Name: マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: 学ぶマウス結腸の凍結切片法で、増殖性クリプト基部と分化した表面上皮細胞を分離する技術です。高速で低コストなこの方法は、遺伝子発現解析に有用です。

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国立衛生研究所(DK55679、およびDK59888 A.N.)によってサポートされています。エモリー大学統合細胞イメージング顕微鏡コア、ウィンシップがん研究所総合がんセンター助成金、P30CA138292、および米国クローン病および大腸炎財団キャリア開発賞(CTC)およびAEFへのフェローシップ賞

実験は、年齢の10と12週間の間に、C57BL / 6マウスを使用していました。動物を用いたすべての手順を見直し、エモリー大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、衛生基準の国立研究所に従って行ったしました。 1。実験のセットアップ<ol><li>クライオスタットの設定<ol><li>ミクロトームの刃とチャックを含む、-20℃にクライオスタットを平衡化（ブレード周り細心の注意を払って！）。 </li><li> 10月と空のcryomold（最適切断温度化合物）を記入し、-20℃（〜30分）に平衡化。金型から冷凍10月を外し、液体OCTでチャックに固定します。ミクロトーム腕でブロック/チャックを置き、10月は10分間に設定することができます。 </li><li>セクションごとに10μmのクライオスタットを設定し、それがフラットになるまで、10月ブロックを剃ります。数センチ離れブレードからミクロトーム腕をバックアップします。この時点で、EXPERの残りのブレードやチャックを調整していません形態。 </li></ol></li><li>かみそりの刃を準備します。サンプルあたり2かみそりの刃を準備します。金属ファイルを使用して、ブレードの尖鋭端鈍いです。次に、鉗子でアルミフランジを削除します。 </li><li>ドライアイス上でパイレックス皿などの平らな面を事前に冷やし。 </li><li> 10-15解剖ピンと解剖皿を準備します。シリコンが充填された10cmの組織培養皿50％は十分です。 RTでハンクス緩衝液5mlを追加します。 </li></ol>遠位結腸組織の2解剖<ol><li>密閉されたチャンバー内にマウスを置き、腹部と胸部12上に70％エタノールを噴霧し、その後、イソフルラン吸入と頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。 </li><li>はさみで腹部の皮膚の小さな切開を行い、その後、腹腔を露出させるために切開を行います。同様の手順は、12ここで説明されています。 </li><li>肛門縁で大腸を切り取り、コロンがフリーになるまで、腸間膜を離れていじめます。 </li><li>遠位結腸を切除肛門から0と6センチメートル間のセグメント。ここでは、陰窩の深さは〜150μmである（ 図1B参照 ）です。縦方向にはさみを使用して、コロンを開き、糞便内容を削除カット。 </li><li>粘膜表面を上に向けて解剖皿に組織をピン。ハンクス緩衝液中のシリコン皿上の組織使用して、解剖ピンを伸ばし、RT（ 図1C）で10分間休憩しましょう。これは、組織からひだを除去し、筋肉層がリラックスすることができます。 </li></ol>セクショニング用クライオスタット3.マウント組織<ol><li>組織の目的のセクションの下にカミソリの刃をスライドさせ、その後、ハンクス緩衝液を捨てます。サンドイッチを作り、トップに別のカミソリの刃を追加します。組織セグメントを切断し、ピンを取り外します。ドライアイスにカミソリの刃/組織サンドイッチを転送します。 （5〜10分間、 図1D）組織が ​​凍結することができます。 </li><li>カミソリ/組織サンドイッチをピックアップし、それがトップBLに指を置くことで少し温めますADE（粘膜側を上に。基底筋層が最初に区分されるように、これは、組織を配向します。）。サンドイッチを分離し、組織セグメントのエッジの周りカット。組織セグメント約0.5センチ×1センチカット。エッジ領域は連続切片は、多くの組織層を含有させ、カールする傾向を有します。オーバーカットアンダーカットよりも良好であることに注意してくださいので、十分過ぎるくらいの注意が必要。 </li><li>組織の上に氷が溶け始めるまで組織が加温することができます。この時点で、迅速かつ慎重にクライオスタット内のOCTブロックに組織を押してください。 </li><li>サンプルの上に指を置くことによって、ブレードを取り外します。熱伝達には、組織を破壊することなく、ブレードを削除することができます。 </li><li>コー​​ト10月で組織し、5分間平衡化。 10ミクロン（ 図1E、F）のセクションをカット。陰窩が見られるまで、視覚的にセクションを検査します。 1.5ミリリットルチューブ内またはスライド上のセクションを配置します。 </li><li> mRNAまたはタンパク質の分析のために、Tを配置5陰窩ベース、5移行、および管当たり5面部分とチューブで、彼のサンプル。 RNA回収のために1ミリリットルを商業分離試薬を追加し、室温で10分間インキュベートします。製造業者の説明書に従ってRNA精製を実行します。 cDNAの生成のための全RNAの5〜10μgのを使用してください。 </li><li>タンパク質精製のために、5つのセクションごとに寒RIPA溶解バッファー（プラスプロテアーゼ阻害剤）の0.5ミリリットルを追加します。氷上で、70％のサイクルで3回超音波処理。 <ol><li> SDS PAGEローディング緩衝液（Laemmli緩衝液）に試料を添加し、10分間100℃でインキュベートします。 SDS-PAGEの転送の対象サンプルは、その後、2時間の5％ミルク/ PBSでブロックします。 （1：500）、4℃でO / N KLF4抗体とのインキュベーション、続いてウエスタンブロット分析を実行します。 </li></ol></li></ol>

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著者は開示するものは何もありません

結腸上皮細胞の増殖および分化に関与する分子メカニズムはほとんどわかっていません。これは、結腸上皮陰窩の基部に幹細胞区画の細胞シグナル環境の理解のギャップを含んでいます。腸細胞の分化の根底にあるプロセスが注目もあります。例えば、in vivoでの分化の理解がin vitroでの主な腸システム16を製造することを目的とした研究のためのベンチマークとして必要とされる増加しました。 上記の手順は、特別な注意を必要とするいくつかのステップが含まれています。まず、（セクション3.2で説明したように）凍結組織セグメントの周りのエッジを削除は解剖や凍結時のカール組織端として必要とされます。これらのエッジ結果を移動しないと、表面及び陰窩ベース細胞の混合集団です。予め冷却し、水平に10月ブロックの組織をマウントすることも不可欠です。 Tそのプロトコルは、各プール内のセクションの数を変更することによって遠位結腸の他の領域に適用することができます。 図1Bに示すように、例えば、粘膜陰窩の長さは150〜ミクロンの間で変化します。肛門4からCM-6センチメートルとの間の領域を研究する際に、セクションの数が重要な30に15から増加する必要があるため、このプロトコルは、（原因折り目に近接結腸（7センチメートル-9 cm）のために提案されていません襞obliquae）それは不可能連続切片によって表面及び陰窩ベース細胞を分離することルーメン内に延びています。 連続切片技術は陰窩ベースを研究し、ヒトにおける上皮細胞集団を表面に使用されてきました。しかし、我々のプロトコルが原因で、マウス組織のサイズが小さいために必要な追加のステップを追加します。我々は、上記のプロトコルは、遺伝的に扱いやすいマウスシステムにおける陰窩塩基および表面上皮細胞集団の調査を可能にすることを提案します。確かに、プールされたセクションでは、yieLD、高品質のタンパク質やRNAの適当な下流分析。将来のアプリケーションは、細胞シグナル伝達経路の研究やクロマチン免疫沈降を含むことができます。しかし、前述の代替の方法のいくつかのように、得られた切片は、上皮および間質固有層細胞の混合物を含むことに留意すべきです。結論として、ここで説明するプロトコルは、マウス結腸粘膜の空間的に異なる領域での分子プロセスの分析のための迅速で、高収率の方法を提供します。

結腸の上皮層は、常駐幹細胞は数日ごとに1組織の補充を有する高度に再生組織です。再生のこのプロセスは、増殖性の幹細胞区画の維持を必要とします。時間が経つにつれて、新たに生成娘細胞はその増殖能を失い、腸の管腔表面に向かって移動します。移行と一致し、前駆細胞は、成熟した障壁形成腸細胞や粘液産生杯細胞に分化します。この分化プログラムの障害は、炎症性腸疾患および大腸癌2,3に見られるような上皮バリアを妥協に寄与すると考えられています。 上記のプロセスの詳細な研究は、陰窩ベースと表面の細胞集団を単離するための方法論が必要になります。複数の方法は、独自の利点と欠点を有するそれぞれ、存在します。腸上皮細胞の単離のための現在の方法は、CHを含みます実験条件4,5に応じて全体の陰窩、上皮シート、または単一細胞の単離、その結果、薬剤および機械的解離をelating。これらは、高収量法である、まだ間シグナル伝達の変化は、ネイティブ環境6,7を表していない可能性がこれらの条件の下で報告されています。レーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、空間的に異なる材料の収集を可能にしますが、低分子降伏8,9を実現しています。ヒト結腸組織では、連続水平凍結切片法10を開発してきました。しかし、マウスの粘膜組織は、この技術の直接処分のために法外小さいです。ヒトでは、腸の陰窩の長さ（陰窩ベースと表面の細胞間の距離）結腸では、〜100〜1000μmの11との間で変化します。マウスでは、陰窩の長さは、50〜300ミクロン〜の間（ 図1Aを参照）です。マウス陰窩のサイズが小さいイゾラへの挑戦を提示します既存のプロトコルを使用して、これら2つの細胞集団の化。 現在、陰窩ベースの単離のための低コスト、高歩留まり方法を説明し、マウスの結腸組織における上皮細胞集団を表面。このようにして採取した組織は、その後、免疫蛍光染色、RT-PCR（リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応）、またはウェスタンブロッティングなどの標準的な下流のアプリケーションの数によって分析することができます。

<table><tbody><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ バイオシステムズ ヌスロッホ ドイツ</td><td>CM 1510-3</td><td></td></tr><tr><td>MyiQ リアルタイム PCR 検出器</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 510&nbsp;</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>OCT</td><td>ティッシュテック、サクラファインテック、トーランスCA</td><td>4583</td><td></td></tr>クライ<tr><td>オモールド</td><td>ティッシュテック、サクラファインテック、トーランスCA</td><td>4557</td><td>25mmx20mmx5mmハイ</td></tr><tr><td>プロファイルミクロトームブレード</td>ライ<td>カバイオシステムズ、ヌスロッホドイツ</td><td>818</td><td></td></tr><tr><td>GEM工業用ブレードアメリカの</td><td>安全カミソリブレード</td><td>62-0314</td><td></td></tr><tr><td>シルガードシリコンエラストメアベース</td><td>ダウコーニング、ミッドランドミシガン</td><td>州3097358 27</td><td></td></tr><tr><td>1/2 g針</td>ベ<td>クトン-ディキンソン、フランクリンレイクス、ニュージャージー州</td><td>解剖用</td><td>305109ピン</td></tr><tr><td>TRizol</td><td>Life Technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr>抗体<tr><td>ZO-1</td><td>インビトロジェン&nbsp;</td><td>187430</td><td></td></tr><tr><td>抗体 KLF4</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4038S</td><td></td></tr><tr><td>抗体 mGAPDH</td><td>Sigma</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>抗体 二次 Alexa 標識</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>488 抗ウサギ</td></tr><tr><td>抗体 二次 HRP 標識</td><td>Jackson</td><td>111/115-001-003</td><td>ウサギ/マウス&nbsp;</td></tr><tr><td>Topro-3</td><td>Invitrogen</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>HANKs 平衡塩緩衝液</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 溶解緩衝液</td><td></td><td></td><td>50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-デオキシコール酸</td></tr><tr><td>プライマー TBP 3'GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>プライマー TBP 5'GATGACTGCAGCAAATCGCTT</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>プライマーKLF4</td> <td>3'TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>プライマー KLF4 5'ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

結腸粘膜組織は、管腔抗原に対する重要なバリアを提供します。この障壁は、単純な円柱状上皮細胞の単層で構成されています。結腸上皮は動的にひっくり返り、リーバーキューンの陰窩を含む幹細胞に上皮細胞が生成されます。陰窩基部で産生された前駆細胞は、腸管腔に放出される前に細胞分化の過程を経て、管腔に向かって移動します。これらのプロセスを分子レベルで研究するために、結腸粘膜の空間的に異なる2つの領域を顕微鏡で解剖するための簡単な方法を開発しました。増殖性陰窩ゾーン、および分化した表面上皮細胞。私たちの目的は、マウスの結腸粘膜から特定の陰窩および表面上皮細胞集団を分離し、RNAとタンパク質を分離することです。

結腸組織切片を組織学的評価およびH＆E染色のために処理した13。粘膜の伝統的な断面図を図2Aに見られます。基礎分野は、主に円形の筋層から成る外筋層が含まれています。内腔に向かって進むと、粘膜筋板は、陰窩 - ベースの上皮細胞に隣接して明らかである、移行細胞は、組織の真ん中にあり、最終的に、表面細胞集団は、腸管内腔に面し。ここで説明した連続切片法は粘膜筋板（ 図2C）、続いて縦方向および円形の筋層が最初に遭遇するような姿勢（ 図2B）を 、保持しています。画像の左上にある非筋間質細胞の出現に注意してください。以下に説明する下流の分析のため、筋切片は廃棄されます。以降のセクションでは、上皮細胞と間質組織（固有層を含んでいます）、陰窩ベース細胞（ 図2D）で始まります。による密に充填された核に暗く見える陰窩のほとんどにおいて中央管腔が存在しないことに注意してください。これらの層は、増殖コンパートメントが含まれています。移行細胞は顕著な中央ルーメン（ 図2E）と密に詰まった腺として表示されます。最後に、表面の細胞集団は、 顔 （ 図2F）JP見上皮単層の領域と、不規則な構造を有しています。 （ここでは14のように）上記のように連続切片はまた、免疫蛍光標識および共焦点顕微鏡法のために処理することができる。 図2Gは 、核（青）および細胞-細胞接合タンパク質閉鎖帯について染色し、続いて固定し、100％メタノールで透過処理し、単離された陰窩を示しOccludens 1（ZO-1、緑）。伝統的な切片の向きでは、cryptと表面の細胞を同時に表示することができます（ 図2G </stronG&gt;）。結腸陰窩の内腔ZO-1接合部の汚れラインことに注意してください。管腔のこのZ0-1裏地も円形腺（ 図2G）の中央に、移行細胞集団の連続切片試料に見られます。拡張ZO-1染色は表面細胞集団（ 図2IおよびJ）に見られます。 いくつかの分化因子は、陰窩ツー面軸に沿って時空間的様式で発現されることが知られています。これは、表面の細胞集団が富化されることが知られている転写因子クルッペル様因子4（KLF4）を含みます。従来の切片法を用いて、KLF4、表面細胞集団（ 図2K）に対向管腔の核内に見出されます。そこで、KLF4 mRNAは主に表面細胞集団内で発現されるであろうと推測しました。これをテストするには、連続切片を採取し、表面、移行、および陰窩ベースサンプルに分類しました。 Subsequently、RNAは、RNeasyカラムとDNase処理により、さらに精製して、標準のTrizol抽出を用いて回収しました。 RNAは、サンプル当たりの総RNAの5-10μgの間に得られたプールされた5個の連続切片から回収しました。これらのサンプルは、その後、KLF4および参照遺伝子、TATAボックス結合タンパク質1（TBP-1）（ 図2L）14の両方に、半定量的リアルタイムPCRを行いました。 図2Lに示すように、TBP-1に正規化した後に、表面細胞は陰窩細胞中で発現される8回KLF4 mRNAにまで発現することが見出されました。同様に、KLF4タンパク質レベルは、陰窩面軸に沿って空間的調節を示すことが見出されました。上述した後、4℃で20分間、溶解緩衝液中でインキュベートしたように連続切片をプールしました。これは、サンプルあたりのタンパク質の200〜250μgの間に生じました。次に、試料をSDS-PAGE（ 図2M）15による分析を行いました。 図2Mに示すように、KLF4のProteinレベルは劇的に表面細胞集団において高いです。上記の知見は、マウス結腸粘膜から表面及び陰窩の上皮細胞を大量に単離するためのこのプロトコルの能力を実証します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig1.jpg" /> 図1：マウス結腸粘膜および外部筋肉層を示す（A）の回路図。我々の方法は、シリアル凍結切片（10μmの各）により離散表面細胞および陰窩ベースの細胞集団を収集することを目的とします。外部筋肉層は破棄されます。 （B）墓所の高さは、コロン（陰窩ベースと表面層との間の距離）の長さに沿って変化します。データポイントは、個々の陰窩測定および記号は生物学的複製を示す指示（N = 4）。 （C）結腸セグメントは、収集二分、およびシリコン解剖皿に固定します。 SE（D）組織肛門からgment約3cmはカミソリの刃の間でプレスし、ドライアイスで凍結されています。 （E）組織は、その後、平坦化前のOCTブロックに取り付けられています。 （F）凍結切片を取り出し、目視で検査します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53112/53112fig2.jpg" /> 図2：代表的なデータの円形筋（CM）を示す断面図でヘマトキシリン-エオシンで染色した（A）結腸組織、粘膜筋板（mm）で、陰窩-基本セル、移行細胞、および表面の細胞。 （B - C）結腸筋層。 （D）クリプト系細胞。中央管腔が存在しないことに注意してください。 （E）移行細胞。 （F）表面細胞。単離された結腸陰窩の（G）免疫蛍光染色。 ZO-1（緑）および核（青）は、断面で観察されます。 （HI）ZO-1と移行し、表面の細胞で核染色。 （J）ZO-1染色の拡大図。 （K）、KLF4（緑）は、表面の細胞集団において濃縮されます。 （L）3つの区画の間にKLF4 mRNAレベルのリアルタイムPCR評価。 （M）は、これらの細胞集団におけるKLF4タンパク質レベルのウェスタンブロット分析。

ここでは、空間的に異なるマウスの結腸上皮表面細胞を根底にある陰窩基部細胞から分離するための簡単な方法について説明します。

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

この手順の目的は、大腸の空間的に異なる2つの領域、すなわち増殖期にあるKクリプト（隠窩）領域と、分化した表面上皮細胞をマイクロダイセクションすることです。これは、まずマウスの大腸を摘出し、次に組織を2枚の金属プレートの間で凍結させることで達成されます。次に、組織をあらかじめ水平に調整したOCTブロック上にマウントします。最終ステップとして、クリオスタットを用いて組織を10 µm間隔で切片化します。最終的に、リアルタイムPCRまたはウェスタンブロットを用いて、遺伝子およびタンパク質発現の変化を示します。本手法の利点は、迅速かつ低コストで、高い収率が得られることです。本手順は、当グループの技術者であるChristian Garner Schmidtによって実施されました。動物を用いたすべての手順は、エモリー大学の動物実験委員会（Institutional Animal Care and Use Committee）によって審査および承認され、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health）の基準に従って行われました。通常通りクライオスタットをセットアップした後、クライオスタットの刃とチャックを−20°Cまで平衡化させます。次に、空のクライオモールドにOCTコンパウンドを充填し、−20°Cまで平衡化させます。これには約30分かかります。凍結させたOCTを型から取り出し、液体OCTを用いてチャックに固定します。チャックをミクロトームアームに装着し、OCTを10分間静置して凝固させます。クライオスタットを1セクションあたり10 µmに設定し、OCTブロックが平坦になるまで削り取ります。その後、ミクロトームアームを刃から数センチメートル後退させます。次に、サンプルあたり2枚のカミソリの刃を用意し、金属やすりを用いて刃の鋭いエッジを鈍らせます。その後、ピンセットでアルミニウム製のフランジを取り除きます。10 cmの組織培養皿を用意し、シリコンを50%まで充填させ、10から15本の解剖ピンを準備します。承認された方法に従ってマウスを安楽死させ、肛門から0〜6 cmの遠位結腸セグメントを切り出した後、室温のHanksバッファーを5 mL、ディッシュに加えます。切断には鋏を使用してください。結腸を縦方向に切り開き、糞便内容物を除去します。粘膜面を上にして、Hank's bufferを入れたシリコン解剖皿に組織をピンで固定します。解剖用ピンを用いて組織を伸ばします。その後、組織のしわを取り除き、筋層を弛緩させるため、室温で10分間静置します。組織を静置させた後、端のピン以外をすべて取り除きます。組織の目的の切断面の下にカミソリの刃を滑り込ませ、その後、Hanksバッファーを捨てます。上部にもう一枚のカミソリの刃を加え、組織を挟み込むようにします。組織セグメントを切断し、エンドピンを取り除きます。カミソリのブレードで挟んだ組織をドライアイスに移します。組織を5～10分間凍結させます。カミソリで挟んだ組織を取り出し、上の刃に指を当ててわずかに温めます。挟んでいたものを離し、組織片の周囲を切り出します。組織片のサイズは約 0.5 cm × 1 cm となるように切り取ってください。組織の上の氷が溶け始めるまで、組織を室温に戻します。この時点で、組織を素早く注意深くOCTブロックに押し付けます。クライオスタット内で、サンプルの上に指を置きます。熱伝達により、組織を乱すことなくブレードを取り出すことができます。組織にOCTを塗布し、5分間静置して馴染ませます。その後、10ミクロンの厚さで切片を作成します。切片をスライドに乗せ、陰窩が確認できるまで視覚的に検査します。切片を1.5 milliliterチューブまたはスライドに配置します。この画像は、従来の横断面でヘマチン・エオシン染色された結腸組織を示しており、環状筋がcmとしてラベルされています。MMとラベルされた粘膜筋層、陰窩底細胞、移行細胞、および表面細胞が明確に観察されます。この画像は、連続切片作成後の円形筋層を示しています。表面細胞に向かうにつれて、粘膜筋層が確認できます。この画像は、hおよびDで染色された陰窩底細胞を高倍率で示したものである。中央に腔が存在しないことに注目されたい。ここでは移行細胞が見られ、この画像は表面細胞を示している。以下の画像は、単離した結腸腺窩の免疫蛍光染色の結果であり、細胞間接合タンパク質を染色しています。occludin-1またはZO-1が緑色に、核が青色に染まっており、横断面で観察されています。ここでは、連続切片による移行細胞および表面細胞を示しています。いくつかの分化因子が、クリプト表面軸に沿って時空間的に発現しています。これには、緑色で示されている転写因子Kruppel-like factor 4が含まれ、これは横断的に見た際に表面細胞集団に濃縮されています。連続切片作成により、これら3つの区画間におけるKLF4 mRNAレベルをリアルタイムPCRで評価することが可能です。最後に、このウェスタンブロットは、これらの細胞集団におけるKLF4タンパク質のレベルを示しています。マイクロトームの刃の取り扱いは非常に危険であるため、この操作を行う際は十分に注意してください。

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腸陰窩の分離:マウスモデルの小腸から全陰窩を分離する方法

パイエル板の細胞の特定の亜集団（PPS）、腸管関連リンパ組織の主要な誘導部位の免疫学的機能を理解する上で関心が高まっている。ここでは、フローサイトメトリー解析と免疫染色のためのPPの凍結切片のための単一細胞調製物を調製するためのPPのパラレルプロトコルの概要を説明します。...

マウスのパイエル板のリンパ球や樹状細胞を単離し、免疫染色

筋線維芽細胞は、正常および疾患状態の両方において重要な生理学的プロセスを調節、胃腸管の有力な間質細胞である。我々は、マウスおよびインビトロ実験のために利用することができるヒト結腸組織の両方からの一次筋線維芽細胞の単離を可能にする技術が記載されている。...

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マウスの腸を切断して「転がす」ための簡単な装置の使用が説明されています。...

急速にマウス腸のホールマウントを準備するための簡単​​な装置

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。...

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

このプロトコルの目標は、レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) を使用して固定されていない、新鮮な切除のひと腸管組織から分離した腸管神経節から整合性の高い RNA サンプルを取得することです。このプロトコルは、人間の腸組織、セクショニング、エタノール染色脱水、LCM、フラッシュ凍結サンプルの準備および RNA...

新鮮凍結ひと組織から腸管神経節の隔離のためのレーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクションの最適化

(EC) 腸クロム親和性細胞は、消化管上皮細胞の小さなサブセットを構成します。EC 細胞は電気的興奮性、まだ養殖と EC 細胞を識別する難しさは、生理学的研究を限られているセロトニンを解放します。ここで紹介した方法は、電気生理学によって初代培養モデル単一の EC...

一次培養マウス腸クロム親和性細胞のセル全体を電気生理学

マウスのティッシュの処理の標準化の欠如は、人体標本と比較するとマウスの病理組織学的解析の画質を低下させます。ここでは、炎症や uninflamed での処理とひと試料を埋め込むのため日常的にロボット システムの可能性を示すため大腸組織をマウスの病理組織学的検査を行うためのプロトコルを提案する.

ロボット システムを使用して処理し、組織学的解析のため大腸マウス サンプルを埋め込む

このプロトコルの目的は、コラゲナーゼを用いて組織の酵素消化によって結腸のラミナプロプリに存在する単核細胞を単離させることである。このプロトコルは、単核細胞の効率的な単核分離を可能にし、その結果、単一細胞懸濁液を生成し、堅牢な免疫表現型に使用することができます。...

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

ここでは、マウスにおける大腸誘導ピンチ生検を誘導し、創傷閉鎖をリアルタイムで追跡する手順の詳細な説明を提供する。さらに、創傷床の組織学的、免疫組織化学的および分子的分析のための組織の調製方法が提供される。...

マウスにおける大腸誘導ピンチ生検の実施と、その後の組織変化の評価

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

学ぶマウス結腸の凍結切片法で、増殖性クリプト基部と分化した表面上皮細胞を分離する技術です。高速で低コストなこの方法は、遺伝子発現解析に有用です。

マウス結腸粘膜の顕微解剖のための凍結切片法

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