Name: 解析腸炎エルシニアエフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学ぶβ-ラクタマーゼエフェクター融合アッセイを用いて、腸炎エルシニアのIII型分泌系によるエフェクター蛋白質の宿主細胞への転位を定量的に測定する方法。レーザー走査型顕微鏡とFRETレポーターを活用し、細菌の病原性メカニズムの理解に貢献します。

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FRET取得定量化アルゴリズムを提供してくださったAntonio Virgilio Failla博士と、pMK-blaおよびpMK-ovaコンストラクトを提供してくださったErwin Bohnに感謝します。

1.ピーク発光とクロストーク決意（また図2を参照してください） <ol><li>ドナー（クマリン誘導体のV450）およびアクセプター（フルオレセイン）色素の間の発光ピークとのクロストークの量を決定するために、405 nmの励起での個々のフルオロフォアの両方で標識された細胞のスペクトルスキャンを実行します。 </li><li> （ここでは455から465 nmおよび525から535 nm）のドナーとアクセプターチャネルに使用​​される各色素のピーク内に10 nmの帯域幅を決定します。波長以上の正規化強度をプロットし、アクセプターチャネルとその逆でドナー色素のクロストークの平均割合（ 図2）を計算します。 </li></ol> Y.の調製細胞培養の感染のエンテロコリチカ株<ol><li>以下の株を使用してください：WA-314 PMK-OVAが及び（WA-314は17 PMK-BLAとPMK-OVA 17、それぞれプラスミドで形質転換）WA-314ΔYopEPMK-BLA（WA-プラスミドPMK-BLA 17で形質転換314ΔYopE） </li><li>感染ストリークYの前に少なくとも2日WA-314 PMK-BLAとWA-314 PMK-OVAに必要な抗生物質（カナマイシンを含むLB寒天プレート上のクライオストックから株WA-314 PMK-OVA、WA-314 PMK-BLAとWA-314ΔEPMK-BLA エンテロコリチカ ;カナマイシンおよびWA-314ΔEPMK-BLAのためのテトラサイクリン）と27℃でO / Nを育てます。その後、4℃で最大1週間のプレートを保ちます。 </li><li>感染前のある日は、それぞれの株の1コロニーを、必要な抗生物質を含むLB培地の3ミリリットルを接種し、180rpmで振とう機で27℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>感染の日に、抗生物質を含まない新鮮なLB培地40ml中にO / N培養物を2mlに接種し、III型分泌系の発現を誘導するために180rpmで振盪器中で37℃で90分間インキュベートします。 </li><li>適切なチューブに培養液を移し、氷の上または4℃で培養物を維持します今後。 5,000×gで、4℃で10分間培養液を遠心します。 </li><li>氷2〜3mlの冷PBS中で細菌ペレットを再懸濁します。分光光度計を使用して、8×10 8 CFU / mlの濃度の細菌懸濁液を希釈します。個別に対応する光学密度を決定します。 HeLa細胞に感染するまで氷上でこの懸濁液を保管してください。 </li></ol> 3.メッキHela細胞<ol><li>一日、96ウェルプレートのウェル中で、10％熱不活性化ウシ胎児血清（FCS）を含有する200μlのDMEMで感染シード1.5×10 4細胞 、HeLa細胞の前に、37℃で5％CO 2インキュベーター内で育てます。各株（三つの異なるインキュベーション時間）のための3つのウェルをシード。 </li></ol> 4. HeLa細胞の感染とCCF4を使用したロード<ol><li>培地に細菌懸濁液の3.5μLを追加することにより、HeLa細胞に感染し、そっと中を二回ピペッティングして混ぜます。細菌が上の沈降することを許可します細胞当たり約100バクテリアのMOI（感染の部分）の細胞です。時間経過の場合は-90分、-60分-30分で感染を開始し、一般的なエンドポイントを達成するために、0分まで、5％CO 2インキュベーター中、37℃でインキュベートします。 </li><li>インキュベーションが完了したときに、慎重にHeLa細胞を除去せずに培地を吸引し、CCF4の輸出を減らすためにエフェクターおよび2.5mMプロベネシドの発現を停止するために20μg/ mlのクロラムフェニコールを含有するPBSを50μl加えます。 </li><li>この時点で、顕微鏡ステージに96ウェルプレートに移し、各ウェルに、後の分析のために適切なスポットを定義します。 10分以内に、この手順を終了（取得の詳細については、セクション5.1を参照）。 </li><li>あたりがよく、20を含むCCF4 / AM負荷溶液（0.24μlの溶液A、1.2μlの溶液Bの70μL、18.56μlの溶液C（溶液A、B、及びCはCCF4 / AMローディングキット内に提供される）および50μlのPBSを（追加しますマルチPを使用して/ mlのクロラムフェニコールおよび2.5mMプロベネシド）ipetteを室温で5分間インキュベートすると。今から仕事の中断なし。 </li><li>ローディング溶液を吸引除去し、マルチピペットを用いて20μg/ mlのクロラムフェニコールおよび2.5mMプロベネシドを含む100μlのPBSを追加します。その後急速に顕微鏡ステージに96ウェルプレートを転送し、充填溶液の吸引から10分以内に取得を開始します。 </li></ol> 5.レーザー走査顕微鏡とデータ解析<ol><li>画像収集<ol><li>総光子数を最大化し、光毒性を最小限にするように撮影条件を設定し、光退色、クロス励起。 <ol><li>現代の共焦点レーザー走査型顕微鏡では、同時にアクティブなドナーおよびアクセプターチャネル、8ビット深度で高感度のGaAsP検出器を選択し、2.5エアリー単位（ すなわち、広い光学切片）に検出器のピンホールを開いて、20倍高い開口数の液浸対物レンズを使用し、〜750 nmの画素サイズ、3倍のフレーム平均とexcit405nmのダイオードレーザーの10％E。 </li><li>正確な定量化が同じ値に両チャンネルの検出器利得を設定確保し、いかなる飽和画素を回避すること。 注：ここでは、ゲインを150％に設定しました。 </li></ol></li><li> 1mlシリンジで例えば、ウェルの底に液浸媒体を拡散することによって、連続的な浸漬を確認し、任意の気泡の捕捉を避けます。 </li><li>透過光を有効にして、全てのウェル内の視野の代表フィールドを見つけます。正しく調整自動ステージを使用して、ソフトウェア内の位置をマークします。 </li><li>染色用のプレートを除去した後、（4.3節を参照）、プレートを再挿入し、焦点ずれを回避するために、上に重量を付加します。レーザ走査モードで保存された位置を確認し、適切にフォーカスし、横方向の位置を調整します。 </li><li> 2時間に、2分に期間を時間の経過を設定し、取得を開始します。 </li></ol></li><li>画像定量化（例としては、ビットプレーンSOFTWについて説明します）などIMARISの通りです<ol><li>ピクセル行列の算術計算を可能にするソフトウェアにデータセットをインポートします。ソフトウェアのアイコンをドナーとアクセプターチャネルの両方を含むソースファイルをドラッグ＆ドロップすることでこれを行います。 </li><li>同じオフセットを使用して、両方のチャネルでバックグラウンドを減算します。これを行うには、 メニューをクリックし、画像&gt;処理&gt;ベースライン減算をクリックします。各チャンネルを選択し、ベースライン値を入力します。 </li><li>予め決定された補正係数fとアクセプターチャネル（CH）にドナーチャネル（CH1）のブリードスルーを補正（1.1を参照）、新しいチャネルを作成します。 Ch1のF * - = CH 2 CH 2」 注：アクセプターのブリードスルードナーチャンネルにはノイズのレベルを超える検出されませんでした。 <ol><li>メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数をクリックして、ABS（CH 2 - （CH1 * 0.33））を入力します。その後メニュー&gt; [編集]&gt; [チャンネルを削除]をクリックしてチャンネル2を削除します。ていることを確認してくださいブリードにより補正アクセプターチャネルとして残る新しいチャンネル2.オプション：[メニュー]&gt; [編集]&gt; [画像のプロパティに行くことによって、元の色にグレーのチャンネルカラーを変更します。カラー&gt;ベースカラーをマッピングされた&gt;チャネル4を選択し、緑などに変更します。 </li></ol></li><li>相対FRET係数を決定するために、次の操作で新しいチャネルを作成します。 CH3 = CH 2 &#39;/（CH1 + Ch2の&#39;） <ol><li> ./メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数に移動して、CH2を入力（CH1 + CH2） </li></ol></li><li> 8ビット画像でのFRETチャンネルを適切に視覚化するために、第四のチャネルを作成します。 CH4 = 255 * Ch3の<ol><li>メニュー&gt;画像処理&gt;チャネル算数に移動し、255 *のCH3を入力します。[メニュー]&gt; [編集]&gt; [画像のプロパティに行くことによって、チャネルの色を変更します。チャンネル4&gt;マップされたカラー&gt;カラーテーブルファイル&gt;ジェットを選択します。 </li></ol></li><li>チャネルCH3およびCh4を股関節に3×3のメディアンフィルタを適用します。tは、画像のノイズを低減します。これを行うには、メニュー&gt;画像処理&gt;スムージング&gt;メジアンフィルタにクリックします。両方のチャンネルを選択し、フィルタサイズ「3x3x1」を適用します。 </li><li>細胞のシグナルの定量のために、適切にオフセットが小さすぎる構造を除外するように大きさの構造体をフィルタを設定することにより、Ch4を内のセルを検出します。 <ol><li> ビューを突破し、「 新しいサーフェスの追加」アイコンをクリックしてください]を選択します。表面ウィンドウで検出アルゴリズムのパラメータを定義します。より高速な処理のために、2つのチェックボックス「セグメント関心領域のみ」と「最終的にはプロセス全体のイメージを &quot;有効にします。その寸法を編集して、関心領域を定義します。 </li><li>ソース・チャンネルとしてチャンネル4を選択し、しきい値設定&gt;背景差分（局所的なコントラスト）によりしきい値を設定し、10μmの直径を設定します。最大intensiに手動で0に最小強度しきい値と最大しきい値を設定しますTY。地域によって構造を濾過し、 例えば、187μm²に最小値を設定します。表面検出を終了します。 </li></ol></li><li>携帯エンティティにおけるドナー蛍光強度の平均値（CH1）及び相対FRET係数（CH 3）とその標準偏差を抽出します。これを行うには、表面特性にアクセスしてください。サーフェススタイル/品質&gt;サーフェスを選択することにより、構造物の外観を変更します。フィルタ]タブをクリックすることで、すべての構造を選択します。選択&gt;統一を処理するために行くことによって検出された構造を統一。ファイルにすべての統計情報をエクスポート&gt;統計]タブをクリックして、MS Excelに表面の統計情報をエクスポートします。 </li><li>時間をかけてこれらの値をプロットします。転位置エフェクターの量を表すために合理的なパラメータとして、各条件のためのドナーチャンネル蛍光増加の最大傾斜の10分の間隔を指定します。 M =Δドナー蛍光強度/Δ時間（分）などの傾きを計算します。 </li></ol></lI&gt; </ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ここでは、正常Yでエフェクター転座の定量分析のために、TEM-1ベータラクタマーゼレポーターベースのアッセイを適用しましたエンテロコリチカ 。この敏感な特定の比較的簡単な技術の多くの異なる変形例が文献に記載されています。この研究では、レーザ走査顕微鏡は、蛍光シグナルの最も高感度で正確な検出を行いました。具体的にドナーとアクセプター色素と個別に調整可能な検出帯域間のクロストークの補正は、本方法の他のバリエーションに比べ、測定の優れた精度を可能にします。結果は、この方法は、定量的転座を分析することが可能であることを示しています。細胞内のベータ - ラクタマーゼの異なる濃度を表す異なるインキュベーション時間を積極ドナー蛍光強度の傾きと相関していました。また、WA-314ΔYopE有意に高い移行率を比較野生型株にWA-314は、実証することができました。 データ分析のための二つの代替オプションが適用された：ドナーチャネル強度及び相対FRET係数。ドナーのチャネルを使用することの利点は、それが直接CCF-4加水分解生成物（クマリン）の蓄積を表していることで...

III型分泌系を直接標的真核細胞中にコードされた細菌のエフェクタータンパク質を提供するために、グラム陰性菌の異なる属が利用する特殊なタンパク質輸出機です。分泌機構自体が高度に保存されている一方で、エフェクタータンパク質の特殊なセットは、細胞シグナル伝達経路を操作し、特定の細菌の病原性戦略1を容易にするために、異なる細菌種間で進化してきました。 エルシニアの場合には、7エフェクタータンパク質、いわゆるYops（ エルシニア外側タンパク質）まで、宿主細胞の接触の際に転位などすなわち食作用およびサイトカイン産生、免疫細胞応答を破壊するために一緒に作用され、細菌の細胞外の生存を可能にします2-4。トランスロケーションのプロセスをしっかりと異なる段階5で制御されています。これは、T3SSの主要な活性化は、ターゲットCEとの接触によって誘発されることが確立されていますLL 6。しかし、この開始の正確なメカニズムはまだ解明されています。 エルシニアで転座のいわゆる微調整の第二のレベルは、細胞のRho GTP結合タンパク質Rac1のまたはRhoAのアップまたはダウンレギュレーション活動によって達成されます。転位しYopEのGAP（GTPアーゼ活性化タンパク質）関数は、Rac1活性をダウンレギュレートし、それに応じて負帰還型によって転位を減少するベーまたは細胞傷害性壊死因子Y（CNF-Y）でのRac1 などの活性化は、増加した転座7-9につながります機構10,11の。 有効かつ正確な方法は、転座は、 エルシニア 、宿主細胞の相互作用の間に調節する方法を調査するための前提条件です。多くの異なるシステムは、特定の利点と欠点を有するそれぞれ、この目的のために使用されてきました。いくつかのアプローチは、ウェスタンブロット分析を行った異なる界面活性剤によって感染した細胞の溶解ではなく、細菌に依存しています。目これらの方法の電子共通の欠点は、マイナーが、避けられない細菌溶解は、潜在的に細菌に関連するエフェクタータンパク質と細胞溶解液を汚染することです。しかし、細胞外エフェクタータンパク質および真核細胞の選択的溶解のためのジギトニンのその後の使用を分解するプロテイナーゼKでの細胞の処理は、この問題12を最小化するために提案されました。重要なことは、これらのアッセイは、決定的にほとんどが市販されていない高品質の抗エフェクター抗体に依存。転座を監視するために、エフェクタータンパク質とGFPなどの蛍光タンパク質の翻訳融合を使用しようとすると、おそらく蛍光タンパク質の球状三次構造と分泌13前にそれらを展開するために分泌装置のできないことに成功しませんでした。しかしCYAのような、いくつかの異なるレポータータグ（カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼ） 百日咳菌毒素 cyclolysin 14またはフラッシュのドメインタグが正常に転座を分析するために使用されました。フラッシュタグ、非常に短いテトラ（4Cys）モチーフタグは、分泌のプロセスを妨げることなく、二ヒ素色素のFlashでの標識を可能にしながら、元のアッセイではCYAの酵素活性は、細胞内の融合タンパク質の信号を増幅するために使用されます15。 ここで適用されるアプローチは、によってシャルパンティエらは 、初めて報告され、転エフェクターTEM-1β-ラクタマーゼ融合物16（ 図1A）によって蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）色素CCF4の細胞内変換に基づいています。 CCF4 / AMは、クマリン誘導体（ドナー）およびフルオレセイン部分（アクセプタ）はセファロスポリンのコアによって連結された細胞透過性化合物です。真核生物の細胞内へのパッシブエントリー時には、非蛍光性エステル化CCF4 / AM化合物を仕込み、蛍光CCF4に携帯エステラーゼにより処理され、それによって捕捉され、セル内の。 530 nmの緑色の蛍光シグナルを発するフルオレセイン部分へのFRETの405 nmの結果でのクマリン部分の励起。 β-ラクタマーゼFRETによってセファロスポリンのコアの切断後に破壊され、クマリン部分の励起は、NM at460青色の蛍光発光につながります。この方法の別の用途は、その汎用性を強調し、文献に記載されています。この方法は 、インビトロで転座の分析を可能にし、 また 、インビボで、例えば、この技術は、インビボ 17-19 に転座の標的白血球集団を同定するために、マウスの感染モデルに使用しました。信号の読み出しは、プレートリーダー、FACS分析または蛍光顕微鏡を用いて行うことができます。注目すべきは、この方法は、感染プロセス20,21の間に、生細胞の顕微鏡検査により、リアルタイムで移動を監視する可能性を提供します。ここで、レーザ走査型蛍光顕微鏡に適用したreadou蛍光シグナルのトンそれは最高の感度と精度を提供していました。具体的には、高感度の検出器と組み合わせて、ナノメートル精度で放射窓を調整する能力は、最適化された蛍光検出と最小限にクロストークを容易にします。また、この顕微鏡の設定は、転座のリアルタイムモニタリングのために適合することができ、潜在的に細胞レベルでの宿主 - 病原体相互作用の同時分析のために可能になります。 Yのこの研究転速度でエンテロコリチカ野生型株とhypertranslocator表現型10,11を示す YopE欠失変異体は、例示的に分析しました。

<table><tbody><tr><td>LB-寒天</td><td>ロス</td><td>X969.2</td><td></td></tr><tr><td>LB-ミディアム</td><td>ロス</td><td>X968.2</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ'S リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate (black, clear bottom)</td><td>Greiner Bio One</td><td>655087</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761-25G</td><td></td></tr><tr><td>LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM</td><td>Life Technologies</td><td>K1095</td><td></td></tr><tr><td>Triticum vulgaris (コムギ) FITC コンジュゲート由来レクチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4895</td><td>ピークエミッションとクロストーク測定に使用</td></tr><tr><td>V450 ラット抗マウス CD8a</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>560469</td><td>ピークエミッションとクロストーク測定に使用</td></tr><tr><td>イメゾール W イマージョンオイル&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>444969-0000-000</td><td>屈折率 = 1.3339 @ 23 &deg;C</td></tr><tr><td>TCS SP5 II 共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td>2x GaAsP-ハイブリッド検出器、4チャンネル分光計、acusto 光ビームスプリッター、電動XYステージ、調整可能なピンホール、対物レンズ 20X HC PL APO CS IMM/CORR、405&#160;nmダイオードレーザー50&#160;mW</td></tr><tr><td>Imaris 7.6ソフトウェア</td>、<td>ビットプレーン</td><td></td><td>プラグイン、ImarisXTおよびMeasurementPro、</td></tr><tr><td>MatLabコンパイラランタイム</td>、<td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr>、<tr><td>Prism 5</td>、<td>GraphPadソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

解析<em&gt;腸炎エルシニア</em&gt;エフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

病原性エルシニア属を含む多くのグラム陰性菌。真核生物の標的細胞へのエフェクタータンパク質を転位するIII型分泌系を使用します。宿主細胞の内部にエフェクタータンパク質は、細菌の利益のために細胞機能を操作します。より良い転座を測定するために、宿主細胞の相互作用、敏感かつ正確なアッセイ中のIII型分泌の制御を理解するために必要とされます。ここでは、 腸炎エルシニアエフェクタータンパク質断片（エルシニア外側タンパク質; YopE）の融合に基づくアッセイのアプリケーションを記述している。転座の定量分析のためのTEM-1β-ラクタマーゼとのアッセイは、細胞の切断に依存している浸透性のFRET染料（CCF4 / AM）転座β-ラクタマーゼ融合による。 β-ラクタマーゼによってCCF4のセファロスポリンのコアの切断後、フルオレセインへクマリンからのFRETが中断され、クマリン部分の励起は、青色蛍光発光につながります。この方法の別の用途は、その汎用性を強調し、文献に記載されています。この方法は、マウスモデルでは、例えば、インビトロでもインビボで転座の分析を可能にします。蛍光信号の検出は、FACS分析または蛍光顕微鏡は、プレートリーダーを用いて行うことができます。ここで説明するセットアップでは、異なるエルシニア変異体によるHeLa細胞へのエフェクター融合物のインビトロ転位はレーザー走査顕微鏡によってモニターされます。リアルタイムでβ-ラクタマーゼエフェクター融合によるFRETレポーターの細胞内変換を記録する堅牢な定量的な結果を提供します。ここでは、Yで増加転座を実証する、典型的なデータを示し、 エンテロコリチカ YopE変異野生型株と比較。

定量的に、標的細胞へのエフェクターの移動を分析するために記載された方法の能力を実証するために、種々の転動態を有する2つのエルシニア菌株を試験した：Y.野生型株WA-314 エンテロコリチカ （血清群O8、病原性プラスミドpYVO8 22宿す）及びその誘導体WA-314ΔYopE（pYVO8ΔYopE23を保有する WA-314）。初期の作品は、ことが示されたY.機能YopEの展示に有意に高いヨップ転率10を欠く突然変異体エンテロコリチカ 。両株はYopEおよびTEM-1β-ラクタマーゼ（PMK-BLA）17のN末端 ​​の分泌シグナルとの融合のためのベクターのエンコーディングで形質転換しました。 WA-314は、さらに、陰性対照として機能するために、それぞれのYopEオボアルブミン融合（PMK-OVA 17）のためのコードするベクターで形質転換しました。 30、60及び90分のインキュベーション時間はさらにmethod`s有効範囲aを評価す...

タイプIIIの分泌システムを介した宿主細胞へのエフェクターの転座は、グラム陰性菌の間で一般的な病原性戦略です。転座の定量分析のために、β-ラクタマーゼエフェクター融合ベースのアッセイを適用しました。エルシニア感染細胞では、ベータラクタマーゼによるFRETレポーターの変換をレーザー走査型顕微鏡を用いてモニターします。

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

本実験の全体的な目的は、Yersiniaの3型分泌装置を介した宿主細胞へのエフェクタータンパク質の移行を測定することである。これは、エフェクターTEM-1β-ラクタマーゼ融合タンパク質を発現するYersinia変異株をHeLa細胞とともにインキュベートし、エフェクター融合タンパク質をHeLa細胞内へ移行させることで達成される。第2段階として、感染したHeLa細胞に細胞透過性FRETレポーター化合物を導入し、これが細胞内のエステラーゼによって処理されて蛍光性のCCF4となり、細胞内に留まるようにする。転位したβ-ラクタマーゼによるCCF4の次なる切断によりFRETが解消され、ドナーおよびアクセプターの蛍光強度を分析するためにレーザー走査型顕微鏡で記録されます。その結果、ドナー蛍光の上昇速度という異なるキネティクスに基づき、転位したエフェクターTEM1β-ラクタマーゼ融合タンパク質の量が異なることが示されます。既存の手法に対する本手法の主な利点の一つは、CCF4化合物の細胞内処理により、転位を測定するための極めて特異的かつ感度の高いツールが得られることです。この手法は、細菌と宿主細胞の相互作用において転位がどのように微調整されるかなど、細菌の病原性分野における重要な疑問への回答に寄与します。感染の前日に、付属のテキストプロトコルに従って調製したY. enterocoliticaの形質転換株の各コロニーを、3 mLのLB培地と必要な抗生物質を含む3つの個別のバイアルに接種します。また、感染の前日に、96ウェルプレートの9つのウェルに、200 µLの培地に懸濁した15,000個のHeLa細胞を播種してプレートを準備します。感染当日に、細胞を5% CO2インキュベーターにて37 °Cで培養します。2 mLのオーバーナイト培養液を、抗生物質を含まない40 mLの新鮮なLB培地に接種します。細菌を37 °C、180 RPMのシェーカーで90分間インキュベートします。これにより、90分後に3型分泌系の発現が誘導されます。その後、培養液を新しいチューブに移し、氷上で保持します。ここから、細菌をペレットにするため、培養液を5,000 G、4 °Cで10分間遠心分離します。次に、ペレットを2～3 mLの氷冷PBSで再懸濁し、細菌懸濁液を1 mLあたり8億CFU（colony forming units）の濃度に希釈して、培養物を氷上に置きます。次に、各培養液の対応する吸光度を測定します。各菌株の細菌懸濁液を3.5 µLずつ、準備した96ウェルプレートの異なるウェルに添加し、培地をピペッティングで2回穏やかに混ぜ合わせて、感染多重度を細胞あたり約100個の細菌として、細菌を細胞上に沈殿させます。30分間隔で感染を開始し、細胞を37°C、5% CO2インキュベーター内で保持することで、タイムコース試験を行います。各感染後、最初の感染から90分が経過した時点で、HeLa細胞を除去しないように注意して培地を吸引します。その後、20 µg/mLのクロラムフェニコールおよび2.5 mMのプロニックを含むPBSを50 µL添加します。これによりエフェクターの発現が停止し、CCF4の輸出が減少します。顕微鏡観察の準備として、1 mLシリンジを用いて浸漬液をウェルの底まで広げ、連続浸漬状態を確保してください。浸漬液の中に気泡が混入しないように注意してください。次に、96ウェルプレートを顕微鏡のステージ上に移動させ、各ウェルの後の解析に適した箇所を特定します。この操作を10分以内に完了させてください。その後、各ウェルに70 µLのCF 4:00 AMローディング溶液を加えます。プレートを室温で5分間インキュベートします。次に、ローディング溶液を吸引し、20 µg/mL のクロラムフェニコールと 2.5 mM のプロニックを含む 100 µL の PBS を加えます。その後、速やかに顕微鏡観察を開始します。20倍の高開口数浸漬用対物レンズを装着し、検出器のピンホールを2.5 airy unitsまで開き、96ウェルプレートを共焦点レーザー走査ステージにセットします。次に、ドナーチャンネルとアクセプターチャンネルを同時に活性化した高感度ガリウム砒素リン検出器を選択します。8ビットのビット深度で3回のフレーム平均を行い、405 nmダイオードレーザーの10%の強度で励起させます。正確な定量化を確実にするため、両チャネルの検出器ゲインを同じ値に設定し、飽和画素が出ないようにします。次に、透過光を点灯させ、すべての代表的な視野を再確認し、校正済み自動ステージを用いて必要に応じて位置を適切に調整し、保存します。最後に、タイムラプス間隔を2分、撮影時間を2時間に設定し、画像の取得を開始します。画像取得後、ピクセル行列の算術計算が可能なソフトウェアにデータセットをインポートします。まずメニューをクリックし、「画像処理」から「ベースライン減算」を選択して、両チャネルの背景を同一のオフセットで差し引きます。次に、各チャネルを選択し、ベースライン値を入力してください。あらかじめ決定した補正係数を用いて、ドナーチャネル（チャネル1）からアクセプターチャネル（チャネル2）へのブリードスルーを補正し、そのために新しいチャネル「チャネル2プライム」を作成します。メニューをクリックし、「image processing」から「channel Arithmetics」を選択し、チャネル2から0.33倍のチャネル1を引いた絶対値を入力します。その後、元のチャネル2を削除し、ブリードスルー補正後のアクセプターチャネルが新しいチャネル2として残るようにしてください。次に、相対的なフレット係数を決定するために、ここで示されている操作で新しいチャンネルを作成します。続いて、チャンネル演算メニューに戻り、フレットチャンネルを適切に可視化するために、「チャンネル2 ÷ (チャンネル1 + チャンネル2)」を入力します。8ビット画像において、チャンネル3を255倍した4番目のチャンネル（チャンネル4）を作成します。画像プロパティメニューからチャンネルの色を変更します。チャンネル4を選択し、「mapped color」、続いて「color table file」を選択し、「jet」を指定してください。次に、チャンネル3とチャンネル4に3×3のメディアンフィルタを適用します。画像処理メニューから「smoothing」を選択することで、画像のノイズを低減できます。メディアンフィルターを適用した後、両方のチャンネルを選択し、細胞信号の定量化のために3x3x1のフィルターサイズを適用します。「Surpass View」を選択し、アイコンをクリックしてチャンネル4の細胞を検出します。「Add new surfaces」を追加します。サーフェスウィンドウで検出アルゴリズムのパラメータを定義し、2つのチェックボックスを有効にします。「関心領域のみをセグメント化する（Segment only a region of interest）」と「画像全体を処理する（process entire image）」を選択してください。最後に、領域の寸法を編集して関心領域を定義します。ソースチャネルとしてチャネル4を選択し、閾値設定メニューから「background subtraction」を選択して閾値を設定します。直径を10 µmに設定し、最小強度閾値を手動で0に、最大閾値を最大強度に設定します。面積によって構造物をフィルタリングし、最小値を187 µm²に設定します。次に、表面検出を完了させます。最後に、細胞エンティティにおけるチャンネル1のドナー蛍光強度およびチャンネル3の相対FRET係数の平均値と、それらの標準偏差を抽出します。標的細胞へのエフェクター移行を定量的に分析する本手法の能力を示すため、移行キネティクスの異なる2つのYersinia株を用いて、ドナー蛍光および相対FRET係数の両方で検討を行いました。野生型の感染細胞では、時間の経過とともに蛍光強度が増加します。予想通り、蛍光強度の最大傾斜度は感染期間と正の相関を示しており、先行研究に従い、翻訳されたベータ・ラクタマーゼの異なる濃度を区別できることが示されました。YersiniaのYOPE欠損変異体に感染した細胞は、野生型株と比較して、より急速な蛍光強度の増加を示します。興味深いことに、感染時間を90分まで延長しても、60分間の感染と比較してドナー蛍光の上昇はさらに加速しませんでした。この手順を行う際は、CCR 4化合物の処理が添加直後に開始されることに留意することが重要です。したがって、適時に画像取得を開始することが重要となります。

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Immunology and Infection

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解析

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