抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

この手順の全体的な目標は、ウイルスの早期侵入の特定のステップに対する試験化合物の抗ウイルス効果を決定することです。これは、最初にウイルス感染のための宿主細胞を播種することによって達成されます。2番目のステップは、ウイルス感染と試験化合物の処理を異なる時間と温度で行うことです。

次に、薬剤処理された接種物を洗い流し、細胞を基礎培地で覆います。最後のステップは、細胞をインキュベートすることです。最終的に、ウイルス感染性を分析して、ウイルス感染の初期のウイルス侵入ステップに対する試験化合物の影響を判断します。

例えば、ルミノメーターは、レポーターウイルスによる感染による細胞スナットのルシフェラーゼ活性を評価するために使用されます。この技術の主な利点は、抗ウイルス剤、特にウイルスの侵入を標的とする抗ウイルス剤を特定する際に、よりメカニズムに基づいたアプローチを可能にすることです。まず、試験化合物であるトリロジー酸またはCHLAおよびPUNコラーゲンまたはPUGの原液を調製し、DMSOでヘパリンを陽性対照として無菌二重蒸留水に溶解し、アッセイ培養用の宿主細胞を調製します。

ヒト肝癌、HUH 7.5細胞をFBSと抗生物質を補給した新鮮なDMAMで一晩。実験全体を通してバイオセーフティレベル2の手順に従い、試験化合物の細胞毒性をテストすることを忘れないでください。基礎培地で希釈したCHLAまたはPUGの濃度を0〜500マイクロモルに増やして細胞を処理し、ネガティブコントロールとして1%DMSOとして処理し、細胞培養インキュベーターで細胞を摂氏37度で72時間インキュベー

培地を取り出し、細胞を200マイクロリットルのPBSで2回洗浄します。次に、100 μLのXT Tアッセイ試薬を加え、摂氏37度で3時間インキュベートします。次に、マイクロプレートリーダーを使用して、492ナノメートルの吸光度と690ナノメートルの参照波長を測定します。

これらの値から、特定の式での生存率を計算します。各化合物の50%の細胞毒性濃度を決定します。ウイルス不活化アッセイを開始する。

最初のプレートは、ウェルごとに10〜4番目の細胞に1回。96ウェルプレートで、細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素と一晩インキュベートし、感染のための付着を行います。テキストプロトコルで参照されているように、ガイアルシフェラーゼレポータータグ付きC型肝炎ウイルスまたはHCV粒子を準備します。

滅菌チューブに100マイクロリットルの100マイクロモルCHLAまたはPUGを100マイクロリットルの100マイクロリットルから4番目に混合します。ポジティブコントロールミックス用のHCVのフォーカス形成ユニットまたはFFU。最終濃度が1000マイクログラム/ミリリットルのヘパリンを含むHCV。

摂氏37度で3時間インキュベートします。3時間後、ウイルス化合物混合物を室温で9.8ミリリットルの基礎培地で50倍に希釈します。次に、新しいウイルス化合物混合物を調製し、この混合物を直ちに基礎培地で希釈してゼロ時間インキュベーションサンプルにします。

インキュベーション培地を細胞から取り出した後、希釈したウイルス薬液をウェルあたり100マイクロリットルを三回に分けて加えます。溶液には、ウェルごとに10〜2番目のFFUが含まれており、摂氏37度と二酸化炭素5%を3時間インキュベートして、細胞のウイルス感染を可能にします。インキュベーション後、ウイルス懸濁液をウェルから取り出し、200マイクロリットルのPBSで細胞を穏やかに洗浄します。二度。

細胞を100マイクロリットルの基礎培地で72時間インキュベートし、ウイルスの複製とルシフェラーゼレポーターの上清への放出を行います。次に、培養物とマイクロチューブからスーパーナトを収集し、摂氏4度で5分間Gの17,000倍で遠心分離します。細胞の破片を除去するには、各スーパーナット20マイクロリットルを50マイクロリットルのガウシルシフェラーゼアッセイ試薬と混合し、ルシフェラーゼレポーター活性からの発光をルミノメーターで測定します。

ウイルス付着アッセイプレートの製造元の指示によれば、ウェルごとに10〜4番目の細胞に1回です。96ウェルプレートに入れ、翌朝の細胞付着のために一晩インキュベートします。まず、細胞単層を含む96ウェルプレートを摂氏4度で1時間冷却します。

試験化合物とウイルス混合物を氷上に調製します。例えば、H-C-V-C-H-L-A-H-C-V 1%DMSOまたはポジティブコントロールHCVヘパリン溶液と10対2のFFUウイルス。各処理について、細胞培養ウェルから培地を穏やかによく吸引する。

その後、温度を上げないように注意しながら、すぐに100マイクロリットルのウイルス試験化合物混合物を三重ウェルに加えます。プレートを4°Cに保った冷蔵庫で3時間インキュベートします。ウイルス粒子は摂氏4度で細胞サービスに付着しますが、内在化されません。

次に、上清を吸引します。200マイクロリットルの氷冷で細胞を2回やさしく洗います。PBSは、各ウェルに100マイクロリットルの基礎培地を加え、摂氏37度で72時間インキュベートします。

最後に、感染細胞からの放出ルシフェラーゼレポーターを定量するため。各サンプルウェルからスーパーナットを採取し、ガウスルシフェラーゼアッセイを実施してウイルス融合と侵入をアッセイします。細胞培養プレートを摂氏4度で1時間予冷します。

細胞接着のための一晩のインキュベーション後、ウェルから既存の培地を取り出し、氷上で細胞に10〜2番目のF-F-U-H-C-Vを感染させます。プレートを摂氏4度で3時間インキュベートします。200マイクロリットルの氷冷PBSで細胞を2回優しく洗浄し、広告が付着していないウイルスを取り除きます。

次に、氷上で、基礎培地または1%DMSOをコントロールとして基礎培地に溶解した試験化合物で細胞を処理し、プレートを摂氏37度で3時間インキュベートします。これにより、摂氏37度で発生するウイルス侵入時の試験化合物の評価が可能になります。培地を吸引し、内在化されていないウイルスを200マイクロリットルのクエン酸緩衝液またはPBSで2回洗浄します。

ウェルあたり100マイクロリットルの基礎培地を加え、摂氏37度でさらに72時間インキュベートします。スーパーナートを収集し、前に示したようにガウスルシフェラーゼアッセイを実行して、放出されたルシフェラーゼレポーターを検出します。活性化では、ウイルスを感染の0時間または3時間前に試験化合物とインキュベートしました。

ウイルス感染の阻害の割合は、各治療についてプロットされます。ネガティブコントロールDMSOは阻害を示さなかった。CHLAは、接触時、ゼロ時間インキュベーション後、および3時間長いインキュベーション後に高い阻害を示します。

別のテストで追加の結果。化合物PUGは、この一般的な実験デザインを適応させて、CHLAおよびPUGが胚性肺線維芽細胞におけるヒトサイトメガロウイルスまたはHCMVの感染性をさらに阻害することが示されています。ここでは、HCVの付着に対するCHLAとPUGの影響を示します。

細胞を試験化合物の存在下または非存在下で摂氏4度でウイルスとインキュベートし、次に未結合のウイルスを除去した細胞をウイルスによる感染のために摂氏37度でインキュベートしたことを思い出してください。影付きのバーは、細胞へのHCVの侵入に対するC-H-L-A-P-U-Gまたはヘパリンの効果を示しています。この場合、ウイルスの付着は最初に摂氏4度で行われたことに注意してください。

次に、未結合のウイルスを除去した後、細胞を試験化合物と摂氏37度でインキュベートしてウイルスに侵入させました。同様に、HCMVの場合、CHLAまたはPUGによる胚性肺線維芽細胞の感染は、ウイルスの付着とウイルスの侵入を強く阻害することを示しています。この手順を試行する際は、結果の精度に影響を与える指示された温度で手順を実行することを忘れないでください。