あたり1）と、各株から1に単離したコロニーを接種します。空気インキュベーター中で組織培養回転子に通気しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li><li>次の日は、LBブロス中でNTBCの滴定を準備します。異なる株がNTBCに対する感受性の違いを持っ​​ているので、0から900μMNTBCの初期範囲を使用してください。 <ol><li> 1株あたり4〜5本の試験管（16×150ミリメートル）に1ミリリットルのLBブロスを追加します。 </li><li>濃度の範囲内で試験管（16×150ミリメートル）にNTBC原液（75.9 mm）を追加します。 LBブロスの1mlに追加するには、NTBCの濃度とそれに対応する株式ボリュームについては、表1を参照してください。 </li></ol></li><li>一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelanin排除するためにOD 600読み取りを行う前に、文化を洗ってください。 <ol><li> 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。上清を除去し、持つ任意の緩くペレット化した細胞ピペットとは、1ミリリットルのLB固体細胞ペレットを再懸濁</li></ol></li><li> OD 600 0.05で滴定チューブを接種します。チューブに接種するために必要な洗浄文化の量を計算します。 注：pyomelaninが存在してはならないので、予防接種のための洗浄の文化を使用してください。 </li><li>空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で約24時間滴定チューブをインキュベートします。 </li><li>滴定チューブを撮影し、MICおよび酸化ストレスアッセイのために使用するNTBCの量を決定するために、内および系統間で色素産生を比較します。無細胞培養上清中pyomelaninの量を決定し、細胞密度を決定するために、OD 600測定値を使用します。 注：細胞の培養上清中のpyomelaninのOD 600比は、NTBCで処理した後pyomelanin生産の違いを定量化するために計算することができます。 </li></ol> 3.抗生物質の最小Inhibi96ウェルプレートでトリー濃度（MIC）アッセイ<ol><li>し、NTBCないLBにテストされる株の一晩培養を設定します。 注：このプロトコルは、300μMのNTBCの代表レベルを用いて説明します。使用されるNTBCの適切なレベルは、ステップ2.6で決定されます。 <ol><li> 2ミリリットルのLBに300μMのNTBCを追加無NTBC条件の2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の同等のボリュームを追加します。 </li><li>滅菌爪楊枝を使用して、細菌のつの単離されたコロニーをチューブに接種。 NTBCと1つの培養し、各株についてNTBCせずに1つの培養があります。空気インキュベーター中で組織培養回転子を用いて通気しながら37℃で一晩インキュベートします。 </li></ol></li><li>次の日、MICアッセイを設定するためのLB + NTBCし、LB + DMSOマスターソリューションを作ります。接種物は、300μMの最終濃度を得、追加されたときに、これは2倍に希釈されるように、600μMの濃度でNTBCを追加します。 <ol><li> 1 antibiをテストするには1株について、耳、2ミリリットルのLBに600μMのNTBCを追加し、NTBCマスター溶液を作製するために混ぜます。 2ミリリットルのLBにビヒクル（DMSO）の等量を追加し、何のNTBCマスター溶液を作成しないように混ぜます。抗生物質の原液を作成するだけでなく、96ウェルプレート中の希釈系列を設定するため、これらのソリューションを使用してください。 注：マスター溶液製剤は、ピペッティングの誤差を考慮して余分な溶液が得られます。試験した抗生物質および株の数に応じて必要に応じてマスターソリューションは拡大または縮小することができます。 </li></ol></li><li> LB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションの抗生物質溶液を調製します。 注：これらの溶液中の抗生物質濃度は、二重の最終的な所望の濃度にする必要があります。十分な溶液を、96ウェルプレートの4ウェルに100μlのを転送するようになされるべきです。 <ol><li> 64μgの/ mlのゲンタマイシン+/- NTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450にゲンタマイシン株式（100 mg / mlの）の0.288μlを添加しますμlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューション。 注：Pのゲンタマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、32μgの/ mlです。 </li><li>カナマイシン+/- 256 / mlのでNTBC原液を作ります。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにカナマイシンストック（30 mg / mlの）の3.84μlを添加します。 注：Pのカナマイシンの最大濃度緑膿菌 PAO1は、128μgの/ mlです。 </li><li>トブラマイシン+/- 8 / mlのでNTBC原液を準備します。この溶液を作製するために、450μlのLB + NTBCまたはLB + DMSOマスターソリューションにトブラマイシンストック（10mg / ml）の0.36μlを添加します。 注：Pの緑膿菌 PAO1、トブラマイシンの最大濃度は、4 / mlのです。 注：細菌を試験するために、抗生物質との濃度を調整することができます。 </li></ol></li><li> 96ウェルプレートの4つのウェルにそれぞれ2倍の抗生物質溶液100μlを追加します。 examplの行Aにこれらのソリューションを配置しますeは、ゲンタマイシンがA4を通じてA1に配置する必要があり、カナマイシンはA8を通じてA5に配置する必要があり、およびトブラマイシンはA12を通じてA9に配置する必要があります。セットアップ、96ウェルプレートの図については、図1Aを参照してください。 注：複数の抗生物質は、一枚のプレートで試験することができるが、唯一の1株は他の株からの交差汚染の可能性を排除するために、プレートごとにテストする必要があります。 </li><li> 96ウェルプレートのHを通じて行BにLB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液50μlを追加します。一方のプレートは、LB + NTBCであることを確認し、一方のプレートは、LB + DMSOです。 図1Aを参照してください。 <ol><li> LB + NTBCにおける抗生物質のためのLB + NTBCを使用してください。 LB + DMSO中の抗生物質のためのLB + DMSOを使用してください。 </li></ol></li><li>マイクロピペットを使用すると、ピペットチップを変更、Bのミックスにソリューションを行ごとにAから溶液50μlを転送することにより、抗生物質の2倍連続希釈を行い、のためのC.繰り返しを行ごとにBから溶液50μlを転送remainingの行。行Gを希釈した後、その行から溶液50μlを除去し、廃棄します。細菌の増殖のための抗生物質のないコントロールとしてH列を使用してください。 図1Bを参照してください 。 注：Gを通じて行Aの各ウェルは現在の2倍でLB + NTBCまたはLB + DMSO中の抗生物質、50μlの最終的な所望の濃度が含まれています。 H列は、抗生物質なしでLB + NTBCまたはLB + DMSOが含まれています。 </li><li>一晩培養物のOD 600を測定します。培地中に存在pyomelaninを排除するためにOD 600読み取りを行う前に、すべての文化を洗ってください。 <ol><li> 2分間16,000×gで微量に1mlの培養物を遠心分離することによって培養液を洗います。ピペットで上清を除去し、1mlのLBに細胞ペレットを再懸濁</li></ol></li><li> LBの中で2.75x10 5 CFU / mlに一晩培養を希釈 注：1 OD 600ユニットは、Pの 1×10 9 CFU / mlと同等であると仮定緑膿菌 。 CFU / mlの変換へのODは、Dすることができます他の細菌でifferent。 </li><li>適切なウェルに希釈した細菌培養物の50μlのを追加します。 注：NTBCで増殖させた培養物は、DMSO中で増殖させ、培養物NTBCを含むウェルに添加されるべきではDMSOを含有するウェルに添加されるべきです。 図1Bを参照してください 。 <ol><li>各菌株と抗生物質濃度のための3つのウェルに細菌を追加します。細菌汚染のための対照として機能する第四ウェルにLB50μlのを追加します。 図1Bを参照してください 。 </li><li>井戸を接種するために、マルチチャンネルピペットを使用してください。近隣の井戸の汚染を防止するために、接種材料を追加する際にピペットチップは、ウェルの底近くにあることを確認してください。 注：ウェルに細菌培養を追加すると、抗生物質とNTBC濃度2倍に希釈します。 </li></ol></li><li>パラフィルムを有する96ウェルプレートを覆い、37℃で約24時間インキュベートします。空気インキュベーター中、静的96ウェルプレートをインキュベートします。 </li><li>調べウェル中の細菌増殖のためのプレート。 MICには、細菌の増殖を、各株のすべての3つの複製のために見ていないされている抗生物質の最低濃度です。 <ol><li>視覚的な成長のためにプレートを調べたり、OD 600に設定し、プレートリーダーを用いて読み取ります。 </li></ol></li></ol>酸化ストレス応答4.スポットプレートアッセイ<ol><li>ステップ3.1で説明したようにNTBCとないLB中でテストされる株の一晩培養を設定します。 </li><li>翌日、酸化的ストレッサーとしてH 2 O 2を含有する LB寒天プレートを調製します。 0〜1 mMのからのH 2 O 2濃度の範囲は、良い出発点です。 <ol><li> LB寒天フラスコを溶かします。室温で約50℃に冷却するメディア。 </li><li>所望の濃度の冷却媒体に直接H 2 O 2 を追加します 。スワールフラスコを混合します。 H 2 O 2の濃度は 、表2を参照そして濃縮し、H 2 O 2のボリュームが追加されます。これらの値は、LB寒天100mlのに基づいています。 </li><li>すぐにH 2 O 2を添加した後 、プレートを注ぎ、気泡を除去するために表面を火炎。収率はLB寒天の100ミリリットル当たり4板です。マーク・H 2 O 2濃度でプレート。 </li><li>プレートから余分な水分を除去するために、30分間実行しているファンとの生物学的な流フードで明らかになったプレートを置きます。 注：プレート、それらが用意されている同じ日に使用します。そうしないと、一貫性のないデータになることがあります。 注：例えば、パラコートなどの酸化ストレスは、このアッセイにおけるH 2 O 2の代わりに用いることができます。他の酸化ストレスのために使用される濃度は、H 2 O 2のために使用されるものと異なってもよいです。 </li></ol></li><li>洗浄ステップ3.7で説明したように一晩培養のOD 600を測定します 。 </li><li>すべて一晩のcuのOD 600を正規化テストされている株のセットの最低値にltures。P.緑膿菌は、一般的に 、LB + NTBCまたはLB + DMSO中で一晩増殖させ、約2.5のOD 600を持っています。 <ol><li> 1ミリリットルの全容量で最低のOD 600に文化を希釈するために必要な培養物の容量を決定します。例えば、培養物がOD 3の600を有しており、株のセットのための最小のOD 600が 2.5であり、次の計算実行する場合：（2.5）（1ミリリットル）=（3）（X）。 X = 0.833ミリリットル。文化の0.833ミリリットルをマイクロチューブ内に配置されます。 </li><li> 1mlに培養容量をもたらすために必要なLB + NTBC（300μM）またはLB + DMSOの量を計算します。ステップ4.4.1の例では、LB + NTBCまたはLB + DMSOの量は0.167ミリリットル（ - 0.833ミリリットル文化1ミリリットル総容量）になる培養液に添加。 LB + NTBCし、LB + DMSOのストック溶液は、すべての株を希釈するために必要な量に基づいて、これらの希釈液に使用するようにしてください。 </li><li>文化とLB + Nを混ぜますボルテックスによってTBCまたはLB + DMSO。 </li></ol></li><li> NTBCまたはDMSOの一定濃度で培養を維持するために、PBS + NTBCまたはPBS + DMSO中の正規化された一晩培養の10倍連続希釈を行います。 <ol><li> PBS + NTBCし、PBS + DMSOのストック溶液を作ります。 1株についての希釈液の1セットでは、720μLの総容量を得るために、PBSで300μMのNTBCまたはDMSOの等量を混ぜます。テストされてどのように多くの株に応じて上下にこれらの株式をスケール。 </li><li> 10 -7の連続希釈10〜-1のラベルマイクロチューブ。適切なチューブにPBS + NTBCまたはPBS + DMSO90μlのを追加します。 LB + NTBCで成長した株について、PBS + NTBCを使用し、LB + DMSO中で成長した株をPBS + DMSOを使用しています。 </li><li>適切な10 -1希釈チューブに文化の10μlのを追加します。ボルテックスで混合し、10 -2希釈チューブに10 -1希釈液10μlを移します。すべての希釈はperfoされるまで繰り返しますrmed。希釈液の間にピペットチップを変更します。 </li></ol></li><li>各株の重複でLB + H 2 O 2のプレートに10 -7希釈液を10〜-3のスポット5μlの。スポットがメッキされている場合は、ほとんどが少なくとも希（10 -7〜10 -3）に希釈から1ピペットチップを使用してください。液体がプレートに乾燥するまでプレートを傾けたり、傾けたりしないでください。 </li><li>歪みに応じて、37℃（空気インキュベーター）で24〜48時間、プレートをインキュベートします。 注：P。緑膿菌 PAO1は、インキュベーションの24時間後に、LBの良いサイズのコロニーを持つことになります。それらがコロニーをPAO1とほぼ同じ大きさになるまで株を培養します。 </li><li> transluminator上にCCDカメラを用いてプレートを撮影。必要に応じて、同じサイズとは対照的と作物のために写真を編集します。酸化ストレスに対する感受性の変化を決定するために各スポットにコロニー数をカウントします。 </li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルに記載されているNTBC滴定法により、ユーザーは、NTBCが細菌におけるピオメラニン産生を減少または排除できるかどうかを判断し、必要なNTBCの濃度を決定することができます。NTBC 滴定アッセイの最も重要なステップは、アッセイで使用する NTBC 濃度の範囲を決定することです。緑 膿菌 の異なる株はNTBCに対する感受性が異なり、実験室の株は臨床分離株よりもNTBCに対してより敏感である可能性があります12 (図2)。したがって、分析される株ごとにNTBC濃度の範囲をテストする必要があります。ユーザーは、特定の株でピオメラニン産生を阻害するNTBCの最低濃度を決定する可能性が高いため、低濃度から始めて、必要に応じて高濃度に増やすことをお勧めします。私たちの滴定アッセイは、色素生成の阻害を決定するための定性的方法を説明しています。研究の目的によっては、ピオメラニンレベルを決定する必要があるかもしれません。これは、HPLC3 または電子常磁性共鳴(EPR)分光法19によって達成でき、サンプル中のパイオメラニン...

緑膿菌はグラム陰性菌で、酸化ストレス1-4からの保護を助け、アミノグリコシド系抗生物質5-7を含むさまざまな化合物に結合する赤茶色の色素であるピオメラニンを含む様々な色素を生成します。ピオメラニン産生は、ホモゲンチゼート1,2-ジオキシゲナーゼ(HmgA)1,9をコードする遺伝子の欠失または突然変異、または経路10のさまざまな酵素の不均衡のいずれかを介して、チロシン異化経路4,8の欠陥によって引き起こされます。ホモジェンチゼートはHmgAの不活性化により蓄積し、分泌・酸化されてピオメラニン11を形成します。ピオメラニンの産生は、除草剤 2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン (NTBC)12 による治療を通じて、用量依存的に廃止または減少させることができます。これは、チロシン異化経路13 の 4-ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ (Hpd) を阻害します。Hpdはホモゲンタイゼートの形成に必要であり、したがってピオメラニン11の形成に必要です。
私たちは、緑膿菌のピオメラニン産生株のNTBC治療の研究において重要だった3つの技術を詳細に説明しています。これらの技術には、実験室および臨床のピオメラニン産生株におけるピオメラニン産生を廃止または減少させる濃度を決定するためのNTBCの滴定、細菌をNTBCで処理した場合の抗生物質の最小阻害濃度(MIC)の決定、およびNTBC治療による酸化ストレスに対する感受性が含まれます。
私たちが開発した滴定アッセイは、2つの目的を果たします。まず、このアッセイにより、NTBCが研究対象の細菌中のピオメラニン産生を廃止または減少させることができるかどうか、およびどの濃度で行うことができるかを判断できます。これにより、P. aeruginosa12で観察されるように、細菌の異なる株がこの化合物に対して異なる感受性を持つ可能性があるため、ユーザーはNTBCに対する感受性を判断できます。次に、NTBC滴定アッセイにより、ピオメラニン産生を廃止または減少させ、色素還元の効果を判断することが目標である場合、ユーザーは、抗生物質MICや酸化ストレス応答アッセイなどの後続のアッセイで使用するNTBCの適切な濃度を決定できます。
滴定アッセイが機能するのは、NTBCで処理された株にピオメラニン産生の目に見える違いが見られ、ピオメラニン産生の違いは用量依存的であるためです12。さらに、この手法は、細菌の色素産生を排除または増強する可能性のある他の化合物の研究にも適用できます。
抗生物質のMICは、細菌の抗生物質に対する感受性を決定するために使用されます。MICを決定するには、寒天希釈プレートやブロス希釈14など、いくつかの方法があります。ブロスの希釈は、小さな試験管または96ウェルマイクロタイタープレートで行うことができます。本明細書に記載のMIC測定のマイクロタイタープレート法により、ユーザーは最小限のリソースを使用して広範囲の抗生物質を試験することができる。このアッセイは、この方法で試験する抗生物質および菌株の数の再現性と柔軟性を提供します。さらに、アッセイにNTBCを組み込むことで、ピオメラニン産生の排除または減少がピオメラニンを産生する細菌の抗生物質感受性を変化させるかどうかを判断できます。
酸化ストレスに対する細菌の反応は、いくつかの方法でテストすることができます。記載されている最も一般的な方法は、一定期間酸化ストレスにさらされた細菌の生存可能な数1、または酸化ストレスディスク拡散アッセイ15のいずれかである。これらの方法は、細菌の酸化ストレスの影響を調べるために高濃度の酸化ストレッサーを使用する傾向があり、結果は生物学的複製間でかなり異なる可能性があります。また、Viable Count Assayは、他の方法よりも多くの寒天プレートを使用する傾向があります。ここで説明するスポットプレートアッセイは、低濃度のH2O2を使用し、ユーザーは最小限のプレートを使用して複数の菌株の酸化ストレス応答を試験することができます。また、このアッセイは、技術的反復と生物学的反復間で一貫して再現性があります。ピオメラニンは酸化ストレスに対する耐性に関与しているため、アッセイにNTBCを組み込むことで、ピオメラニン産生の排除が酸化ストレス耐性に及ぼす影響を判断できます。

<table><tbody><tr><td>2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>SML0269-50mg</td><td>ニチシノンとも呼ばれます。&nbsp;DMSOに可溶です。</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-100ML</td><td>30 wt. % in H2O.&nbsp;安定 化。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ゴールドバイオ</td><td>G-400-100H</td><td>2Oに可溶。フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>カナマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP906-5</td><td>H2Oに可溶です。&nbsp;フィルター滅菌します。</td></tr><tr><td>トブラマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4014-100MG</td><td>H2Oに可溶です。フィルター滅菌します。</td></tr></tbody></table>

細菌pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress

ピオメラニンは、いくつかの細菌および真菌種によって生成される細胞外赤褐色の色素です。この色素はチロシン異化経路に由来し、酸化ストレス耐性の向上に貢献します。緑膿菌におけるピオメラニン産生は、2-[2-ニトロ-4-(トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1,3-シクロヘキサンジオン(NTBC)による治療を通じて用量依存的に減少します。細菌のピオメラニン産生を減少または廃止する薬物の濃度を決定するために、複数の濃度のNTBCを使用した滴定法について説明します。滴定法は、薬物濃度の増加に伴う顔料産生の目に見える減少という、容易に定量化できる結果をもたらします。また、細菌中の抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を測定するためのマイクロタイタープレート法についても説明します。この方法は最小限のリソースを使用し、簡単にスケールアップして、1つのマイクロタイタープレートで1つの細菌株に対して複数の抗生物質を試験することができます。MICアッセイは、特定の濃度での細菌増殖に対する非抗生物質化合物の影響をテストするように適合させることができます。最後に、H2O2を寒天プレートに組み込み、プレート上の細菌の複数の希釈点を見つけることにより、酸化ストレスに対する細菌の感受性を試験する方法について説明します。酸化ストレスに対する感受性は、H2O2を含まない対照と比較して、H 2 O 2を含有するプレート上の異なる希釈に対するコロニー数およびサイズの減少によって示される。酸化ストレススポットプレートアッセイは、最小限のリソースと低濃度のH2O2を使用します。重要なのは、再現性も良好であることです。このスポットプレートアッセイは、寒天プレートに化合物を組み込み、結果として生じる細菌の増殖を特徴付けることにより、さまざまな化合物に対する細菌の感受性をテストするように適合させることができます。

NTBC滴定 NTBCはP.でpyomelanin産生を減少させることができた場合にNTBC滴定を決定するために使用されました緑膿菌 、また、追加のアッセイにおける使用のためのpyomelanin生産性を排除または低減されるNTBCの濃度を特定します。そこ異なる複製で生産pyo​​melaninのレベルの変化であるが、一般的な傾向は一定のままであってもよいです。 NTBC滴定アッセイはまた、他の細菌に色素産生に影響を及ぼし得る他の化合物を試験するために変更することができます。視覚的に測定または定量することができる表現型の変化がある場合にのみ、しかし、動作します。 Pの pyomelanin産生株の治療NTBCと緑膿菌は、顔料製造12の用量依存性の減少をもたらした。 図2は 、Pの異なる株を示していますピョのレベルによって示されるように緑膿菌は 、NTBCに対する...

細菌のピオメラニン産生は、酸化ストレスと病原性に対する耐性の増加をもたらします。ピオメラニン産生の阻害を決定し、その結果生じる細菌の酸化ストレスに対する感受性の増加を分析するために使用できる技術について報告し、抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を決定します。

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism ...

以下の一連の実験の全体的な目的は、P melaninの産生および酸化ストレスへの感受性に対するNTBCの影響を明らかにするとともに、抗生物質の最小発育阻止濃度（MIC）を決定することです。まず、細菌培養液にNTBCを添加し、p melaninの産生を減少させる濃度を決定します。次に、細菌培養液をNTBCおよび抗生物質で処理し、NTBC処理が抗生物質のMICに影響を与えるかどうかを確認します。NTPC処理後の培養物を過酸化水素に曝露させ、酸化ストレスへの感受性を判定します。NTPC処理の結果、生殖細菌をNTPCで処理すると、色素産生が減少し、酸化ストレスへの感受性が高まることが、酸化ストレス応答スポットプレートおよびマイクロタイターMICアッセイによってそれぞれ示されました。生存菌数計測やディスク拡散法などの既存の方法に対する酸化ストレススポットプレート法の主な利点は、他のアッセイで使用される高濃度の過酸化水素ではなく、より低濃度の過酸化水素を使用できる点にあります。一般的に、当研究室の抗生物質MIC判定法に不慣れな方は、ピペッティング技術の精度不足によって反復試行間にばらつきが生じ、困難に直面することがあります。この変動性により、抗菌薬のMICを正確に決定することが困難になる場合があります。MIC測定の1日前に、テストする菌株のLB培地（添加ありおよびなし）での培養を準備します。2,4-ジニトロ-2,4-トリエチルベンゾイルシクロヘキサン-1,3-ジオン（NTBC）。本デモンストレーションでは、代表的な濃度として300 µMのNTBCを使用します。適切なNTBC濃度を決定するためのタイトレーション方法はプロトコルの本文に記載されています。培養物を37 °Cでエアレーションしながら一晩インキュベートし、翌日に操作を行います。MICアッセイ用に、LB＋NTBCおよびLB＋DMSOのマスター溶液を調製します。1株につき1種類の抗生物質をテストするため、2 mLのLBに600 µMのNTBCを加え、混合します。NTBCマスター溶液の調製において、NTBCを600 µMの濃度で添加するのは、接種物を加えた際に2倍に希釈されるためです。最終濃度が300 micromolarとなるように、2 mLのLBに同量の溶媒であるDMSOを加え、混合してNO NTBCマスター溶液を作製します。これら2つのマスター溶液は、抗生物質ストック溶液の調製および96ウェルプレートでの希釈系列の設定に使用します。次に、LB+NTBCまたはLB+DMSOマスター溶液を用いて、抗生物質溶液を調製します。Gentamycin（± NTBC）ストック溶液を64 µg/mLで調製します。KANAMYCIN（± NTBC）ストック溶液を256 µg/mLで調製します。tobramycin（± NTB）ストック溶液を8 µg/mLで調製します。2倍濃度の抗生物質溶液を調製した後、96ウェルプレートのA列の各ウェルに、各抗生物質溶液を100 µLずつ分注します。例えば、ジェンタマイシンを1〜4番、カナマイシンを5〜8番、トブラマイシンを9〜12番のウェルに分注します。次に、96ウェルプレートのB列からH列に、LB + NTBCまたはLB + DMSOマスター溶液を50 µLずつ加えます。この際、1枚のプレートをLB + NTBC、もう1枚をLB + DMSOとします。マイクロピペットを用いて、A列からB列に溶液を50 µL移し、抗生物質の2倍連続希釈を行います。溶液を混合し、ピペットチップを交換した後、B列からC列に溶液を50 µL移します。G列の希釈まで、残りの列でこの操作を繰り返します。最後に、その列から50 µLの溶液を取り除き、廃棄します。細菌増殖の抗生物質なしコントロールとしてH行を使用します。培地中に存在するラニンを除去するためにすべての培養液を洗浄した後、オーバーナイト培養物を回収します。培養液のOD 600を測定し、マルチチャンネルマイクロピペットを用いてLB培地でオーバーナイト培養物を希釈します。希釈した細菌培養液を適切なウェルに50 µLずつ加えます。各菌株および抗生物質濃度につき3つのウェルに細菌を加えます。細菌汚染のコントロールとして、4番目のウェルにLBを50 µL加えます。96ウェルプレートをパラフィルムで密閉し、翌日まで37°Cで約24時間インキュベートします。プレートを目視で確認し、ウェル内の細菌の増殖を調べます。MICは、各菌株の3つの反復試料すべてにおいて細菌の増殖が認められない最小の抗菌薬濃度です。この手順を開始するために、以前に示したように、NTBCを含むおよび含まないLB培地で、テストする菌株のオーバーナイト培養を行います。翌日、酸化ストレス剤として過酸化水素を含むLB APLを調製します。まず、LBアグロフラスコを融解し、室温で培地を約50 degrees Celsiusまで冷却します。次に、冷却した培地に過酸化水素を目的の濃度で直接添加します。フラスコを回旋させ、0から1 mMまでの範囲の過酸化水素濃度になるように混合します。開始点としてはミリモル濃度が適切です。すぐにプレートに分注し、表面を火炎滅菌して気泡を除去します。LBアガールの100 millilitersあたり4枚のプレートが得られます。プレートに過酸化水素濃度を記入します。プレートの蓋を開けた状態で、ファンを回したバイオハザード対策用クリーンベンチ内に30分間置き、プレートから過剰な水分を取り除きます。プレートは当日中に使用してください。プレートの乾燥待機時間を利用して、洗浄および測定を行います。オーバーナイト培養液のOD 600を、テストする菌株セットの中で最も低いOD 600の値に揃えます。これを行うには、全量1 mLで最も低いOD 600まで希釈するために必要な培養液量を算出します。例えば、ある培養液のOD 600が3であり、菌株セットの中の最低OD 600が2.5である場合、以下の計算を行います。その結果、必要な培養液量は0.833 mLとなるため、0.833 mLの培養液をマイクロ遠心チューブに入れます。次に、培養液の総量を1ミリリットルにするために必要なLB+NTBCまたはLB+DMSOの量を算出します。この例では、その量は0.167ミリリットルになります。ボルテックスで混合し、NTBCまたはDMSOの濃度を一定に保ったまま培養します。規格化された overnight 培養液をPBS+NTBCまたはPBS+DMSOで10倍段階希釈します。テストする菌株数に応じて、PBS+NTBCおよびPBS+DMSOのストック溶液を調製します。1菌株あたりの1セットの希釈について、300 µMのNTBCまたは同量のDMSOをPBSと混合し、総量を720 µLにします。10⁻¹から10⁻⁷までの段階希釈用にラベルを貼った適切なマイクロ遠心チューブに、PBS+NTBCまたはPBS+DMSOを90 µLずつ加えます。培養液10 µLを適切な10⁻¹希釈管に加え、ボルテックスで混合し、その10⁻¹希釈液10 µLを10⁻²希釈管に移します。希釈のたびにピペットチップを交換し、すべての希釈が完了するまでこれを繰り返します。10⁻³から10⁻⁷までの希釈液を5 µLずつ、過酸化水素添加LVプレートに2連でスポットします。各菌株につき、ピペットチップを1本使用します。最も希釈されたものから順にスポットして播種する場合、液体がプレートに完全に乾燥するまで、プレートを傾けたり傾斜させたりしないでください。菌株に応じて、プレートを37°Cで24～48時間インキュベートします。十分な大きさのコロニーが出現したら、トランスイルミネーター上のCCDカメラを用いてプレートを撮影します。NTBC滴定により、NTBCがp aerogenにおけるp melanin産生を抑制できるかを確認し、本手法で示す追加のアッセイに使用するために、p melanin産生を消失または抑制させるNTBC濃度を特定しました。NTBCはp melanin産生株においてPY melanin産生を用量依存的に抑制しましたが、p melaninを産生しない株の色素産生には影響を与えませんでした。この表は、NTBC処理の有無および各種抗菌薬を用いて、異なる P. aerogen 菌株について測定したMICアッセイの結果を示しています。MICは、細菌の増殖を抑制した最小の抗菌薬濃度として記録されました。テストした菌株において、NTBC処理は抗菌薬のMICに影響を与えませんでした。また、NTBC処理の有無で、メラニン産生株および非産生株の酸化ストレス応答に関するスポットプレートアッセイを実施しました。0 mM 過酸化水素プレートにより、すべての菌株が適切に希釈されていることが示されました。また、PIOメラニン産生菌をNTBCで処理した際に、酸化ストレスへの感受性の増大が観察されました。PIOメラニンを産生しない菌株は、PIOメラニンを産生する菌株よりも酸化ストレスに対して高い感受性を示しました。このビデオを視聴することで、酸化ストレスへの感受性および抗生物質のMIC（最小発育阻止濃度）を測定し、NTBC処理がPIOメラニン産生に及ぼす影響を決定する方法について十分に理解できるはずです。

methods-to-inhibit-bacterial-pyomelanin-production-determine

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

このビデオでは、細菌株の酸化ストレス応答を評価するために調整されたスポットプレートアッセイを示しています。一部の菌株は、抗酸化色素であるピオメラニンを生成します。逆に、試験剤で処理した株は、ピオメラニン産生の減少につながりますが、酸化ストレスに対する感受性が高く、ピオメラニン産生株と比較して細胞生存率が低下します。...

細菌株の酸化ストレス応答を評価するためのスポットプレートアッセイ

このビデオは、細菌に対する試験用抗生物質の最小阻害濃度(MIC)を決定するためのマイクロタイタープレートベースの方法を示しています。細菌性病原体Pseudomonas...

抗生物質の最小阻害濃度を評価するためのマイクロタイタープレート法

本稿では、異物による酸化ストレスの検討のため住セルイメージ投射の遺伝子にコードされた蛍光レポーターの使用について説明します。この実験的アプローチでは、毒性学的酸化ストレス検査に用いられる従来の欠点の多くを回避しながら比類のない時空間分解能、感度、特異性を提供しています。...

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このプロトコルの目標はオンカラム細胞外の電子受容体を用いたトランス...

C2C12 細胞によるトランス プラズマ膜電子輸送特性の測定

化学物質の in vitro の色素脱失活性を評価するための 3 つの実験的方法を述べる: 1) 細胞のチロシナーゼ活性および 2) メラニン コンテンツ、および 3)...

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このプロトコルの目的は、マウスの皮膚で非致死レベルの活性酸素種(ROS)の一時的なin...

切り替え可能なプロトポルフィリンIX依存性活性酸素種のin situ光生成によるマウス皮膚における幹細胞ニッチの刺激と組織再生

このプロトコルは、細胞内の細胞内区画特異的な酸化還元状態の評価を記述する。レドックス感受性蛍光プローブは、無傷の細胞でのレシオメトリック分析を可能にします。...

細胞内膜特異的レドックス感受性緑色蛍光タンパク質を用いた細胞酸化の評価

網膜色素上皮細胞をH2O2で処理し、細胞の形態、生存率、密度、グルタチオン、UCP-2レベルを解析することにより、酸化ストレスモデルの開発と使用に関するプロトコルを提示します。これは、トランスポゾントランスフェクション細胞によって分泌されるタンパク質の抗酸化効果を調べて神経レチンの変性を治療するのに有用なモデルです。...

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

ここでは、フラビンモノヌクレオチド(FMN)の光分解時に生成される活性酸素種を低強度の青色および紫色光照射下で不活化する病原菌を不活化するプロトコルを提示する。FMN光分解は、衛生プロセスのための簡単で安全な方法であることが実証されています。...

リボフラビン-5′-リン酸の可視光光分解 による 病原体の不活化

tBHPを用いたHNMの早期老化誘導のための標準化プロトコル、成長停止、SA-βガラクトシダーゼ活性、SASP因子などの主要な老化マーカー解析の標準化プロトコル。...

テルトブチル過酸化物を用いた一次ヒトメラノサイトにおけるストレス誘発性早期老化を誘導する標準化されたプロトコル

学ぶ細菌のピオメラニン産生阻害と酸化ストレス感受性の評価法。NTBC処理による色素減少と過酸化水素感受性増加を測定し、抗菌薬MICへの影響を解析する技術を習得できます。

細菌Pyomelanin産生を阻害し、酸化ストレスに対する感受性の増加に対応を決定するための方法

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