解析腸炎エルシニアエフェクター転β-ラクタマーゼエフェクター融合を用いて宿主細胞に

次の実験の全体的な目標は、バーニアタイプ3分泌システムを介して宿主細胞へのエフェクタータンパク質の転座を測定することです。これは、HELOC細胞へのエフェクター融合の移行を可能にするために、エフェクターTEM 1ベータラクタマーゼ融合を発現するエルシニア変異体とヒーラ細胞をインキュベートすることによって達成されます。第2のステップとして、感染したHELOC細胞に細胞透過性フレットレポーター化合物をロードし、これは細胞ESTROによって蛍光CCF 4に帯電し、それによって細胞内にトラップされます。

トランスに位置するβ-ラクタマーゼによるCCF 4の次の切断は、ドナーおよびアクセプターの蛍光強度を分析するためにレーザー走査型顕微鏡によって記録されるfreの破壊をもたらす。結果は、ドナー蛍光の上昇の異なる動態に基づくトランス位置エフェクターTEM 1ベータラクタマーゼ融合の異なる量を示しています。この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点の1つは、CCF 4化合物の細胞間プロセッシングが、転座を測定するための非常に特異的で感度の高いツールを提供することです。

この方法は、感染の1日前に細菌と宿主細胞の相互作用中に転座がどのように微調整されるかなど、細菌の病因の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。3ミリリットルのLB培地と必要な抗生物質を含む3つの別々のバイアルに、添付のテキストプロトコルに記載されているように調製したY腸ココリチカの形質転換株のそれぞれから1つのコロニーを接種します。また、感染の前日にヒーラ細胞を含むプレートを準備し、200マイクロリットルの培養培地に15, 000個の細胞を96ウェルプレートの9つのウェルに播種し、感染の日に摂氏37度の5%CO2インキュベーターで細胞をインキュベー

抗生物質を使用せずに、一晩培養した2ミリリットルを40ミリリットルの新鮮なlb培地に接種します。細菌を摂氏37度で90分間、シェーカーで180RPMでインキュベートします。これにより、90分後に3型分泌系の発現が誘導され、培養物を新しいチューブに移し、培養物を氷上に保ちます。

この時点から。5, 000 Gおよび4°Cで10分間培養物を遠心分離し、細菌をペレット化します。次に、ペレットを2〜3ミリリットルの氷冷PBSに再懸濁し、細菌懸濁液を1ミリリットルあたり8億コロニー形成単位の濃度に希釈し、培養物を氷上に置きます。

次に、各培養物の対応する光学密度を決定します。各株からの3.5マイクロリットルの細菌懸濁液を調製した96の異なるウェルに加える。培地を2回静かにピペッティングしてウェルプレートし、混合し、細胞あたり約100個の細菌の感染のモティーで細菌を細胞上に沈殿させます。

30分間隔で感染を開始し、細胞を摂氏37度の5%CO2チャンバーに保持することにより、時間経過を実行します。各感染後、最初の感染から90分後に、ヘラ細胞を一切除去せずに培地を慎重に吸引します。次に、1ミリリットルあたり20マイクログラムのクロラムフェニコールと2.5ミリモルのプロニックを含む50マイクロリットルのPBSを追加します。

これにより、エフェクターの発現が停止し、CCF 4の輸出が減少します。顕微鏡法を調製するには、1ミリリットルのシリンジを使用して、浸漬培地をウェルの底に広げて、連続浸漬を確保します。浸漬媒体に気泡を閉じ込めないでください。

次に、96ウェルプレートを顕微鏡ステージに移し、各ステージで後で分析するのに適したスポットを見つけます。このステップを10分以内に完了してください。次に、それぞれに70マイクロリットルのCF 4:00 AMローディング溶液を追加します。

プレートを室温で5分間よくインキュベートします。次に、ローディング溶液を吸引し、100マイクログラム/ミリリットルのクロラムフェニコールと2.5ミリモルのプロニックを含むPBSを2.5マイクロリットル加えます。その後、すぐに顕微鏡検査を開始します。

20倍の倍率の高開口数浸漬対物レンズを所定の位置に置き、検出器のピンホールを2.5エアリーユニットまで開き、96ウェルプレートを共焦点レーザースキャンステージに移します。次に、ドナーチャネルとアクセプターチャネルが同時にアクティブになる高感度のリン酸ガリウムヒ素検出器を選択します。8ビット深度の3倍フレーム平均化と励起は、405ナノメートルのダイオードレーザーの10%です。

正確な定量化を行うには、両方のチャンネルの検出器ゲインを同じ値に設定し、ピクセルが飽和しないようにします。次に、透過光をアクティブにし、すべての代表的な視野を再確認し、キャリブレーションされた自動ステージを使用して必要に応じて位置を十分に調整および再保存します。最後に、タイムラプスを2分、期間を2時間に設定し、画像の取得を開始します。

画像取得後、データセットをソフトウェアにインポートして、ピクセル行列の算術計算を可能にします。最初にメニューをクリックして、同じオフセットを使用して両方のチャネルの背景を減算し、次に画像処理に移動してベースライン減算を選択します。次に、各チャネルを選択し、ベースライン値を入力します。

ドナーチャネルのブリードスルーを補正し、所定の補正係数でチャネル1をアクセプターチャネルチャネル2に、この目的のために新しいチャネルチャネル2プライムを作成する。メニューをクリックし、画像処理を選択し、次にチャネル演算を選択し、チャネル2の絶対値にポイントを33回減算して入力します。その後、チャネル 1 を削除し、修正されたアクセプタ チャネルを通したブリードが新しいチャネル 2 として残ることを確認します。

次に、ここに示す操作で新しいチャネルを作成し、相対的なフレット係数を決定します。次に、チャンネル演算メニューに戻り、フレットチャンネルを適切に視覚化するために、チャンネル2をチャンネル1とチャンネル2で割ったものを入力します。8 ビット イメージで、4 番目のチャネル チャネル 4 を作成します。これは、チャネル 3 の 255 倍に相当します。

画像のプロパティメニューに移動し、チャネル4を選択し、次にマッピングされた色を選択し、続いてカラーテーブルファイルを選択し、ジェットを選択して、チャネルの色を変更します。次に、3 x 3 の中央値フィルターをチャネル 3 と 4 に適用します。これにより、画像処理メニューに入り、スムージングを選択することで、画像のノイズが減少します。

続いて中央値フィルターを選択し、両方のチャンネルを選択し、細胞シグナルを定量化するためにフィルターサイズを3×3×1に適用します。チャネル 4 のセルを検出するには、[surpass view] を選択し、アイコンをクリックします。新しいサーフェスを追加します。

サーフェスウィンドウで検出アルゴリズムパラメータを定義し、2つのチェックボックスをアクティブにします。関心領域のみをセグメント化し、画像全体を処理します。最後に、次に、ディメンションを編集して関心領域を定義します。

ソースチャンネルとしてチャンネル4を選択し、しきい値メニューに移動してバックグラウンド減算を選択してしきい値を設定します。直径を 10 マイクロメートルに、最小強度しきい値を手動で 0 に、最大しきい値を最大強度に設定します。構造物を面積でフィルタリングし、最小値を 187 平方メートルに設定します。

次に、表面検出を終了します。最後に、チャネル 1 のドナー蛍光強度とチャネル 3 の相対フレット係数の平均値と、細胞エンティティの標準偏差を抽出します。この方法が標的細胞へのエフェクター転座を定量的に解析する能力を示すために、転座速度の異なる2つのエルシニア株を、ドナー蛍光と相対フレット係数の両方を用いて研究しました。

野生型の感染細胞は、時間の経過とともに蛍光強度が増加します。予想通り、蛍光強度の最大傾きは感染の長さと正の相関があり、翻訳されたベータラクタマーゼの異なる濃度を以前の研究に従って区別できることを示しています。エルシニアYOPE欠失変異体に感染した細胞は、野生型株と比較して、より急速な蛍光強度の増加を示す。

興味深いことに、感染を90分に拡大しても、感染が60分の場合と比較してドナー蛍光の上昇がさらに加速することはありませんでした この手順を試みる際には、CCR 4化合物の処理が添加直後に開始されることに留意することが重要です。したがって、時間内に画像取得を開始することが重要です。