Name: 単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-23T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ単一細胞からのタンパク質分泌を高い時空間分解能で測定するラベルフリーナノプラズモニックセンシング法。金ナノ構造を用いて生細胞イメージングと統合し、細胞間コミュニケーションの理解を深める。

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1.ナノ構造作製<ol><li>ナノファブリケーションのための基質として170ミクロン（1.5号）のおおよその厚さと直径25mmのカバーガラスを選択してください。 </li><li>少なくとも6時間（硫酸と過酸化水素水の比1 3）ピラニア溶液中でカバースリップを浸します。超純18.2MΩ脱イオン蒸留水（DDW）のおびただしい量のピラニア浸したカバースリップを洗ってください。 注意：ピラニア酸は、有機物質と激しく反応し、細心の注意を払って取り扱わなければなりません。 </li><li>ナノ構造のパターニングおよび撮像中電荷効果を回避するために、電子ビーム蒸着法によりカバーガラス上に堆積10nmのクロム薄膜。 </li><li>二重層の第1層が45秒間2000rpmで乳酸エチルメチルメタクリレート（MMA_EL6）共重合体からなるレジストをスピンし、次いで150℃で焼きます。その後、180℃で焼く45秒間3000rpmでポリメチルメタクリレート（950PMMA_A2）の第二の層をスピン。 </li><li>パターN二重層300μC/ cm 2の面積線量で25キロボルトの電子ビームリソグラフィ（EBL）を用いたレジスト。イソプロピルアルコール（IPA）/メチルイソブチルケトン（MIBK）で開発：2/1およびIPAですすぎます。 </li><li>電子ビーム蒸発器を用いて基板上に堆積したTi（5 nm）の/金（80 nm）のフィルム。 </li><li>金の堆積に続いて、共重合体の二重層が4時間アセトンに基板を浸漬することにより、レジストのリフトオフ。 </li><li>ナノ構造の形状及び大きさを確認するために、走査型電子顕微鏡（SEM）を用いて基板を検査し、RTで60秒間CR-7のエッチャントを用いたウェットエッチングによって基板から残りのクロムを除去した後、DDWですすぎます。 </li><li>アレイ間の細胞イメージングのための余地を残すために33ミクロンの中心の配列間隔を​​設計します。電子ビーム描画装置を用いて、300nmのピッチで配列ごとに20×20のパターンでパターンナノ構造を。各チップは、80±2.5 nmの高さと70±2.5 nmでディアメの典型的なナノ構造寸法の300の配列が含まれていますター。 </li><li>大きさや均一性を検証するための原子間力顕微鏡（AFM）を用いて、配列のサブセットを検査します。 </li><li> UV硬化性エポキシを使用して、カバーガラスの背面に、サポートリング、典型的にはシリコンを取り付けます。 </li></ol> 2.チップクリーニングと自己組織化単分子膜への応用<ol><li>洗浄のため、同一条件下で5分間、チャンバをクリーニングした後、チップ、5％水素の300ミリトール混合物中の40 Wの電力でプラズマアッシュ、45秒間95％のアルゴンを再生します。 </li><li> 1 SH-の比率（CH 2）8 -EG 3 -OH（SPO）およびアミンのいずれかを有する成分：3からなる二成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬することにより直ちにプラズマアッシング後の金ナノ構造を官能またはカルボキシル官能基、すなわち、SH-（CH 2）11 -EG 3 -NH 2（SPN）またはSH-（CH 2）11 -EG 3 -COOH（SPC）。 </li><li>チップIを残しますn個のチオール溶液をO / N自己組織化単分子膜（SAM）を形成します。 </li><li>窒素ガスをエタノールとドライでチップを洗浄します。 </li><li>必要に応じて、4℃で2週間まで官能チップを格納します。 </li><li>使用可能な状態には、選択したリガンドに応じて化学反応を用いて、リガンドとSPNまたはSPCのコンポーネントを反応させた場合（下記参照）。 注意：チップは何十回も再生され、再官能化することができます。指定されたチップは、6ヶ月から一年間に及ぶ期間のために使用することができます。指定された配列で測定スペクトルは、確実に生体機能化に続いて、プラズマアッシングにより、繰り返し再生の後に再生されます。29 </li></ol> 3.表面機能とキネティック特性評価注：リガンドとアナライトとの間の動力学的速度定数を特徴付けるために、ならびに非特異的BにSAMの耐性を研究するために商業SPR機器で官能化チップを使用してinding。流量と効率的な表面機能を可能にするマイクロ流体設計の広い範囲があります。我々は、市販のSPRを持っているので、私たちはその推奨流量を中心に標準化しました。我々は、これらの流量はすべてのSPR機器の典型的なものであるので、制限するものではないことに注意してください。すべての機能化がLSPRチップ上で直接行うことができますが、それは多重化機器があるため、私たちのLSPRマイクロ流体セットアップがないのに対し、それが私たちの作業負荷を軽減なかったため、SPR機器は必要ありません。 <ol><li>第2節で説明したように、SAMを有する市販の裸の金チップを官能。 </li><li> 10 1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）の133 mmでDDW 中のNヒドロキシスクシンイミドの33 mMの（NHS）の1：1混合物、SPCベースのSAMを使用して、1とカルボキシル基を活性化する場合分。 </li><li> 30μl/分の流速を使用して300秒間、目的の抗体/リガンドで活性化したカルボキシル基を結合。リガンドを準備中pH6のリン酸緩衝液は、典型的には、これは、分子に依存して変化し得ます。 </li><li>リガンドコンジュゲーションの後、30μL/分の速度で300秒間の不活性化工程として、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の0.1 Mエタノールアミンを流します。エタノールアミンは、非特異的結合を最小限に抑えるのに役立ちます。 </li><li>濃度の範囲を使用して、100μL/分の流速で、目的の分析物を導入し、反応速度分析ソフトウェアを用いて反応速度定数を算出します。 </li><li>非特異的結合に問題がある場合は、SPCまたはSPNにSPOの割合を増加させます。 </li></ol> 4. LSPR一般設定<ol><li>顕微鏡の設定： <ol><li>サンプルを照らすケーラーに、100Wハロゲンランプを使用してください。共鳴シフト（ 図2）に寄与しない波長を除去するために光路にロングパスフィルタ（通常は593 nmのカットオフ）を使用します。 </li><li> LSPRiデータ収集のために、40X油immersioで倒立顕微鏡を使用n個の対物レンズ（1.4 NA）と熱電は、16ビットのCCDカメラを冷却しました。 </li><li>同時に画像とスペクトルを得るために、顕微鏡の出力ポートにビームスプリッタを配置します。 </li><li> 37に温度制御された顕微鏡ステージを設定します。 Cを°と4時間平衡化。 </li><li>それぞれ、5％および95％のCO 2濃度及び湿度を調節するために顕微鏡に追加の培養アセンブリを組み込みます。 </li></ol></li><li>チップの準備と取り付け： <ol><li> SPR実験から決定された最適二成分のSAM比の第2節で説明したようにLSPRチップを官能。 </li><li>次のようにカスタムメイドのマイクロ流体ホルダー内のチップをロードします。アルミボトムピースにチップを置きます。この底部片とシリコーンガスケットと透明なプラスチックトップピースとの間のチップを挟みます。アセンブリをクランプする4本のネジを使用してください。 </li><li> 1ミックス：典型的なSPCベースチオールアプリケーションでは、1μLのコート300をドロップSPCチオール成分のカルボキシル基を活性化するために、EDCの133ミリ、DDWでNHSの33 mMとチャー。 </li><li> 10分間待ってから、手動で10mMのPBSで表面を洗い流してください。 </li><li>リガンド溶液を300μlをコーティング降下によって、目的のリガンド（典型的には、抗体または抗体断片）で活性化されたカルボキシル基をコンジュゲート。 </li><li> 30分間待ってから、手動で10mMのPBSですすいでください。 </li><li>非特異的結合を最小限に抑えるために、チップ上のコートを、PBS中の0.1Mエタノールアミンの300μLをドロップします。 10分間待ちます。 </li><li> PBSは、0.005％トゥイーン20（PBS-T20）を含有するエタノールを洗ってください。 </li><li>更衣メニスカスに関連するデータの変動を低減するために、チップの上に水晶片を置きます。 </li><li>顕微鏡に取り付けながら、PBS-T20緩衝液で濡れたチップを保管してください。 </li><li>加熱されたステージの試料ホルダーにしっかりとLSPRチップアセンブリを配置し、マイクロ流体チューブを取り付けます。 </li><li>アセンブリにマイクロ流体チューブを取り付け、府の流れffer（または細胞研究のための無血清培地）定常状態に達するまで。 </li><li>アセンブリおよび顕微鏡は、少なくとも2時間平衡化することを許可します。 </li><li>中央アレイは分光用光ファイバと整列するように、ジョイスティックを使用して、チップの位置を合わせます。分光分析データは、分光計およびスペクトル解析ソフトウェアを用いて行われます。 </li><li>ソフトウェアオートフォーカス、ツァイス明確なフォーカスまたは同等のオートフォーカス装置を用いて、実験を通じて、焦点の配列をしてください。 </li></ol></li></ol> 9E10ハイブリドーマ細胞から抗c-mycの分泌物の5 LSPRイメージング注：この研究のために使用されるハイブリドーマ細胞株は、化学的トリガーを必要とせず、構成、従って抗c-myc抗体を発現します<ol><li> C-mycのペプチドでナノ構造体を官能。これは、クローン9E10ハイブリドーマ細胞によって分泌された抗c-mycの抗体について1.77 nMでのK D値を有します 。 </li><li> complet文化ハイブリドーマ細胞5％CO 2下、37℃でT75フラスコ中、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質を含む電子成長培地。 4×10 5細胞/ mlの細胞密度を維持します。 </li><li>細胞分泌の研究のために、遠心分離によってT75フラスコからのペレット細胞は、分泌された抗体を除去し、4×10 6細胞/ mlの細胞密度を調整するためにRPMI-1640無血清培地（SFM）で2回洗浄します。 </li><li> LSPRチップにそれらを導入する前に、生存のために、細胞およびテストを収穫。 </li><li>手動マイクロピペットでLSPRチップ上に細胞溶液50μlをご紹介します。数分後に25〜50の細胞は、LSPRチップの表面に付着します。 </li><li>マイクロ流体灌流システムを用いて、新鮮なSFMに溶液中に残った細胞を洗い流します。 </li><li> 10ミクロンの範囲内、接近しているイメージングのためのLSPRアレイを選択しますが、セルと重なっていません。 </li><li>信号が分泌抗c-mycのantibに特異的であることを確実にするために、odiesは、抗体を用いたが、溶液中でのc-mycのペプチドの飽和濃度の存在によって遮断され、それらの結合部位を有する本だけでなく、抗体を用いてとせず、細胞培養培地をご紹介します。 </li><li>抗c-mycの抗体（250 nM）を、飽和溶液を用いて各実行の最後にセンサーを調整します。これは、センサの応答を正規化するのに役立ちますし、各ランの生体機能化プロファイルに基づいて部分占有を決定します。 </li><li>画像アラインメントソフトウェアを使用して、XとY方向のドリフトを修正してください。 </li></ol>

<ol><li>Ludwig, A. -K., Giebel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Small+vesicles+participating+in+intercellular+communication%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).</li>
<li>Friedl, P., Gilmour, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+migration+in+morphogenesis%2C+regeneration+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).</li>
<li>Letterio, J. J., Roberts, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+TGF-beta%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by TGF-beta.</a> Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).</li>
<li>Werner, S., Grose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+wound+healing+by+growth+factors+and+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of wound healing by growth factors and cytokines.</a> Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-fibroblast+interactions+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).</li>
<li>Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-encoded+antibody+libraries%3A+A+unified+platform+for+multiplexed+cell+sorting+and+detection+of+genes+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins.</a> Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).</li>
<li>Gazagne, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorospot+assay+to+detect+single+T+lymphocytes+simultaneously+producing+multiple+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines.</a> Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).</li>
<li>Han, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyfunctional+responses+by+human+T+cells+result+from+sequential+release+of+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).</li>
<li>Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+analysis+of+the+frequencies+and+rates+of+cytokine+secretion+from+single+cells+by+quantitative+microengraving%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving.</a> Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).</li>
<li>Ma, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clinical+microchip+for+evaluation+of+single+immune+cells+reveals+high+functional+heterogeneity+in+phenotypically+similar+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells.</a> Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).</li>
<li>Shirasaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+single-cell+imaging+of+protein+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Real-time single-cell imaging of protein secretion.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li>
<li>Milgram, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+chip+real+time+monitoring+of+B-cells+hybridoma+secretion+of+immunoglobulin%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin.</a> Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).</li>
<li>Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+trends+in+instrumental+design+for+surface+plasmon+resonance-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors.</a> Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).</li>
<li>Ermakova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+a+Few+Metallo-Protein+Molecules+Using+Color+Centers+in+Nanodiamonds%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds.</a> Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).</li>
<li>Haes, A. J., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nanoscale+optical+blosensor%3A+Sensitivity+and+selectivity+of+an+approach+based+on+the+localized+surface+plasmon+resonance+spectroscopy+of+triangular+silver+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles.</a> Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).</li>
<li>Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+spin+resonance+of+nitrogen-vacancy+centers+in+optically+trapped+nanodiamonds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).</li>
<li>Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LSPR-based+nanobiosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Today%22%5BJournal%5D)">LSPR-based nanobiosensors.</a> Nano Today. 4, 244-251 (2009).</li>
<li>Barbillon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+and+chemical+gold+nanosensors+based+on+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Gold+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance.</a> Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).</li>
<li>Endo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+label-free+detection+of+antigen-antibody+reaction+using+localized+surface+plasmon+resonance-based+core-shell+structured+nanoparticle+layer+nanochip%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip.</a> Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).</li>
<li>Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+detection+of+peptide+nucleic+acid-DNA+hybridization+using+localized+surface+plasmon+resonance+based+optical+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor.</a> Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).</li>
<li>Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+localized+surface+plasmon+resonance+biosensor%3A+First+steps+toward+an+assay+for+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease.</a> Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).</li>
<li>Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+lipid+bilayer+formation+and+lipid-membrane-mediated+biorecognition+reactions+studied+with+a+new+nanoplasmonic+sensor+template%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template.</a> Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).</li>
<li>Park, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regeneratable%2C+label-free%2C+localized+surface+plasmon+resonance+%28LSPR%29+aptasensor+for+the+detection+of+ochratoxin+A.%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A.</a> Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).</li>
<li>Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+immunoassay+by+localized+surface+plasmon+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance.</a> Nanotechnology. 21, (2010).</li>
<li>Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+cell-based+assay+using+localized+surface+plasmon+resonance+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor.</a> Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).</li>
<li>Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-+and+Nanotechnologies+for+Study+of+Cell+Secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion.</a> Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).</li>
<li>Oh, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Nanoplasmonic+Sensing+for+Cellular+Functional+Immunoanalysis+Using+Human+Blood%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood.</a> ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).</li>
<li>Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+of+Protein+Secretions+from+Single+Cells+in+Real+Time%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time.</a> Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Methodology+for+Quantitative+LSPR+Biosensing+and+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging.</a> Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+LSPR+imaging+for+biosensing+with+single+nanostructure+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution.</a> Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).</li>
<li>Raphael, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+methodology+for+quantitative+LSPR+biosensing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging.</a> Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).</li>
<li>Henn, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+single-cell+IgG+secretion+frequency+and+rates+in+human+memory+B+cells+by+CpG+DNA%2C+CD40L%2C+IL-21%2C+and+cell+division%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division.</a> Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).</li>
<li>Bramswig, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Carcinoembryonic+Antigen+Activates+Endothelial+Cells+and+Tumor+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis.</a> Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).</li>
</ol>

有益なコメントと議論をしてくれたジョージ・アンダーソンに感謝します。この研究は、海軍研究所のナノ科学研究所と全米研究評議会研究員賞の支援を受けました。

この研究で説明されているLSPRイメージング技術には、細胞分泌物を検出するための従来の方法論に比べて多くの利点があります。まず、私たちの技術の時間分解能は数秒オーダーですが、市販の代替手段であるEliSpotとして知られる免疫サンドアッセイの時間分解能は2〜3日です。7,32 その結果、 図6に示すようなタンパク質分泌速度の急激な変化を解決することができました。第二に、チップ上にアレイを分散させることで、分泌されたシグナルを空間と時間で追跡できるため、拡散ベースの細胞分泌モデルとのより厳密な比較が可能になります。さらに、 図6 に示す制御アレイのようなアレイを使用して、フォーカスドリフトなどの機器要因から通常発生する画像の全体的な変化を差し引くことができます。第三に、私たちの技術は細胞の改変を必要としません。必要に応じて、蛍光タンパク質などの一般的に使用されるタグを実験に組み込むことができますが、そのようなタグが細胞生存率または恒常性に悪影響を与える可能性があるという懸念がある場合は、私たちのアプローチのラベルフリーの性質ではそれらを必要としません。第四に、分光データを用いて、表面結合配位子の占有率に関する定量的情報を計算できることを実証しました。
金属ナノ粒子を作製するためのEBLに代わる方法は数多くあります。 しかし、EBLは、光学系と調査中のセルに最適なナノ構造とアレイの寸法を最適化するためのかなりの柔軟性を提供することがわかりました。 また、チップはプラズマ灰化によって容易に再生できるという事実も重要です。 このようにして、一般的なチップは数十回使用できます。 生体機能化の詳細は、特定の用途に合わせて変更する必要があります。 ここで提示されたプロトコルは、表面を比較的小さなc-mycペプチドリガンドで結合させました。 全抗体などの大きなリガンドは、通常、より多くの間隔を必要とするため、SPOとSPN/SPCの比率が高くなります。 いずれにせよ、生細胞実験における非特異的結合を防ぐためには、適切に形成されたSAM層が不可欠です。 一般に、分子量の大きい分析種は、LSPRによってより容易に検出されます。 したがって、その単一細胞発現では、この技術はサイトカインなどの小さなタンパク質の分泌を検出するのに適していない可能性があります。 
現在のセットアップは、個々の非接着細胞の研究に使用されています。この研究で報告された結果が直接適用できる分泌されたシグナル伝達タンパク質と小胞はかなりの数あります。 たとえば、癌胎児性抗原 (CEA) は、何十年にもわたってがんの診断マーカーとなってきました。 結腸がん細胞は数千分子/細胞/時間の割合でCEAを分泌することが知られており、分子量は180 kDaでIgG抗体を上回っています。CEA はオートクリンおよびパラクリンシグナル伝達経路に関与していると考えられていますが、これらの分泌物の時空間的性質は測定されたことはありません。 私たちの技術は、これらのシグナリングの質問に直接対処できます。この研究の拡張は、単一細胞からの CEA 分泌の時空間的性質を測定することです。33 今後の研究では、LSPRi を接着細胞の 2 次元および 3 次元細胞培養と統合することにも焦点が当てられます。 この技術は、多数の分泌タンパク質を並行して検出できる多重アレイを組み込むことにより、細胞分泌物とそれらが隣接する細胞にどのような影響を与えるかについての新しい窓を開く可能性があります。

細胞間の通信は、細胞の内側と外側の両方の多くの生理活性の調節のために不可欠です。タンパク質および小胞の様々なその後、このような分化、創傷治癒、免疫応答、遊走、および増殖などの複雑な細胞プロセスを誘発することが分泌され得る。細胞間シグナル伝達経路の1-5誤動作は、癌、アテローム性動脈硬化症を含む多くの疾患に関与しています、および糖尿病、いくつかの名前を付けます。 最適な細胞分泌アッセイは、空間的および時間的に関連するシグナル伝達経路に影響を与えることなく、目的の分泌タンパク質をマッピングすることができるべきです。このようにして、濃度プロファイルと受信細胞の応答との間の因果関係を推測することができます。残念ながら、最も一般的に使用される蛍光ベースの技術の多くは、これらの基準を満たしていません。蛍光融合タンパク質は、被検体Wをタグ付けするために使用することができセルをithinが、分泌経路を妨害することができ、又は分泌場合、定量化が困難である細胞外へ拡散グローをもたらします。蛍光immunosandwichベースのアッセイは、細胞分泌物を検出するために最も一般的に使用される技術であるが、典型的には個々の細胞の単離を必要とする。また6-11、検知抗体の導入は、典型的には、実験や抗体標識の大きさを停止または終了150kDaのIgGについては、下流のシグナル伝達に障害となっています。 これらの障害物のそれはラベルフリー技術は、画像タンパク質分泌および既存のラベルフリー技術の中で利用されるプラズモン共鳴（SPR）の表面と、局在表面プラズモン共鳴（LSPR）センサは、優れた候補であることが好ましいからである。12-17これらセンサー広くタンパク質、エキソソームおよび他のバイオマーカーの分析物結合の研究のために使用されている。LSPRの場合は18〜24、プラズモンnanostructuresガラスカバースリップ上にリソグラフィでパターン化し、標準的な広視野顕微鏡の構成を介して可視光を用いて励起することができます。それらのナノスケールのフットプリントに、ガラス基板の大部分は、25-28。例えば、生細胞の顕微鏡との統合に適した明視野でよく、これらのプローブを作製する蛍光顕微鏡のような一般的な画像化技術のために利用可能である我々は、リアルタイム測定を示しましたそれぞれ、225ミリ秒と10ミクロンの空間的および時間的解像度で官能金プラズモンナノ構造を用いて、ハイブリドーマ細胞からの抗体分泌物。基本的なチップ構成は 、図1に示されている。顕微鏡28の出力光路は、画像及びナノ構造の指定された配列の部分占有率の定量決意にファイバ光学的に結合分析装置（ 図2に使用されるCCDカメラの間に分割され）。 protoc同時に、標準的な明視野顕微鏡を用いて細胞の応答を監視しながら、本論文では、オール単一細胞分泌物のリアルタイム測定のための実験計画について説明します。学際的なアプローチは、ナノ構造体の製造、分析物の高親和性結合のためのナノ構造体の官能化、商業表面プラズモン共鳴（SPR）測定器を使用して、両方の最小化、非特異的結合と特徴づける運動速度定数の表面の最適化、細胞株の統合が含ま基板と、画像やスペクトルデータの解析へ。私たちは、この技術は、細胞の分泌物と細胞を受けたとの因果関係の時空マッピングを可能にする技術であることを期待しています。

<table><tbody><tr><td>25&#160;mm径ガラスカバースリップ</td><td>Bioscience Tools&nbsp;</td><td>CSHP-No1.5-25</td><td>&nbsp; 170&plusmn;5 &マイクロ;mは最適です</td></tr><tr><td>ポリメタクリレートメチル</td><td>Microchem</td><td>PMMA 950 A4</td><td></td></tr><tr><td>乳酸エチルメタクリレートメチル</td><td>Microchem</td><td>MMA EL6</td><td></td></tr><tr><td>電子ビーム蒸発器</td><td>Temescal</td><td>FC-2000</td><td></td></tr><tr><td>電子ビームリソグラフィー</td><td>Raith</td><td>シリーズ150</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320110</td><td></td></tr><tr><td>CR-7 クロムエッチング液</td><td>Cyantek</td><td>CR-7</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>Ultra 55</td><td></td></tr><tr><td>原子間力顕微鏡</td><td>Veeco</td><td>Nanoscope III</td><td></td></tr><tr><td>プラズマアッシングシステム</td><td>Technics</td><td>Series 85 RIE</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO)</td><td>Prochimia</td><td>TH 001-m8.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC)</td><td>Prochimia</td><td>TH 003m11n3-0.1</td><td></td></tr><tr><td>SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN)</td><td>Prochimia</td><td>TH002-m11.n3-0.2</td><td></td></tr><tr><td>表面プラズモン共鳴システム</td><td>Biorad</td><td>XPR36</td><td></td></tr><tr><td>裸の金チップ</td><td>Biorad</td><td>GLCチップ</td>単<td>層</td></tr><tr><td>1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド</td><td>Thermo</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide(NHS)</td><td>Thermo</td><td>24510</td><td></td></tr><tr><td>ペンチルアミン-ビオチン&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモ</td><td>21345</td><td></td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>ニュートラアビジン</td><td>サーモ</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>サーモ</td><td>28374</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>アクシオ オブザーバー</td><td>顕微鏡には40倍の油浸対物レンズが装備されています。><><Pecon GmbH</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>浜松</td><td>オルカR2</td><td>熱電冷却(16ビット)</td></tr><tr><td>分光計</td><td>Ocean Optics</td><td>QE65Pro</td><td></td></tr><tr><td>Spectrasuite</td><td>Ocean Optics</td><td>version1.4</td><td></td></tr><tr><td>c-myc peptide HyNic Tag</td><td>Solulink</td><td>SP-E003</td><td></td></tr><tr><td>monoclonal anti-c-myc antibody</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4439</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリドーマ細胞株</td><td>ATCC</td><td>CRL-1729</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic Antimycotic Solution (100回;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>無血清メディア RPMI 1640&nbsp;</td><td>インビトロジェン</td><td>&nbsp;11835-030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr>ロー<tr><td>ダミンDHPE</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーL-1392</td><td></td></tr></tbody></table>

単一細胞分泌物の時空間イメージング用ラベルフリー技術

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

細胞間通信は、基本的な細胞活動を維持するのに役立つ複雑なシステムの不可欠な部分です。その結果、このようなシグナル伝達の機能不全は、多くの障害につながる可能性があります。細胞間シグナル伝達を理解するためには、局所環境を乱すことなく、細胞から分泌される分子の空間的および時間的性質を研究することが不可欠です。タンパク質分泌を研究するためにさまざまなアッセイが開発されていますが、これらの方法は通常、関連するシグナル伝達経路を破壊する蛍光プローブに基づいています。この制限を克服するには、ラベルフリーの手法が必要です。
この論文では、単一細胞からのタンパク質分泌物を検出できるラベルフリーの局在表面プラズモン共鳴イメージング(LSPRi)技術の作製と応用について説明します。プラズモニックナノ構造は、標準的なガラスカバーガラス上にリソグラフィーでパターン化され、市販の光学顕微鏡で可視光を使用して励起できます。カバーガラスのごく一部のみがナノ構造で覆われているため、この技術は蛍光イメージングや明視野イメージングなどの一般的な技術を組み合わせるのに適しています。
>jove_content<このプロトコルでは、センサーのナノファブリケーションとその後の生物機能化、リガンドと分析物の結合速度論特性評価、チップと生細胞の統合、および測定されたシグナルの分析を組み込んだ学際的なアプローチが使用されています。全体として、この技術により、細胞分泌物をマッピングし、それらを近くの細胞の応答と相関させるための一般的なラベルフリーアプローチが可能になります。

典型的な生細胞分泌研究で行われて、データ収集の複数のモードがあります。 図3は、正方形の配列を強調しLSPRi画像のオーバーレイ、および左下のセルを強調表示する透過光照らされた画像を示しています。データは、典型的には、以下に説明する正規化計算のための分析物の飽和溶液を導入し、続いて3時間の期間にわたって収集されます。蛍光画像は、フィルタキューブの自動切り替えにより、データ収集ルーチンに組み込むことができます。 図4の蛍光膜色素ローダミンDHPEで染色された細胞では葉状仮足のような拡張機能（矢印）を示します。そのような拡張は、配列と重複した場合、それらは、タンパク質の分泌のための偽陽性を与えるだろう。画像の複数のモードを持つことは、そのような発生を特定するのに役立ちます。 図5は、分析前のデータ及び後方を示し、ERのc-mycの官能基化アレイに市販抗c-mycの抗体の飽和溶液（400 nM）をの導入。いいえ細胞は、この実験中に存在しませんでした。スペクトルは赤方偏移と強度の増加の両方が表示されます。二つの曲線の下の面積の差は、CCDカメラでLSPRiモードで配列された画像強度の増加をもたらします。非線形最小二乗法データ分析手法は、スペクトルから表面結合リガンドの部分占有を推測するために開発された。30,31 実験の最後に、飽和強度値（ すなわち、分数占有≈1）は次の式を使用して、各アレイについて正規化された応答を計算するために使用されます。 時刻tにおける時刻 tでの正規化された強度、実験、最終飽和強度の開始時の初期輝度、およびアレイの測定された強度である場合</eM&gt;、それぞれ。 二つの配列からの正規化された値は 、図6に示されている。一つの配列は、コントロールとして使用し、他の一方で、調査中の細胞の10ミクロンの範囲内であった細胞から130ミクロンの距離でした。コントロール配列の平坦な応答に対する細胞の相対的に最も近い配列の正規化された応答の急激な増加は、分泌された抗体の局所的なバーストを示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig1.jpg" /> 1.センサーの設計図。典型的な生細胞分泌実験のジオメトリを描いた図面。セル（青スフェロイド）がbiofunctionalized金ナノ構造体の配列が含まれているLSPRチップに上に堆積されます。ズームアップビューでは、目的の細胞分泌は、この場合には、抗体は、Y字型分子として示し、それらが表面に結合するように測定されます官能ナノ構造。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig2.jpg" /> 図2光学装置。ハロゲンランプから照射される光は、第一のロングパスフィルタ（LP）によってフィルタリングされます。光が直線的に（P1）偏光および40X / 1.4 NAの対物レンズを介して、サンプルを照明します。散乱光は、対物レンズによって収集され、交差偏光子（P2）を通過します。 50/50ビームスプリッター（BS）は、同時分光及び画像分析のために収集された光路に挿入されています。右上：300nmのピッチで区切られた9個々のナノ構造の原子間力顕微鏡画像<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig2large.jpg" target="_blank">はこちらをクリックしてください</a>この図の拡大版を表示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig3.jpg" /> 図3.生細胞LSPRi研究。Aが12の配列に囲まれた単一のハイブリドーマ細胞（左下）を示す透過光とLSPRi画像を統合しました。これは、コントラスト強調画像です。スケールバーは10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig4.jpg" /> 図4.ライブセル蛍光研究。膜色素であるローダミンDHPEで染色単一のハイブリドーマ細胞の蛍光偽カラー画像。配列は、一般的に表示されていない蛍光撮影モードでは、しかし、近くの配列はABとしてここに観察することができます右下の四角を欠いています。細胞は、細胞（矢印）から外側に拡張している触手のような拡張機能（おそらく糸状仮足や葉状仮足）が、配列から分離されることが分かります。スケールバーは10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53120/53120fig5.jpg" /> 図5.スペクトルモダリティ。抗c-mycの抗体の400 nmのソリューションを導入する前と後のc-mycの官能化された配列から得られたスペクトル。いいえ細胞は、この研究では存在しなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src= &quot;/ファイル/ ftp_upload / 53120 / 53120fig6.jpg&quot; /&gt; 図6.単一細胞分泌。15単セルのミクロンと130ミクロン離れて配置された1つ（コントロール）内に位置する配列の応答。スケールバーは10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53120/53120fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

細胞間の通信は、細胞内外の様々な生理活性を制御するために重要です。本稿では、単一細胞分泌物の時空間的な性質を測定するためのプロトコルについて説明します。これを達成するためには、学際的なアプローチは、生細胞イメージングとラベルフリーnanoplasmonic検知を統合が使用されます。

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

本実験の全体的な目的は、個々の細胞からのタンパク質分泌を高い時間的および空間的分解能で測定することです。これは、単一細胞の分泌物をラベルフリーでイメージングするために、ガラスカバースリップ上に金プラズモニックナノセンサーをリソグラフィーで作製することで達成されます。第2のステップとして、センサーチップを洗浄して自己組織化単分子膜でコーティングし、その後、分泌される分析物タンパク質に対して高い親和性を持つリガンドで機能化します。次に、細胞を機能化されたセンサーチップ上に統合し、その分泌物を空間的および時間的に測定します。その結果、個々の細胞からのタンパク質分泌を、ラベル化することなく空間的および時間的にマッピングできることが示されました。この手法は、パラクリンおよびオートクリンのシグナル伝達経路がどのように細胞運動性を制御しているかなど、細胞間コミュニケーション分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手順を開始するには、ナノ構造のパターニングおよびイメージング中のチャージアップ現象を避けるため、電子ビーム蒸着法を用いて、あらかじめ洗浄したカバーガラス上に10 nanometerのクロム薄膜を堆積させます。次に、乳酸メチルメタクリル酸共重合体からなるバイレイヤーレジストの第1層を、2000 RPMで45秒間スピンコートします。その後、基板を室温まで冷却させてから、150 degrees Celsiusでベークします。ポリメタクリル酸メチルの第2層を3000 RPMで45秒間スピンコートし、基板を150 °Cでベークします。電子ビームリソグラフィー（EBL）を用いて、この二層レジストにパターンを形成します。イソプロピルアルコール（IPA）とメチルイソブチルケトン（MIBK）を2:1の比率で混合した現像液で現像し、IPAで洗浄します。CR sevenエッチング液を用い、室温で10秒間のウェットエッチングを行い、ナノ構造が形成された領域からクロムを除去した後、脱イオン超純水で洗浄します。電子ビーム蒸着機を使用して、金蒸着に続き、基板上にチタン・金薄膜を堆積させます。基板をアセトンに4時間浸漬し、共重合体二層レジストをリフトオフします。次に、走査電子顕微鏡を用いて基板を観察し、ナノ構造の形状とサイズを確認します。得られたナノ構造は、通常300 nanometersのピッチで分離しています。20×20のナノ構造アレイは、中心間距離30 micronsの間隔で配置されています。細胞イメージングのための十分なスペースを確保し、一般的なチップには300個のアレイを配置します。室温でCR-7エッチング液を用いて60秒間ウェットエッジ処理を行い、基板から残りのクロムを除去します。その後、基板を脱イオン蒸留水で洗浄します。次に、アレイの一部を原子間力顕微鏡で検査し、サイズと均一性を検証します。このパターン形成済みガラスカバースリップは、局在表面プラズモン共鳴（LSPR）チップの洗浄および再生に適切な洗浄手順に従う限り、繰り返し使用することが可能です。5%水素と95%アルゴンの混合ガス300 mTorr中、出力40 Wで45秒間プラズマアッシングを行います。プラズマアッシング後、直ちに金表面およびナノ構造の機能化を行います。SPOとSPCを3:1の比率で混合した2成分エタノールチオール溶液にチップを浸漬させます。自己組織化単分子膜を形成させるため、チップをチオール溶液に一晩浸した後、エタノールで洗浄し、窒素ガスで乾燥させます。その後、アルミ製の底部パーツにチップを配置し、カスタムメイドのマイクロフルイディクスホルダーにLSPRチップを装着します。次に、チップを底部の部品とシリコンガスケット、および透明なプラスチック製のトップピースで挟み、4本のネジを使用してアセンブリを固定します。一般的なSPCベースのチオール適用の場合は、脱イオン蒸留水に溶解した133 millimolar EDCと33 millimolar NHSの1:1混合液300 microlitersをドロップコートし、SPCチオール成分のカルボキシル基を活性化させます。10分間待機した後、10 millimolar PBSで表面を手動で洗浄し、続いて目的のリガンド溶液300 microlitersをドロップコートすることで、活性化されたカルボキシル基をリガンドと接合させます。1時間待機し、表面を10 mMのPBSでリンスした後、非特異的結合を最小限に抑えるため、0.1 Mのエタノールアミン（PBS溶液）300 µLをチップに滴下します。10分間待機した後、0.005% Tween 20含有PBSまたはPBST 20でエタノールアミンを洗浄します。次に、メニスカスの変化に伴うデータの変動を低減させるため、チップの上にクオーツピースを配置します。顕微鏡に装着する間、チップをPBST 20バッファーで濡らした状態に保ちます。マイクロ流路チューブをアセンブリに取り付け、定常状態に達するまでバッファーを流します。その後、LSPRチップアセンブリを加熱ステージのサンプルホルダーにしっかりと固定します。本手法の光学系をここに示します。ハロゲンランプからの光は、ナノプラズモン応答に寄与しない波長を除去するため、593 nmのロングパスフィルターを通過します。その後、光は直線偏光され、40倍、開口数1.4の対物レンズを介してサンプルに照射され、プラズモン金ナノ構造を励起させます。散乱光は対物レンズで集光され、ガラス基板からの背景信号を低減するために直交ニコル（クロスニコル）を通過します。分光分析と画像解析を同時に行うため、集光光路に50:50ビームスプリッターを挿入します。装置一式と顕微鏡を少なくとも2時間静置して温度を安定させた後、ジョイスティックを使用してチップを調整し、中央のアレイを分光用の光ファイバーに合わせます。ハイブリッドDOMA細胞を培養し、遠心分離でペレット化した後、細胞を回収し、LSPRチップに導入する前に生存率を試験します。続いて、マイクロピペットを用いて細胞懸濁液50 µLをLSPRチップ上に手動で導入します。最後に、マイクロ流体灌流システムを用いて、新鮮な無血清培地で懸濁液中の残った細胞を洗い流し、イメージングに向けてLSPRチップを準備します。ここでは、正方形アレイを強調したLSPRイメージング画像と、左下の細胞を強調した透過光照明画像のオーバーレイを示しています。蛍光膜染料のrhodamine-DHPEで染色された細胞が、糸状仮足のような突起を示しています。このような突起がアレイと重なり合った場合、タンパク質分泌分光データにおいて偽陽性となる可能性があります。ここでは、cmic機能化アレイに飽和濃度のantis cmic抗体溶液を導入する前後のデータが表示されています。この手法は、アレイを校正するために用いられます。アレイの校正は、センサーの応答を正規化し、各ランのバイオ機能化プロファイルに基づいて分画占有率を決定するのに役立ちます。商用SPR装置を使用して、LSPRチップについて概説されたものと同じプロトコルを用いて、解離定数の決定および非特異的結合への耐性の検討を行います。2つのアレイから得られた正規化値がここに示されています。一方のアレイは細胞から10 µm以内に配置され、対照群は細胞から130 µm離して配置されました。対照アレイの平坦な応答に対し、細胞に最も近いアレイの正規化応答が急激に増加していることは、局所的な分泌抗体のバーストが起こったことを示しています。このビデオを視聴することで、個々の細胞からのタンパク質分泌を高空間・高時間分解能で測定する方法について、十分に理解できるはずです。

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Bioengineering

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