Name: 持続的な障害と皮質虚血を研究するために高齢ラットにおける一般的な頸動脈閉塞と永久遠位中大脳の実行 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学ぶ高齢ラットにおける永久遠位中大脳動脈閉塞法と一般的頸動脈閉塞の手順。皮質虚血と持続的な行動障害を誘発し、構造MRIで病巣を確認する再現性のある脳卒中モデルを確立します。

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この手順のトレーニングのためにCWとDDを親切にホストしてくださったグラスゴー大学のI Mhairi Macrae教授とDebbie Dewar博士に感謝します。これらの結果につながる研究は、欧州連合の第7次フレームワークプログラム(FP / 2007-2013)/ ERC助成金契約n.309731からLMの下で、欧州研究会議から資金提供を受けています。この研究は、ダンヒルメディカルトラストからLMへの「セレンディピティ助成金」[助成金番号:SA21/0512]によっても支援されました。

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<li>Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interventions+for+sensory+impairment+in+the+upper+limb+after+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+Syst+Rev%22%5BJournal%5D)">Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke.</a> Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331(2010).</li>
<li>Reep, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rodent+model+for+investigating+the+neurobiology+of+contralateral+neglect%5BTitle%5D)+AND+%22Cogn+Behav+Neurol%22%5BJournal%5D)">A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect.</a> Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).</li>
<li>Carey, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+touch+impairment+and+brain+activation+after+lesions+of+subcortical+and+cortical+somatosensory+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions.</a> Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).</li>
<li>Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMohr%2C+JP+%22Stroke%3A+Pathophysiology%2C+Diagnosis+and+Management%22">Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management</a>. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).</li>
<li>Sacco, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+and+intracerebral+hemorrhage%3A+Natural+history%2C+prognosis%2C+and+precursive+factors+in+the+Framingham+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study.</a> Neurology. 34, 847-847 (1984).</li>
<li>Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHossmann%2C+KA+%22Textbook+of+Stroke+Medicine%22">Textbook of Stroke Medicine</a>. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).</li>
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<li>Brott, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+Acute+Cerebral+Infarction%3A+Lesion+Size+by+Computed+Tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography.</a> Stroke. 20, 871-875 (1989).</li>
<li>Lövblad, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+Lesion+Volumes+in+Acute+Stroke+by+Diffusion-Weighted+Magnetic+Resonance+Imaging+Correlate+with+Clinical+Outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome.</a> Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).</li>
<li>Norrving, B. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNorrving%2C+B+%22Textbook+of+Stroke+Medicine%22">Textbook of Stroke Medicine</a>. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).</li>
<li>Truelsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke+incidence+and+prevalence+in+Europe%3A+a+review+of+available+data%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data.</a> Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).</li>
<li>Ord, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+impact+of+pre-stroke+surgery+on+survival+following+transient+focal+ischemia+in+hypertensive+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats.</a> J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).</li>
<li>Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+focal+ischemic+stroke+in+the+rat%3A+reproducible+extensive+cortical+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction.</a> Stroke. 17, 738-743 (1986).</li>
<li>Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27staircase+test%27%3A+a+measure+of+independent+forelimb+reaching+and+grasping+abilities+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats.</a> J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).</li>
<li>Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+and+neurochemical+asymmetries+following+unilateral+trephination+of+the+rat+skull%3A+is+this+control+operation+always+appropriate%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate?</a> Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).</li>
<li>Macrae, I. M. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMacrae%2C+IM+%22Rodent+Models+of+Stroke%2C+Neuromethods%22">Rodent Models of Stroke, Neuromethods</a>. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).</li>
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<li>Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AChE-stained+horizontal+sections+of+the+rat+brain+in+stereotaxic+coordinates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates.</a> J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).</li>
<li>Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Statistical+power+analyses+using+G%2APower+3.1%3A+tests+for+correlation+and+regression+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Res+Methods%22%5BJournal%5D)">Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses.</a> Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).</li>
<li>Button, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Power+failure%3A+why+small+sample+size+undermines+the+reliability+of+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).</li>
<li>Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomic+variation+of+the+middle+cerebral+artery+in+the+Sprague-Dawley+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat.</a> Stroke. 24, 2087-2093 (1993).</li>
<li>Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%3A+1.+Description+of+technique+and+early+neuropathological+consequences+following+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cereb.+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion.</a> J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

げっ歯類におけるMCAOは、多くの場合、人間のストロークをモデル化するために使用される技術です。このモデルは、プロトコルに注意すべきいくつかの詳細を持っています。第一に、梗塞のサイズおよび研究における死亡数に影響を与えるように実験を通して、動物の体温を維持するために不可欠です。右CCAの一過性閉塞中にイソフルランを中止し、イソフルランへの曝露を減らすことにより、生存率を高めるために温め、静かな環境でラットを維持することが可能です。研究者は、追加の誘導のストレスを上回る短い麻酔期間かどうかを検討する必要があります。ラットの血管系（ 例えば 、MCA分岐）は、内および動物22のコホート間で変化します。新しい研究を始めたときには、この点に注意を負担することが重要です。別のCCAの閉塞時間を評価することができる（例えば、30、45、60及び90分）。この研究では60分間の閉塞時間が使用されます。他の研究では、45ことを発見しました分閉塞は、同様のサイズの皮質梗塞を引き起こすが、改善された生存率の事例証拠と。したがって、外科医が得られるだけにして、必要な場合に閉塞時間を増加させるために十分な病変のボリュームかどうかを確認（および/ ​​または行動障害を必要）するために、短い閉塞時間（ 例えば 、30分）で開始しています。行動の赤字は、同一の閉塞時間を持つ高齢ラットと比較して成体ラットに持続されていません。 MRI（特に閉塞時間後）病変容積は、研究目的のために適切であるか否かを判断するために使用することができます。小さな病変は（40のうち）10個未満の0.5ミリメートルの冠状スライスにまたがることになります。中規模の病変が10と20の冠状スライスの間にまたがることになります。大きな病変が20と30の冠状スライスの間にまたがることになります。非常に大規模な病変が40スライス以上の30に及ぶことになります。私たちの経験では、非常に大きな病変（以上30スライス）および/またはヘルニアのアクロスの証拠を有するラットsの正中線は通常、予後不良を持っている：短い閉塞時間が考慮されることがあります。 MRIはまた梗塞の位置を評価するために有用である：いくつかは、より尾側に位置しており、一部はより吻側に位置しています。 両方の総頸動脈から迷走神経を分離する際に細心の注意を払ってください。ラ音（ガリガリ）は、脳卒中手術後に発生する可能性があり、原因は現在不明であるが、これは、いくつかの動物では神経損傷に起因することができます：私たちの経験では、予後はこれらの動物のために非常に貧弱であり、それは通常、人道的に彼らを殺すことをお勧めします。 再現性皮質梗塞や高齢ラットにおいて許容術後生存率の恒久的ジアテルミーMCAOモデルの結果。技術は、しかしながら、実体顕微鏡下侵襲手術を必要としません。動物は、手術から十分に回復することである場合、無菌技術を維持することが重要です。ケアは、動脈を露出させ、凝固しながら、MCAを損傷しないように注意する必要があり、皮質表面へのダメージは、そうでなければ皮質の露出面積は、梗塞領域の一部を形成することができる最小にすべきです。手順を確立するために、一貫性梗塞を達成するために、研究は、例えば、候補治療法をテストするために実行される前に、閉塞時間を決定し、できるだけ多くの経験を得ることが推奨されます。実験者は、（「ブロックランダム化」）の可能な手術セッション内の任意の治療をランダム化する必要があります。これは、（過渡MCAライゲーションではなくジアテルミーのに使用されていない限り）このモデルは、MCAの再灌流を伴わないことは注目に値します。死亡率は、これらの大規模な皮質梗塞と高齢ラットにおいて高いことができますが、短い閉塞時間を使用し、可能な場合（ 例えば 、閉塞中に）全身麻酔への暴露を最小限に抑えることにより、死亡率を減少させることが可能であるべきです。イソフルランの低いレベルを可能にすることができる担体として70％N 2 Oおよび30％O 2の使用は、使用される：isofluこの縮小露光をRANEは、より高い生存率をもたらすことができます。 考慮すべきもう一つのポイントは、このプロトコルでは、我々は急性CCA閉塞とそれをシミュレートするのに対し、アテローム性動脈硬化症は、漸進的なプロセスであることです。しかし、血流と持続的な赤字の大幅な削減は、多くの脳卒中患者で発生するタンデム閉塞をシミュレートします。ラットにおける永久遠位MCAOタンデムCCAのない閉塞は、再現性14ストロークを誘導するために失敗します。また、タンデムCCA閉塞することなく、我々はかなりの自発的回復はそれが8週間にわたって脳卒中治療の長期的な行動の評価を妨げる発生を発見しました。これとは対照的に、我々はタンデムCCA閉塞遠位MCAOは、高齢ラットにおける長期的な赤字を誘導することを示しています。 結論として、ラットでこの手順では、持続的な1は、新規治療法のテストを可能にするために使用することができます障害や再の解明と、人間の状態で見られるものにサイズと位置が似ているストロークを引き起こし虚血性脳卒中後のペアメカニズム。

脳卒中は、現在、世界中で死亡の第三の最も一般的な原因と障害1の主な原因です。すべてのストロークの80％を占める虚血性脳卒中は、多くの場合、運動機能に影響を受けた側2-4へのこだわりで、（ 例えば 、固有受容）感覚の損失を引き起こす皮質梗塞になります。中大脳動脈（MCA）は、ウィリス動脈輪から供給を描画し、内頸動脈5から生じる血管の最大です。 MCAは、この地域でのストロークがすべての虚血性脳卒中6,7の65％を占めて、最も一般的な虚血性脳卒中に影響を受けた脳血管です。 MCAは、閉塞7の正確な場所に応じて異なり皮質と皮質下領域およびMCA脳卒中によって引き起こされる神経学的異常の両方を提供します。近位MCA閉塞はlenticulostriatal動脈を通じて深い領土に影響を与え、コルティの両方を包含する大きな梗塞を引き起こしますCALおよび皮質下の領域。対照的に、血流の単独皮質領域を奪うより遠位の閉塞は、より小さな皮質梗塞を生成する傾向があります。 大集団研究では、ヒト脳卒中病変が同側半球8,9の5から14パーセントの範囲です。悪性のストロークはストロークの10％を占め、頭蓋内圧を減少させるためにhemicraniectomyを必要とする、より大きな梗塞をもたらす、小さい病変を有する患者は、10を生き残る可能性が高いです。我々は、多くの人間のストロークのような半球の同様の割合を占める病変を生成する再現可能なモデルを示しています。 脳卒中は、不均一な疾患です。虚血性脳卒中の75％が（頭蓋内小血管の閉塞から）ラクナ梗塞のいずれかによって誘導されます。心原ストローク;ストロークの30％を占めているか大動脈アテローム性動脈硬化症、。症候性アテローム性動脈硬化症は、最も頻繁に共通のC点で観察されます内部および外部の頸動脈11にarotid動脈（CCA）の支店。 脳卒中の前臨床モデルは、その病態生理をシミュレートするために、できるだけ人間の条件と同様であるべきであり、脳卒中の危険因子を組み込む必要があります。虚血性脳卒中の92％は65歳以上の人々において発生し、以前に12を説明したように、他の危険因子には、肥満、高血圧、およびアテローム性動脈硬化症が挙げられます。より良いこれらの危険因子を表すには、自然状態の病態生理学的特徴のいくつかを共有することができるモデルを使用することをお勧めします。このプロトコルでは、我々は、頸動脈を介して高度な年齢や閉塞血流が含まれています。 中大脳動脈閉塞（MCAO）の古典的なモデルは、前部および中大脳動脈の血流を減少させ、近位MCA閉塞の腔内フィラメントモデルです。このモデルを使用して短い閉塞時間は、Lを集光皮質下の領域にesion、長い閉塞時間は高齢ラットで高い死亡率で、その結果、両方の皮質および皮質下領域の面積を募集大きな病変をもたらすことができる一方。比較では、私たちのグループによって使用されるモデルは、開頭術と双極性焼灼鉗子を使用して、MCAの小さな部分の血と破壊の凝固に続いて硬膜の開口部が実施されます。このジアテルミーモデルは23。田村らにより 1981紙から適応され、頭蓋骨切除術の使用は、閉じ頭蓋骨の特徴である頭蓋内圧亢進を制限し、当社の手術コホートにおいて高い再現性と低い死亡率の結果かもしれいくつかの他のモデル13に比べ。再現性梗塞と持続的な障害を発生させるために、我々は、（Chenら14我々は、使用する非侵襲性のT2強調磁気共鳴画像ごとにMRIを遠位CCAを恒久的に近位CCAを閉塞し、一過性閉塞します）程度と脳梗塞の位置、および感覚皮質において脳腫脹の程度を評価します。

<table><tbody><tr><td>Carprofen</td><td>Norbrook</td><td>Vm No; 02000/4229</td><td>give 0.25 mg/kg</td></tr><tr><td>Atropine Sulfate</td><td>AmTech</td><td>RXATRINJ-100</td><td></td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>UHS</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>リドカインクリーム (エムラ)</td><td>アストラゼネカ</td><td>0012901</td><td>剃った首と側頭部にエンドウ豆サイズの滴を塗る</td></tr><tr><td>ホメオサーミックブランケットシステム</td><td>ハーバードインスツルメンツ</td><td>507222F</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11019-12</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>アボット</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>シルク縫合糸ハーバー</td><td>ド装置</td><td>723288</td><td></td></tr><tr><td>焼灼システム</td><td>エシュマン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.25 mm宝石商焼灼鉗子</td><td>エシュマン</td><td>8330349</td><td></td></tr><tr><td>ファインデュモン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>親指駆動生理食塩水点滴システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vacusafe吸引器システム</td><td>INTEGRA BIOSCIENCES</td><td>158320</td><td></td></tr><tr><td>1.6mm粗いダイヤモンドコーティングスチールバリ</td><td></td><td>K801 104 016</td><td></td></tr><tr><td>ハンドヘルド歯科ドリル</td><td>NSK</td><td>NSKVMAXVRE(ハンドピースNSKEX6B)</td><td></td></tr><tr><td>Vannasスプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>微小血管はさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>501790</td><td></td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 縫合糸</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血管クリップとアプリケーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>手術顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンパクト麻酔システム イソフルラン K/F シングルガス</td><td>VetTech ソリューション</td><td></td><td></td></tr><tr><td>炭素鋼メス刃 No.10</td><td>スワン・モートン</td><td>201</td><td></td></tr><tr><td>25 g 針</td><td>テルモ</td><td>NN-2525R</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ (1 ml および 5 ml)</td><td>テルモ</td><td>SS+01T1 / SS*05SE1</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水 (塩化ナトリウム 0.9%)</td><td>フレゼニウス カビ</td><td>PL 08828/0178</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ジョンソン・エンド・ジョンソン</td><td>5000207582502</td><td>使用前に滅菌してください</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td></td><td></td><td>使用前に滅菌する</td></tr><tr><td>医用画像パッケージ (Jim)</td><td>Xinapse</td><td></td><td>フリー ソフトウェア</td></tr><tr><td>統計パラメトリック マッピング ソフトウェア (SPM8)</td><td>UCL</td><td></td><td>フリー ソフトウェア</td></tr><tr><td>パワー分析ソフトウェア (G*Power)</td><td>Universit&auml;t D&uuml;sseldorf</td><td></td><td>フリーソフトウェア</td></tr></tbody></table>

持続的な障害と皮質虚血を研究するために高齢ラットにおける一般的な頸動脈閉塞と永久遠位中大脳の実行

Performing Permanent Distal Middle Cerebral with Common Carotid Artery Occlusion in Aged Rats to Study Cortical Ischemia with Sustained Disability

脳卒中は、一般的に頸動脈（または他の動脈）、アテローム性動脈硬化症、高血圧、肥満や糖尿病などの併存疾患の範囲で高齢者に起こります。動物での脳卒中の治療法を評価する際に、それは優れた表面的妥当性を持つモデルを選択することが重要です。虚血性卒中は、全卒中の80％を占め、これらの大部分は、身体の反対側に永続plegiaまたは麻痺を引き起こし、多くの場合、感覚運動皮質に影響を及ぼす梗塞を誘導し、中大脳動脈（MCA）の領域で起こります。私たちは、このビデオで持続的な感覚障害とかなりの皮質梗塞の原因となる高齢ラットにおける虚血性脳卒中の製造方法を示しています。具体的には、この動脈の短いセグメントを閉塞するジアテルミー鉗子を使用して、高齢雌ラットに永久遠位中大脳動脈閉塞（MCAO）を誘導します。病変と同側の側の頸動脈は、p次いでermanently閉塞および反対頸動脈を一時60分間閉塞しました。我々は、24時間および脳卒中後8週で、構造T2加重磁気共鳴画像（MRI）を用いて梗塞サイズを測定します。この研究では、平均梗塞容積は24時間で同側半球の2.0％（標準偏差）±4.5％であった（Gerrietの式を用いて脳腫脹について補正、N = 5）。このモデルは、病態生理学的メカニズムおよび新規治療法の解明のために重要である、それは持続的な感覚赤字の誘導を可能にするように実現可能と臨床的に関連しています。

永久MCAOは、永久ipsilesional総頸動脈の閉塞とcontralesional総頸動脈の60分間の閉塞と組み合わせるジアテルミーにより中大脳動脈の凝固及び破壊に続いて、実行開頭術によって誘導されました。機器のセットアップの概略とMCAの閉塞は、図1に示されており、 図2（上記）で頸動脈の。 ストローク結果は、医用画像表示パッケージに関心ツールキットの領域を使用して（嗅球の吻側端から脊髄の吻側端まで）40×0.5ミリメートルのスライスに梗塞体積を測定することにより、脳卒中後24時間および8週間を評価しました。代表的なT2加重構造MRIスキャン24時間及び8週目（ 図3A）で同じ動物について示されています。梗塞体積は、高強度信号を示すラット脳の領域により同定しました。 T2の重みとしてEDの画像は明るい白領域として水または血漿を示します。脳卒中後の腫脹浮腫および脳の増加があることが知られており、これは、梗塞体積18の組織学的測定値と相関しているT2強調スキャンから測定することができます。 Gerrietの式を用いたが、本浮腫は初期のストローク（ 例えば 、24時間で）後の最終病変体積（ 例えば 、8週の時点で）の過大評価につながることができますので、我々はまた、本平均梗塞ボリューム調整。 図3Bは、からの平均データを示しています62.8ミリメートル3として24時間で生（未調整）病変体積（25.4ミリメートル3 SD、上段のグラフ±）。これは、影響を受ける半球（±4.2％のSD、中央のグラフ）の9.8％を占めています。脳はGerriets &#39;式を用いて膨潤について補正する場合は、この値は（2.0％のSD、下のグラフ±）4.5％に低減されます。 脳卒中の重症度もモントーヤの階段テスト15を用いて測定しました。簡単に説明すると、Aはnimalsは4週間前MCAOにストローク手術のために砂糖ペレットを取得するために、事前に訓練を受け、かつ持続的な赤字を確認するためのストローク（ 図4）は、次の8週間にわたって試験しました。ラットは、10分間の階段装置に入れ、検索されたペレットの数は、（21ペレットから）を記録し、パーセント（グループは平均±標準誤差を意味する）として表示しました。回帰分析は、データラインにフィットするように行きました。 図5は、（候補治療法の潜在的な効果のために）梗塞容積データを用いて、サンプルサイズの計算を示し、「二つの独立した手段（両群）との差」を使用して（未補正を用いたt検定のための電力解析ソフトウェアのアルゴリズムを用いて分析図3Bからの）平均と標準偏差。 12匹のラットはinfファイルを縮小治療を検出するために、グループごとに必要とされるであろうことを、図5に記載されている情報および表1ショー図6ながら24時間で50％ARCT量は、電力の「XYプロット」は、動物の様々な数を使用して達成示している。 表1は、全ての時点のためのサンプルサイズの計算をまとめたものです。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig3.jpg" /> 図3. T2強調構造的MRIは脳卒中後の腫脹梗塞や脳の大きさを測定するために使用される。（A）と同じラット脳24時間と脳卒中の誘導後8週間のT2強調磁気共鳴画像。白い領域は、病変を表すだけでなく、8週目までに解決し、いくつかの血管原性浮腫が含まれています。 （B）梗塞容積は、目的のツールキットの医用画像表示パッケージ領域を使用して測定し、そして使用する3時点について平均±SDを表すグラフ上にプロットされた（n = 6）。エドによる脳腫脹のために補正していない生の病変容積（絵馬）、影響を受けた半球の割合病変（腫れのために補正されていない）、およびGerriets &#39;式を用いて脳腫脹に対して補正半球の割合病変はここに示されています。 SDは、サンプルサイズの計算を（ 図5参照）を実行するために、むしろSEMよりも使用された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig4.jpg" /> 図4. 階段テストが把握し、ペレットを検索する際に障害を示している。この脳卒中モデルでは非常に少ない自然回復がありました。高齢ラットにおける脳卒中は、永続的にペレットに達するの「階段テスト」を使用しての毎週試験で示され、器用さを損ないます。挿入図：行動試験を行ったラットの絵。グラフは、平均（±スタンドを示しています21のうち（検索されたペレットのARDエラー）数は、影響を受けた前足により週パーセント）として表しました。 n = 5 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig5.jpg" /> 所望の治療効果を検出するのに必要なラットのグループ番号を決定するために、図5のサンプルサイズの計算パワー解析ソフトウェアから採取したこのスクリーンショットは、群あたり12匹のラットを50％の梗塞体積を減少療法を検出するために必要とされるであろうことを示しています24時間で。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53106/53106fig6.jpg" /><br/&gt; 図6.電源は、動物の種々の総数を使用して達成パワー解析ソフトの「値の範囲について、XYプロットを「高齢ラットの種々の（合計）の数値を用いた実験のために得られる力を示すパラメータ指定されました表1は、すべての我々の結果をまとめたものである。 図5に示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53106/53106fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td rowspan="2"> 脳卒中後の時間： </td><td colspan="3"> 病変の容積の減少を検出するために必要なグループあたりのラット数： </td></tr><tr><td align="right"> 75パーセント</td><td align="right"> 50％ </td><td align="right"> 25％ </td></tr><tr><td> 24時間</td><td align="right"> 6 </td><td align="right"> 12 </td><td align="right"> 42 </td></tr><tr><td> 8週間</td><td align="right"> 4 </td><td align="right"> 5 </td><td align="right"> 17 </td></tr></tbody></table> 仮定の将来の実験のために、グループごとにサンプルサイズの表1の計算パワー解析ソフトウェアを用いて計算した （図5および 6を参照）。表は、この研究における時点のそれぞれにおける病変容積の25％、50％および75％の減少を検出するための2つのグループの実験のために必要なグループあたりのラット数を示します。

ここでは、大規模な皮質梗塞と持続的な赤字を生成するために、頸動脈の同時閉塞と高齢雌ラットの永久遠位中大脳動脈閉塞を生成するためのプロトコルを提示します。私たちは、脳卒中後24時間および8週目に構造的MRIを用いて、病変の大きさの確認を示します。

Stroke typically occurs in elderly people with a range of comorbidities including carotid (or other arterial) atherosclerosis, high blood pressure, ...

本手順の最終的な目的は、高齢ラットモデルにおいて中大脳動脈（MCA）の永久閉塞を行うことです。まず、後の結紮のために頸動脈を露出させ、緩やかにループさせます。次に、頭蓋骨をドリルで開孔し、MCAを露出させます。その後、鉗子を用いて血管を凝固させ、閉塞を開始します。最終ステップとして、右総頸動脈を永久結紮し、左総頸動脈を一時的に閉塞させます。最終的に、T2強調磁気共鳴画像法（MRI）を用いて病変の大きさを観察し、処置の成功を確認します。このモデルでは、高齢ラットの中大脳動脈領域において、再現性のあるサイズの梗塞と持続的な行動欠損を誘発することが可能です。処置を開始する前に、16〜18ヶ月齢の雌の高齢Lister Hoodedラットにおいて、足指へのピンチ刺激に対する反応がないことを確認して適切な鎮静レベルであることを確かめ、適切な鎮痛剤を投与します。次に、動物の頸部腹側および右半球の側頭領域の被毛を剃毛し、エタノール綿球を用いて露出した皮膚を消毒します。ラットを加熱パッドの上に置いた、滅菌ドレープで覆われたコルクボード上の仰向けの位置に固定し、剃毛した頭部と頸部にリドカインクリームを塗布します。直腸プローブを挿入して体温を36.5～37.5°Cに維持し、動物の眼に眼軟膏を塗布します。次に、気管分泌物を減少させるために硫酸アトロピンを0.05 milliliters注入し、動物を実体顕微鏡の下に配置します。露出させた頸部の正中線に2 cmの切開を加え、外科的手技を開始し、唾液腺を気管の両側へ慎重に外側へ移動させます。次に、頸部の右側において、露出領域を覆う皮膚に非吸収性シルク5-0縫合糸をループ状に通し、この縫合糸を用いて皮膚を切開部位から慎重に牽引します。外科用テープを使用し、縫合糸をコルクボードに固定して総頸動脈を露出させます。次に、ピンセットを用いて、周囲の筋膜から動脈を慎重に鈍的剥離します。総頸動脈が露出したら、微細ピンセットを使用して、神経に接触しないよう注意しながら、迷走神経から動脈を逆行性に剥離します。非吸収性縫合糸で血管をループし、縫合糸の両端をサージカルテープで固定します。次に、頸動脈にかけられたループ縫合糸に干渉しないように注意しながら、上層の皮膚を固定していた縫合糸を取り除きます。先ほど実演した手順を左側でも同様に繰り返します。両側の動脈にループをかけ、余分な縫合糸を取り除いた後、組織を湿潤に保つために滅菌済みの生理食塩水浸漬ガーゼを傷口に配置し、皮膚を緩く縫合します。さらなる脱水を防ぐため、領域の上に生理食塩水に浸したガーゼをもう1枚置き、ラットを側臥位にします。右眼窩と外耳道の中間で皮膚を切開します。次に、側頭筋を鈍的に剥離して頭蓋骨を露出させます。次に、最大5本の3mm弾性フックリトラクターを用いて、皮膚を牽引し、コルクボードにピンで固定します。その後、耳に近い頭蓋骨の最高点にある術野の直上に、サムホイールで調整した重力駆動式の生理食塩水ドリップを配置し、さらに術野の最低点にノズルを向けたアスピレーターシステムを設置して、骨片の除去および露出部位からの軽微な出血の洗浄を行います。必要に応じて、出血源を確認できるようホイールを調整してください。次に、粗い1.6 millimeterのダイヤモンドコーティングドリルバーを備えた歯科用ドリルを約8,000 rpmで回転させ、露出した領域に5 millimeter × 5 millimeterの開頭術を行います。穿孔中は、下方向への圧力を避け、円を描くように、または横方向に圧力をかけるよう注意してください。完全に透明になったら、ピンセットを用いて骨を除去します。その後、自作の硬膜フックを使用して、表面の太い血管を破裂させないよう注意しながら、慎重に硬膜を開きます。次に、先端が0.25 millimeterの尖った角度付きジュエリー電気凝固鉗子を用いて、下大脳静脈が交差する地点から動脈分枝点までの中大脳動脈（MCA）を凝固させ、その後、血管が完全に閉塞するまでMCAの尾側枝に沿って凝固させます。次に、閉塞が完全であることを確認するため、微小血管剪刀を用いて、下大脳静脈がMCAと交差する箇所の直下にある閉塞したMCAを切断します。その後、露出した部位を生理食塩水で浸したガーゼパッドで覆い、ラットを仰臥位に戻します。頸部の緩く結ばれた縫合糸を解いて頸動脈を再び露出し、MCAを閉塞させた側と同じ側の動脈にある縫合糸を knot 結びして血管を永久的に結紮します。次に、約 125 g の圧力をかける 13 mm のステンレス製動脈クリップを用いて、左頸動脈を 1 時間の一時的に結紮します。一時的な閉塞の間、頸部の切開部を緩く縫合し、切開部の上に滅菌済みの生理食塩水に浸したガーゼをもう 1 枚配置します。次に、側頭部の切開部を縫合し、続いて生理食塩水を5 mLずつ4回皮下投与します。一時的な遮断期間の終了後、クリップを取り除き、周囲の筋肉に生理食塩水を局所塗布します。その後、吸収性4-0縫合糸を用いて皮下連続縫合で頸部の切開部を閉鎖し、31 °Cのインキュベーター内で4時間、動物を麻酔から回復させます。術後にラットに体重減少が見られた場合は、上下の歯を確認してください。次に、動物を仰臥位にし、軟組織を保護するために1 mmの注射筒を歯の後方に配置し、ハンドヘルド円形鋸を高回転速度で、ゆっくりと確実に動かして動物の歯をトリミングします。梗塞体積を測定するために、中大脳動脈閉塞の誘発から24時間後に構造的MRIを用いてT2強調像を撮影します。次に、医用画像表示パッケージを用いて、20枚の断面における梗塞領域の断面積を測定して病変体積を求め、これらの面積の合計に厚みを乗じて梗塞の全体積を算出します。病変体積の割合を算出する場合は、同側および対側半球の体積も同様に取得します。今後の研究におけるサンプルサイズを算出するには、パワー解析ソフトウェアを使用して、異なる大きさの治療効果を特定するために必要な群ごとのサンプルサイズを決定します。本実験では、先ほど示したMCA閉塞の24時間後および8週間後に脳卒中の転帰を評価し、高信号を示すラット脳の領域を梗塞体積として特定しました。この代表的な実験では、24時間時点での未調整の粗い病変体積は62.8 mm³であり、病変は影響を受けた半球の9.8%を占めていました。Gerrietsの公式を用いて脳浮腫を補正すると、この値は4.5%に減少しました。脳梗塞の重症度はMontoya階段テストを用いて測定し、MCA閉塞による脳梗塞動物では、砂糖ペレットの回収率が約40%減少することが観察されました。この手順を行う際は、結紮のために頸動脈を操作する際、迷走神経を慎重に剥離することを忘れないでください。これらの神経を損傷させると、動物の回復に悪影響を及ぼす可能性があります。この手順の後、神経保護が梗塞サイズにどのように影響するか、またどのような治療法が脳梗塞後の転帰を改善できるかといった、さらなる疑問を解明するための治療を行うことができます。

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