マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

この手順の全体的な目標は、結腸の空間的に異なる 2 つの領域、増殖性 K 陰窩ゾーン、および分化した表面上皮細胞をマイクロ解剖することです。これは、最初にマウスの結腸を取り除くことによって達成されます。2番目のステップは、2つの金属プレートの間で組織を凍結することです。

次に、組織を事前に水平にしたOCTブロックにマウントします。最後のステップは、クライオスタット上で組織を10ミクロン間隔で切片化することです。最終的には、リアルタイムPCRまたはウェスタンブロットを使用して、遺伝子およびタンパク質の発現の変化を示します。

私たちの技術の利点は、高速で安価、そして高収率の実証ができることです。私たちの手順は、私たちのグループの技術者であるクリスチャン・ガーナー・シュミットです。動物を使用するすべての手順は、エモリー大学の施設内動物管理および使用委員会によって審査および承認され、国立衛生研究所の基準に従って実施されました。

クライオスタットをセットアップした後、通常どおり、クライオスタットブレードとチャックを摂氏マイナス20度に平衡化します。次に、空のクライオ型に最適な切断温度コンパウンドを充填し、摂氏マイナス20度まで平衡化します。これには約30分かかります。

凍結したOCTを型から取り出し、液体OCTでチャックに固定し、チャックをミクロトームアームに入れ、OCTを10分間セットします。クライオスタットをセクションあたり10ミクロンに設定し、OCTブロックをミクロトームアームがブレードから数センチメートル離れて平らになるまで剃ります。

次に、金属ヤスリを使用してサンプルごとに2つのかみそりの刃を準備し、刃の鋭いエッジを鈍らせます。次に、鉗子でアルミフランジを取り外します。シリコンを50%充填し、10〜15本の解剖ピンを装着した10cmの組織培養皿を準備します。

承認された方法に従ってマウスを安楽死させ、肛門から0〜6センチメートルの遠位結腸セグメントを切除した後、5ミリリットルの室温、ハンクスバッファーを皿に加えます。ハサミを使ってカットします。結腸を縦方向に開き、糞便の内容物を取り除きます。

粘膜表面を上にして、ハンク緩衝液を含むシリコン解剖皿に組織をピンで留めます。解剖ピンを使用して組織を伸ばします。次に、室温で10分間休ませて、組織からひだを取り除き、筋肉層をリラックスさせます。

ティッシュが休んだ後に作用し、エンドピンを除くすべてのピンを取り外します。かみそりの刃を組織の目的の部分の下にスライドさせ、ハンクスバッファーを注ぎます。上部に別のカミソリの刃を追加してサンドイッチを作ります。

ティッシュセグメントを切断し、エンドピンを取り外します。かみそりの刃のティッシュサンドイッチをドライアイスに移します。ティッシュを5〜10分間凍結させます。

かみそりティッシュサンドイッチを手に取り、上部の刃に指を置いて少し温めます。サンドイッチを分離し、ティッシュセグメントの端の周りを切り取ります。ティッシュセグメントを約0.5cm×1cmで切断します。

ティッシュの上の氷が溶け始めるまで、ティッシュを温めます。この時点で、組織をOCTブロックに素早く慎重に押し込みます。クライオスタットで、サンプルの上に指を置きます。

熱伝達により、組織を壊すことなくブレードを取り外すことができます。組織をOCTでコーティングし、5分間平衡化させます。次に、10ミクロンで切片を切断します。

セクションをスライドに置き、地下室が見えるまでセクションを視覚的に調べます。セクションを1.5ミリリットルのチューブまたはスライド上に配置します。この画像は、従来の断面でヘマチンエオインで染色された結腸組織を示しており、円形の筋はcmとラベル付けされています。

MMとラベル付けされた筋粘膜、陰窩基部細胞、移行細胞、および表面細胞がはっきりと見られます。この画像は、連続切片化後の円形筋を示しています。表面細胞に向かって進むと、筋粘膜が見えます。

この画像は、高倍率でhおよびD染色された陰窩ベースセルを示しています。中央のルーメンがないことに注意してください。ここでは、遷移セルが見られ、この画像は表面セルを示しています。

以下の画像は、単離された結腸陰窩の免疫蛍光染色による細胞間接合タンパク質の染色を示しています。Soula occludin one または ZO one は緑色で、断面は青色で見える核が観察されます。遷移セルと表面セルは、連続切片化後を示しています。

いくつかの微分因子は、クリプ表面軸に沿って時空間的に表現されます。これには、緑色で示されている転写因子crippleのような因子4が含まれ、断面のシリアルセクショニングで見ると表面細胞集団に濃縮されており、3つのコンパートメント間のKLF 4 mRNAレベルのリアルタイムPCR評価が可能になります。最後に、このウェスタンブロットは、これらの細胞集団におけるKLA 4タンパク質のレベルを示しています。

マイクロトーンブレードでの作業は非常に危険である可能性があるため、この手順を実行するときは常に特に注意してください。