マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

次の実験の全体的な目標は、多電極アレイ、いわゆるmeasを使用して、器官型脊髄共培養における脊髄内接続の機能的再生を研究することです。これは、2つの横方向の脊髄スライスを測定上隣り合わせに培養して、異なる脊髄セグメント間の脊髄内接続を模倣することによって達成されます。in vitroでスライスが成長し、数日以内にin vitroで互いに対向する側面に沿って融合します。

第二のステップとして。病変は培養の異なる時間枠の後に行われ、スライスの完全な分離につながります。次に、培養物をインキュベーターに少なくとも2週間放置します。

脊髄ネットワークを再生する時間を与えるために、2つのスライス間の活動バーストは、幼い頃に病変を受けた培養物が機能再生の可能性が高いことを示しているのに対し、この能力は、後の年齢で損傷した培養物では明らかに低下しています。この技術の主な利点は、スライスのような既存の方法、膜上で培養、解離培養、またはBSAで培養されることで、エルゴンの典型的な培養物と多電極アレイの組み合わせにより、脊髄の微小環境での再生の機能的側面を直接実験的に評価できるということです。 多電極アレイを100%エタノールで2回、70%エタノールで1回、蒸留水で2回、30秒間すすぎます。乾いたら、ガラスのペトリ皿に10〜12個のアレイを入れ、アレイを摂氏120度で20分間オートクレーブした後、蓋を閉めます。

各マルチ電極アレイを別々の滅菌35mmペトリ皿に入れます。冷凍庫から冷やしたピペットを取り出します。これを使用して、150マイクロリットルの冷却した細胞外マトリックスコーティング溶液を電極の上に置きます。

ペトリ皿の蓋を閉め、アレイを室温で1時間インキュベートします。約10分後、電極上部に気泡がないか確認し、ゴムで覆われたヘラで静かに取り除きます。必要に応じて、すべての気泡が消えているかどうかを確認します。

次に、コーティング液を吸引します。出生前および胚性ニューロンに最適化された培地で消去液を洗浄し、蒸留滅菌水で2回すすいでください。すすいだら、乾くまで室温で寝

母親からの抽出直後に、斬首されたE 14ラット胚を滅菌冷やした洗浄液で満たされたペトリ皿に移します。後肢の上にメスで1回、4本の手足の上にメスで完全な横切開を行い、体から手足を取り除きます。次に、前面に切り込みを入れて、脊髄を含む背面ピースから内臓を分離します。

次に、脊髄を含む背部ピースを一度に1つずつ取り付けディスクに移し、ティッシュチョッパーを使用してコードを225〜250ミクロンの厚さに切断します。次に、刻んだティッシュに洗浄液を一滴垂らし、スライスを滅菌チルド洗浄液で満たされた35ミリメートル×10ミリメートルのペトリ皿に移します。

各スライスに残っている組織から脊髄を解剖します。背根神経節が付着したままになるように注意します。スライスを滅菌チルドウォッシュ溶液で満たされた35ミリメートル×10ミリメートルのペトリ皿に移します。

次に、スライスを摂氏4度で1時間休ませます。コーティングされたマイクロ電極アレイを内部にコーティングしたペトリ皿を実体顕微鏡の下に置きます。アレイにピントを合わせ、中央に配置します。

電極アレイ上の6マイクロリットルのチキンプラズマ液滴。小さなヘラを使用して、腹側のサイズが互いに向き合うように2つの脊髄部分を血漿液滴に慎重にスライドさせます。次に、鶏の血漿液滴の周りのトロンビンの8マイクロリットルで。

次に、ピペットチップを使用して、鶏肉、血漿、トロンビンの混合物を慎重に混合して広げます。鶏の血漿とトロンビンの混合物が糸状になりすぎて凝固し始める直前に、余分な液体を吸引し、ペトリ皿に蓋をして加湿チャンバーに入れます。チャンバーを摂氏37度のインキュベーター内に約1時間置きます インキュベーション後、サンプルに10マイクロリットルの栄養培地を慎重に加えます。

ペトリ皿に蓋をし、さらに45分間インキュベーターに戻します。次に、各マルチ電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブに入れ、3ミリリットルの栄養培地を追加します。蓋をしっかりと閉め、ローラーチューブをローラードラムに入れます。

滅菌ゴム製の先端鉗子を使用して、インキュベーター内でドラムを摂氏37度で1〜2RRP M回転させます。マルチ電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブから取り外し、実体顕微鏡下のシャーレに入れます。組織にピントを合わせ、2つのスライスが融合していることを確認します。

次に、アセンブリをしっかりと保持し、メスの刃を多電極アレイの溝に置きます。ティッシュスライスの近く。メスをかなり水平に持ち、メスのハンドルを持ち上げます。

ただし、メスの刃をアレイの溝にとどめて、ブレードが基部から先端まで転がり、組織を切り裂いて溝を覆うようにします。必要に応じて25ゲージの針先で残留組織の接続を切断し、溝内の領域でのみ作業し、柔らかいエッジには触れないでください。多電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブに戻し、3ミリリットルの新鮮な栄養培地を培養物に加えます。

次に、ローラーチューブをインキュベーター内のローラードラムに摂氏37度で戻します。多電極アレイ培養アセンブリを記録チャンバーに実装し、アレイに約500マイクロリットルの細胞外溶液を塗布します。次に、アセンブリを顕微鏡に取り付けます。

システムが安定するまで10分間待ってから、各活動検出電極からの基本的な自発的な活動を10分間記録します。録音を合計2回繰り返して、細胞外の状態が安定していることを確認してください。必要に応じて、各記録セッションの後に細胞外溶液を交換します。

厳密な9マイクロモルおよび10マイクロモルのガジンを含む細胞外溶液を適用してネットワークを脱阻害し、電気的活性を記録する前に少なくとも2分間待って、E 14ラット胚の脊髄に由来する共培養物の機能回復の可能性を調査します。病変は、in vitroで8〜28日の時間枠で実施されました。2〜3週間後、自発的なニューロン活動が記録されました。

次に、多電極アレイを使用して、生データをラスタープロットに変換し、続いてネットワークアクティビティプロットに変換して、各スライスのサイドごとに合計アクティビティを視覚化します。自発的な活動は通常、ここに示されているバーストで組織化されており、若くして分離されたスライスは機能的に接続されているように見えます。ただし、それ以上の年齢で分離された人は非同期に見えます。

この情報を使用して、さまざまな年齢のスライス間で同期されたバーストの量を、この手順に従って、ここに示すように決定および視覚化できます。免疫組織化学染色などの他の方法を実施して、2つの脊髄クォートスライス間の機能的結合に寄与する細胞の種類などの追加の質問に答えることができます。