単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

次の実験の全体的な目標は、個々の細胞からのタンパク質分泌を高い時間的および空間的分解能で測定することです。これは、単一細胞分泌物のラベルフリーイメージングのために、ガラスカバースリップ上に金プラズモニックナノセンサーをリソグラフィーで作製することによって達成されます。第2のステップとして、センサーチップを洗浄し、自己組織化単分子膜でコーティングした後、分泌された分析種タンパク質に対して高い親和性を持つリガンドで官能基化します。

次に、細胞を機能化されたセンサーチップに組み込み、空間と時間で細胞の分泌物を測定します。その結果、個々の細胞からのタンパク質分泌物は、標識を必要とせずに空間的および時間的にマッピングできることが示されています。この方法は、パラクリンおよびオートクリンシグナル伝達経路が細胞の運動性をどのように制御するかなど、細胞間コミュニケーションの分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この手順を開始するには、ナノ構造のパターニングおよびイメージング中の電荷効果を回避するために、電子ビーム蒸着によって以前に洗浄したカバースリップに10ナノメートルのクロム薄膜を堆積させます。このスピンに続いて、乳酸エチル、メタクリル酸メチル共重合体からなる二重層レジストの第1層を2000RPMで45秒間放置します。次に、基板を室温まで冷ました後、基板を摂氏150度で焼きます。

ポリメチルメタクリレートの2番目の層を3000RPMで45秒間回転させ、基質を摂氏150度で焼きます。電子ビームリソグラフィーまたはEBLを使用した二重膜レジスト。イソプロピルアルコールまたはIPAメチルイソブチルケトン、またはMIBKを2対1の比率で開発し、IPAですすいでください。

室温で10秒間CRセブンエッチングを使用してウェットエッチングを介してナノ構造の発達領域からクロムを除去し、次いで脱イオン、蒸留蒸留水ですすいで、金堆積後に電子ビーム蒸発器を使用して基板上にチタン金膜を堆積させる。共重合体二重膜を持ち上げます。基材をアセトンに4時間浸してレジストします。

次に、走査型電子顕微鏡を用いて基板を検査し、ナノ構造の形状とサイズを確認します。得られるナノ構造は、通常、300ナノメートルのピッチで分離されます。20×20のナノ構造のアレイは、中心から中心まで30ミクロンの間隔で配置されています。

細胞イメージングのための十分なスペースを残して、一般的なチップには300のアレイが含まれます。CR 7エッチングを室温で60秒間、ウェットエッジを介して基板から除去します。次に、脱イオン蒸留水で基質をすすぎます。

次に、原子間力顕微鏡を使用してアレイのサブセットを検査し、サイズと均一性を確認します。このパターン化されたガラスカバースリップは、局在化した表面プラズマおよび共鳴チップまたはLSPRチップの洗浄と再生に適切な洗浄手順が守られている限り、複数回使用できます。300ミリで40ワットの電力でプラズマ灰を5%水素と95%アルゴンの混合物に45秒間

プラズマアッシング直後の金表面とナノ構造を官能基化します。SPOとSPCの3対1の比率からなる2成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬することによって。チップをチオール溶液に一晩放置して自己組織化単分子膜を形成した後、エタノールですすぎ、窒素ガスで乾燥させ、チップをアルミニウムの底部ピースに置いて、カスタムメイドのマイクロ流体ホルダー内にLSPRチップをロードします。

次に、この下部ピースとシリコンガスケット、および透明なプラスチック製の上部ピースの間にチップを挟み込み、4本のネジでアセンブリを固定します。一般的なSPCベースのチオールアプリケーションでは、133ミリモルEDCと33ミリモルNHSの1対1の混合物を脱イオン蒸留水に300マイクロリットルドロップコートして、SPCチオール成分のカルボキシル基を活性化します。10分間待った後、活性カルボキシル基を目的のリガンドと結合させた後、300マイクロリットルのリガンド溶液をドロップコーティングすることにより、表面を10ミリモルPBSで手動ですすぎます。

1時間待ってから、10ミリモルのPBSドロップコードで表面をすすいだ後、チップ上にPBS中の0.1モルエタノールアミン300マイクロリットルを注入して、非特異的結合を最小限に抑えます。10分間待った後、エタノールアミンを0.005%を含むPBSで洗浄します:20またはPBST20の間。次に、チップの上に石英片を配置して、メニスカスの変化に関連するデータの変動を減らします。

顕微鏡に取り付けながら、チップをPBST 20バッファーで濡らしておきます。マイクロ流体チューブをアセンブリとフローバッファーに取り付けて、定常状態に達するまで待ちます。次に、LSPRチップアセンブリを加熱ステージサンプルホルダーにしっかりと配置します。

この方法の光学設定を次に示します。ハロゲンランプからの光は、593ナノメートルのロングパスフィルターを通過して、ナノプラズモン応答に寄与しない波長を排除します。次に、光を直線偏光させ、プラズモニック金ナノ構造を励起するために、40 x 1.4の開口数対物レンズを介してサンプルを照射します。

散乱光は対物レンズによって収集され、交差した偏光子を通過して、ガラス基板からのバックグラウンド信号を低減します。50 50ビームスプリッターを収集した光路に挿入し、分光分析と画像分析を同時に行います。アセンブリと顕微鏡を少なくとも2時間平衡化させた後、ジョイスティックを使用してチップを位置合わせし、中央のアレイが分光法用の光ファイバーと位置合わせされるようにします。

ハイブリッドDOMA細胞を遠心分離で培養およびペレット化した後、それらを回収し、生存率をテストしてからLSPRチップに導入します。これに続いて、マイクロピペットを使用して、50マイクロリットルの細胞溶液をLSPRチップに手動で導入します。最後に、マイクロ流体拡散システムを使用して、溶液中の残りの細胞を新鮮な無血清培地で洗い流し、イメージング用のLSPRチップを調製します。

ここでは、正方形の配列を強調するLSPRイメージング画像と、左下のセルを強調する透過光照明画像のオーバーレイを示しています。蛍光膜色素ロッドDomineで染色された細胞であるDHPEは、糸状仮足のような伸展を示します。このような拡張がアレイと重なると、ここに示されているように、ここに示されている抗sシミック抗体の飽和溶液の導入前後のタンパク質分泌分光データに対して偽陽性となる。

この方法は、配列をキャリブレーションするために使用されます。アレイのキャリブレーションは、センサーの応答を正規化し、各実行の生体機能化プロファイルに基づいてフラクショナル占有率を決定するのに役立ちます。市販のSPR装置は、解離定数を決定するとともに、LSPRチップについて概説されているのと同じプロトコルを使用して非特異的結合に対する耐性を研究するために使用されます。

2 つの配列の正規化された値をここに示します。1つのアレイはセルから10マイクロメートル以内にあり、コントロールはセルから130マイクロメートル離れていました。コントロールアレイのフラットレスポンスに対して、細胞に最も近いアレイの正規化レスポンスが突然増加することは、分泌された抗体の局所的なバーストを示しています。

このビデオを見れば、個々の細胞からのタンパク質分泌物を高い空間分解能と時間分解能で測定する方法について十分に理解できるはずです。