Name: 抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶウイルス侵入阻害アッセイによる抗ウイルス化合物の評価法。ルシフェラーゼを用いてウイルス感染性を測定し、新規治療薬のスクリーニングに応用可能です。

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この研究は、台北医科大学病院(102TMU-TMUH-19)と台湾科学技術部(MOST103-2320-B-038-031-MY3)からの資金提供を受けています。

注：細胞培養​​およびウイルス感染に関連するすべての手続きが処理されたサンプルのバイオセーフティーレベルに適した認定バイオセーフティフードに行われていることを確認してください。プロトコルを説明する目的のために、ガウシアルシフェラーゼレポータータグ付きHCVモデルウイルス32として使用されます。代表的な結果との関連では、化合物chebulagic酸（CHLA）とpunicalagin（PUG）を早期にウ ​​イルスの侵入31ステップの間に細胞表面グ ​​リコサミノグリカンとウイルス糖タンパク質相互作用を標的とする候補抗ウイルス剤として使用されています。多くのウイルス30,31,33,34の進入を妨害することが知られているヘパリンは、このような状況における陽性対照処理として使用されます。基本的なウイルス学技術の背景、ウイルスの増殖、ウイルス力価の決意、そしてプラーク形成単位で感染用量（PFU）の発現のために、形成単位（FFU）、または感染（MOI）を多数集中、読者は再です35を参照するように移し。前の例と代表的な結果に示されているウイルスを使用する最適化された条件のために、読者は 、表1、図1A、図2Aに記載されている参考文献30-32,36-39などの詳細に言及されます。 1.細胞培養、化合物の調製、および化合物の細胞毒性<ol><li>分析されるウイルス感染システム（ 表1）のためのそれぞれの細胞株を成長させます。 HCVについては、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した、200 U / mlのペニシリンG、200 / mlのストレプトマイシン、および0.5 / mlの中のHuh-7.5細胞は、アムホテリシンBを成長します</li><li>それぞれの溶媒を用いて、試験化合物およびコントロールを準備する：例えば、ジメチルスルホキシド（DMSO）にCHLAとPUGを溶解します。無菌二重蒸留水にヘパリンを準備します。後続のすべての希釈のために、培養培地を使用しています。 注：最後のコンセント試験化合物治療におけるDMSOの比は、実験には1％未満です。 1％のDMSOを比較するためのアッセイで陰性対照処理として含まれています。 </li><li>そのようなXTT（2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]などの試薬 ​​を決定する細胞生存率を使用して、ウイルス感染細胞に対する試験化合物（例えば、CHLAとPUG）の細胞毒性を決定します-5-フェニルアミノ）カルボニル] -2H-テトラゾリウムヒドロキシド）。 <ol><li> HCVについては、96ウェルプレート（ウェル当たり1×10 4細胞 ）中のHuh-7.5細胞を播種し、単層を得るために、5％CO 2インキュベータO / N中で37℃でインキュベートします。 </li><li>三連で培養ウェルにDMSOコントロール（1％）または試験化合物のCHLAとPUGの濃度の増加（例：0、10、50、100、および500μM）を適用します。 </li><li>その後、72時間37℃でインキュベートし、プレート中の培地を廃棄し、二回リン酸緩衝生理食塩水を200μl（PBS）で細胞を洗浄します。 </li><li> assayin100μlのを追加Gの各ウェルにXTTベースのインビトロ毒性アッセイキットからの溶液とXTTをホルマザンの生産を可能にするために、別の3時間37℃で培養します。 </li><li> 492 nmでのテスト波長でマイクロプレートリーダーおよび690nmでの参照波長で吸光度を決定します。 </li><li>ここで、「時」と試験化合物と溶媒対照（元の吸光度を参照してください」と」、細胞生存率（％）=×100％として、/で1％のDMSO：次の式を用いて細胞の生存率を計算します。それぞれ）の治療、。製造業者のプロトコルに従って、このようなグラフパッドプリズムなどの分析ソフトウェアから試験化合物の50％細胞傷害（CC 50）の濃度を決定します。 </li></ol></li></ol>ウイルス感染の2読み出し注意：ウイルス感染の読み出しが用いられるウイルスのシステムに依存し、そのようなプラークアッセイやMEAなどの方法を含むことができますレポータータグ付きウイルスからのレポーターシグナルをジューリング。ルシフェラーゼレポーター活性に基づくレポーターHCV感染を検出するための方法について説明します。 <ol><li>感染したウェルからの上清を収集し、4℃で5分間、微量で17000×gで明らかにする。 </li><li> ガウルシフェラーゼアッセイキットからのルシフェラーゼ基質の50μlにテスト20μlの上清を混合し、直接製造元の指示に従って、ルミノメーターで測定します。 </li><li>ウイルス阻害（％）を決定するための相対的光単位（RLU）のlog 10として HCV感染を発現し、そして製造業者のプロトコルに従ってグラフパッドプリズムソフトウェアアルゴリズムを用いてHCV感染に対する試験化合物の50％有効濃度（EC 50）を計算します 。 </li></ol> 3.ウイルス不活性化アッセイ注：さまざまなウイルスの潜伏期間およびウイルス用量の例としてA図1Aに記載されている再。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。 <ol><li>シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。 </li><li>試験化合物またはコントロールインキュベート（最終濃度は以下のとおりです。CHLAを= 50μM; PUG = 50μM;ヘパリン=千/ mlの; DMSO = 1％）、37℃（ 図1AでのHCV粒子と、「長期」 ）1：1の比率。例えば、1×10 4 FFUを含む100μlのウイルス接種物に、100μMのCHLA作業希釈液100μlを追加します。これは、50μMの最終濃度でCHLA治療をもたらします。 </li><li>試験化合物の「準治療」（無効）濃度のウイルス - 薬物混合物を希釈します。例えば、HCVに対するCHLAとPUGの非有効濃度は1μM31です。故にこれは、基本培地の9.8 mlの（2％FBSでの細胞培養培地）を用いて達成することができるウイルス - 薬物混合物の50倍希釈を必要とします。 注：サブ治療濃度に希釈が、試験化合物と宿主細胞表面との間に有意な相互作用を防止し、無細胞ビリオンに対する治療効果の検討を可能にします。この希釈は、特定のウイルス感染に対する試験化合物の抗ウイルス用量応答に依存して、この特定のアッセイ31を実行する前に決定されることに留意されたいです。 </li><li>比較のために、試験化合物とウイルスを混合し、直ちにサブ治療濃度感染前に（ 図1A、「短期」）に（何の潜伏期間）を希釈していません。 </li><li> （ウイルスの量は、1×10 2 FFUになりました;最終MOI = 0.01）ホ-7.5細胞単層上に希釈したHCV-薬物混合物の100μlを添加して、ウイルスを可能にするために、37℃で3時間インキュベート吸着。 </li><li>感染後、希釈された接種物を除去し、軽く二回200μlのPBSでウェルを洗浄します。 注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します。 </li><li>各ウェルに基礎培地100μlを適用し、72時間、37℃でインキュベートします。 </li><li> 2 &#39;で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。 </li></ol> 4.ウイルスの付着アッセイ注：さまざまなウイルスの潜伏期間およびウイルス用量の例は、 図2Aに記載された「添付」されています。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。 <ol><li>シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。 </li><li> 4°C FOでプレート中の細胞単層を事前に冷やしますR 1時間。 </li><li> HCV接種（MOI = 0.01）を有する細胞と試験化合物またはコントロール共同治療（最終濃度は以下のとおりです。= 50μMCHLAを、PUG = 50μM;ヘパリン=1,000μgの/ mlの; DMSO = 1％）、4℃でのために3時間。例えば、1×10 2 FFUを含む90μlのウイルス接種物に、500μMのCHLA作業希釈液10μlを添加します。これは、50μMの最終濃度と細胞単層にMOI = 0.01でHCVによる感染でCHLA治療をもたらします。 注：これは、ウイルスの結合を可能にするが、最も効率的に、37℃で発生したエントリを排除するので、それは4℃で実験を行うことが重要です。温度を4℃に維持されることを保証するために氷と4℃の冷蔵庫で続くインキュベーションにウイルスおよび試験化合物の添加を行います。 </li><li>上清を除去し、優しく二回氷冷PBS200μlで細胞単層を洗浄します。 注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します&lt;。/ LI&gt; <li>各ウェルに基礎培地100μlを適用し、72時間、37℃でインキュベートします。 </li><li> 2 &#39;で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。 </li></ol> 5.ウイルスの侵入/融合アッセイ注：インキュベーション期間および種々のウイルスのためのウイルスの投与量の例は、 図2（a）「侵入/融合」に記載されています。ウイルスのより高い濃度もMOI / PFUを増加させることによって試験することができます。 <ol><li>シードホ- 7.5 96ウェルプレート中の細胞（ウェル当たり1×10 4細胞 ）と単層を得るために、5％のCO 2インキュベーター中、37℃でO / Nインキュベートします。 </li><li> 1時間4℃でプレート中の細胞単層を事前に冷やし。 </li><li> 3時間、4℃で、HCVを有する細胞（MOI = 0.01）に感染。例えば、1×10 2 FFUを含む100μlのウイルス接種物を使用しています。 注意：ADDIを実行氷の上でウイルス接種し、ウイルス結合ではなく、エントリを許可し、4℃、温度を維持するために4℃の冷蔵庫でその後のインキュベーション化。 </li><li>上清を除去し、優しく二回氷冷PBS200μlで細胞単層を洗浄します。 注：細胞を持ち上げ避けるために静かに洗浄液を実行します。 </li><li> （最終濃度は以下のとおりです。PUG = 50μM;ヘパリン=千/ mlの、CHLA =50μMのDMSO = 1％）の試験化合物またはコントロールでウェルを治療し、3時間37℃でインキュベートします。たとえば、メディアの90μlに500μMのCHLAワーキング希釈液10μlを加え混ぜ、ウェルを扱います。これは、50μMの最終濃度でCHLA治療をもたらします。 注：37℃〜4℃からのシフトは現在、ウイルスの侵入/融合事象を容易にし、したがって、この特定のステップの試験化合物」効果の評価を可能にします。 </li><li>薬物含有上清を吸引除去し、非内在化を削除クエン酸緩衝液（50mMクエン酸ナトリウム、4mMの塩化カリウム、pHは3.0）または200μlのPBSのいずれかで洗浄することにより細胞外ウイルス。 72時間37℃でインキュベートする前に、基礎培地100μlを適用します。 </li><li> 2 &#39;で説明したようにルシフェラーゼ活性のために上清をアッセイすることによって生じた感染を分析。ウイルス感染の読み出し」。 </li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言します。

本報告では、初期のウイルス侵入事象を解剖する機構的アプローチに基づいて抗ウイルス化合物を同定・評価する方法について説明した。具体的には、このアッセイにより、遊離ウイルス粒子、ウイルス付着、ウイルスの侵入/融合に対する試験化合物の影響を調べることができました。ウイルス侵入の初期段階に対する薬物効果を明確に評価するために、重要なステップが実施されました。たとえば、「ウイルス不活化アッセイ」では、ウイルスと薬物の混合物を治療濃度以下に希釈することで、薬物を「滴定」することにより、試験化合物と宿主細胞表面との間の有意な相互作用が防止されます。これにより、宿主細胞のその後の感染で観察される阻害効果は、宿主細胞膜またはウイルス受容体を含む膜関連分子に対する試験化合物からの効果ではなく、試験化合物と無細胞ビリオンとの間の直接的な相互作用によるものであることが保証される30。同様に、「ウイルス付着アッセイ」および「ウイルス侵入/融合アッセイ」における4°C(ウイルス結合は可能だが侵入はできない)と37°C(ウイルスの侵入/融合を促進する)の間の温度の変化は、これらの特定のイベントのそれぞれに対する試験化合物の効果を判断するために重要です。これは、感染24〜29のこれらのステップ中のエンベロープウイルスの温度感受性のために実現可能です。したがって、結果の正確性を確保するために、アッセイを指示された温度で実行することが重要です。たとえば、氷上で実験を4°Cに維持し、温度変化のためにサンプルを37°Cのインキュベーターに直接入れます。さらに、ネガティブ(例:薬物調製用のDMSO溶媒)およびポジティブ(例:ヘパリン治療)コントロールの使用も、アッセイの精度をさらに確立するのに役立ちます。このような方法の有用性と適用性は、多くの抗ウイルス研究で実証されています26、30、31、40、41。ヘパリンは、代表的な結果の文脈では3つのアッセイすべてのコントロールとして含まれていますが、通常、その後の融合/侵入ステップではなく、最初のウイルス結合をブロックします( 図2のデータに反映されているように)。ウイルスに対する中和抗体(ウイルス不活化アッセイ用)、ウイルスの細胞表面受容体をマスクする抗体(ウイルス付着アッセイ用)、膜融合阻害剤(ウイルス融合/侵入アッセイ用)など、追加のコントロールも使用できます。 
本報告書に記載されているアッセイは、ウイルス感染の初期段階に特異的であり、通常、ウイルス感染をより広範囲に標的とする一次スクリーニングからの候補薬の作用機序を特徴付けるための二次検査としての応用の観点から有用である。あるいは、ウイルス不活化剤、ウイルス付着アンタゴニスト、ウイルス侵入/融合阻害剤など、早期のウイルス侵入阻害剤を具体的に探している場合は、一次スクリーニングに組み込むこともできます。この場合、それらを使用することで、メカニズム特異的な抗ウイルス候補を特定するためのより焦点を絞った正確なスクリーニング分析が可能になり、ひいては下流の医薬品開発が迅速化されます。 
抗ウイルス剤の同定における細胞ベースのアッセイの使用は、潜在的なオフターゲット効果(細胞毒性など)の明らか化や、試験薬の生物活性への生理学的関連性の追加など、生化学的アッセイと比較していくつかの重要な利点をもたらします42。これらの問題は、候補薬剤が医薬品開発の後続の段階で継続する価値があるかどうかを判断するための重要な考慮事項です。同様に、このレポートに記載されている初期のウイルス侵入特異的アッセイにより、細胞レベルで、より具体的には実際のウイルス感染の文脈で、明確なウイルス侵入段階に対する薬物効果を調べ ることができます。したがって、このようなアッセイから得られた結果は、試験化合物の抗ウイルス効果をより適切に予測するのに役立ち、宿主細胞に対する潜在的に望ましくないオフターゲット効果を特定することもできます。ただし、潜在的な制限の1つは、 in vitro 細胞ベースのアッセイが、自然なウイルス感染のコンテキストで実際の in vivo エントリステップを完全に反映していない可能性があることです。それにもかかわらず、このプロトコルで提示されたアッセイは、新規抗ウイルス剤のメカニズムベースの同定および評価のための分析プラットフォームとして機能します。
ウイルス感染量を定量化するためのレポーターウイルスまたはレポーター細胞システムの開発により、抗ウイルス化合物の細胞ベースのスクリーニングと評価が大幅に容易になりました。例としては、レポーター遺伝子を保有する組換えウイルスの使用、または特異的ウイルスプロモーター31,43によって駆動されるレポーター遺伝子を含む組換えヒト細胞株の使用が挙げられる。本報告では、ルシフェラーゼタグ付きHCVによる感染は、レポーターシグナルを定量化することで容易にモニタリングできるため、データ解析が容易である。これらの有用なレポーターベースのツールを組み込むことにより、ここで説明する初期のウイルス侵入アッセイは、基本的に低分子ライブラリーのメカニズムベースのスクリーニングのためのハイスループット形式に適応できます。
結論として、メカニズム特異的な抗ウイルス化合物を同定および評価する手段として、初期のウイルス侵入を分析するためのアッセイのためのプロトコルが説明されました。このようなアッセイは、ウイルス侵入に対する新規の拮抗薬/阻害剤の発見に役立ち、予防的および/または治療的治療として開発のための抗ウイルス薬の範囲を拡大するのに役立ちます。

ウイルス感染は、公衆衛生に対する絶え間ない脅威であり、世界中で流行病、罹患率、および死亡の重要な原因となっています。ウイルス感染に対する具体的な制御方法には、ワクチン開発や抗ウイルス療法などがあります。ワクチンの試みはいくつかのウイルスに対する免疫に成功したことが証明されていますが、デングウイルス(DENV)、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)など、多くのウイルス性病原体は防御ワクチンを投与されていません1-5。一方、抗ウイルス薬は、予防ワクチンが利用できない場合に、これらのウイルス感染の管理に重要な役割を果たします。しかし、これまでのところ、公衆衛生を脅かすウイルス性病原体の数と比較して、認可された費用対効果の高い抗ウイルス薬はごくわずかです。さらに重要なことは、世界的な旅行の増加と急速な都市化により、非先住民地域に持ち込まれている新興/再興ウイルス感染症による流行の発生リスクによって状況が悪化していることです6。重症急性呼吸器症候群(SARS)ウイルス、インフルエンザウイルス(H1N1、H5N1、H3N2、H7N9)、DENV、ウエストナイルウイルス(WNV)、麻疹ウイルス(MV)、中東呼吸器症候群(MERS)ウイルス、エボラウイルス6-12による最近の流行は、予防接種や治療薬が利用できない場合の抗ウイルス薬開発の必要性を反映しています。また、現在使用されている抗ウイルス薬では、薬剤耐性感染症を発症するリスクが常に存在します。したがって、これらの新興/再興ウイルス感染症に対する抗ウイルス薬の継続的な開発と範囲の拡大は、より良い管理戦略を提供し、公衆衛生を保護するために必要です。
ほとんどの抗ウイルス療法は、ウイルスのライフサイクルにおける重要なステップを媒介する特定のウイルスタンパク質または補因子を標的とする直接作用型抗ウイルス薬(DAA)で構成されています。例えば、ヌクレオシド類似体であるアシクロビルはヘルペスウイルスDNAポリメラーゼを阻害し、プロテアーゼ阻害剤であるボセプレビルおよびテラプレビルはHCV NS3に拮抗し、オセルタミビルおよびザナミビルは、感染細胞からのインフルエンザウイルス粒子の放出を阻害するノイラミニダーゼ阻害剤である13〜15。しかし、HIV gp41を標的として融合を防ぐEnfuvirtideや、HIV共受容体CCR5を阻害してウイルスの侵入を防ぐMaravirocなど、認可されたウイルス侵入阻害剤はほとんどありません16。ウイルス侵入に対する新規のアンタゴニスト/阻害剤を探求することは、ウイルス感染をより良く管理するための異なる作用機序を持つ他の抗ウイルス薬との組み合わせなど、予防的または治療的使用のための追加の治療薬を提供するのに役立つ可能性があります17-19。
抗ウイルス薬の同定には、構造誘導薬の設計と候補薬のスクリーニングに基づく戦略が含まれる場合があります。試験剤の抗ウイルス活性を評価する方法には、酵素活性の生化学的アッセイおよび細胞ベースのシステムによる評価が含まれる20〜23。細胞ベースのシステムでは、ウイルスのライフサイクルを、侵入イベント(結合、融合、コーティング解除)、複製段階(ウイルスゲノム複製とタンパク質翻訳)、ビリオン出口(組み立て、成熟、放出)など、感染の異なる段階に分解できます。アッセイは、さまざまなツールや方法を使用して各特定のステージを調査するように適合させることができるため、このアプローチにより、分析された異なるステージを標的とする特定の作用機序を持つ潜在的な抗ウイルス薬候補の同定/検査が可能になります。例えば、宿主細胞に結合する前に遊離ウイルス粒子に対する薬物効果を特異的に解析するために、「ウイルス不活化アッセイ」を実施することができる。このアッセイでは、ウイルスを試験薬とインキュベートし、その後希釈して薬を滴定してから細胞単層に感染させます。ウイルスの付着や侵入/融合段階などの追加ステップも、感染中に温度をシフトすることで個別に分析できます。多くのエンベロープウイルスでは、宿主細胞膜へのウイルスの侵入/融合は37°Cで大幅に促進されますが、通常は4°Cで排除されるため、ウイルスの結合に影響を与えません24-29。最後に、レポーターウイルスまたは細胞システムを使用することで、これらの研究を容易にし、ハイスループット分析が可能になります。
私たちは以前、細胞ベースのアプローチを採用し、ウイルスの侵入に潜在的に拮抗する抗ウイルス化合物を調べるために、さまざまなエンベロープウイルスの早期侵入を分析しました30,31。本明細書では、ウイルスの不活化、ウイルス付着、およびウイルス侵入/融合アッセイを含む、使用される種々の方法が記載されている。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>GIBCO</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB</td><td>GIBCO</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>In vitro 毒性アッセイキット、XTTベースの</td><td>Sigma</td><td>TOX2</td><td></td></tr><tr><td>PBSのpH 7.4&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>89087-320</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002420</td><td></td></tr><tr><td>BioLux Gaussia ルシフェラーゼアッセイキット</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300L&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター</td><td>プロメガ</td><td>GloMax-20/20</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム、二水和物</td><td>Sigma</td><td>71402</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ</td><td>P5405</td><td></td></tr></tbody></table>

抗ウイルス化合物の同定および評価のための早期のウイルス侵入アッセイ

Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds

細胞ベースのシステムは、抗ウイルス剤の発見に役立ちます。ウイルスのライフサイクル、特に初期侵入段階を解剖することで、ウイルス侵入の特定のステップを標的とする抗ウイルス剤を特定および評価するためのメカニズム的アプローチが可能になります。本報告では、C型肝炎ウイルスをモデルとして、これらの目的のための抗ウイルスアッセイとして、ウイルスの不活化、ウイルス付着、ウイルス侵入・融合の検討方法について述べる。これらのアッセイは、新規のアンタゴニスト/阻害剤の早期ウイルス侵入の発見に有用であり、さらなる医薬品開発のための候補抗ウイルス剤の範囲を拡大するのに役立つはずです。

図1では 、「ウイルス不活性化アッセイは、「2つの特定の天然化合物CHLAとPUGは、細胞のない状態で別のエンベロープウイルスを不活性化し、その後の感染を防止することができるかどうかを調べるために行きました。細胞毒性化合物及びこれらの化合物の抗ウイルス用量応答は、従来の機構的研究31を実行することに決定しました。ウイルスは、試験化合物で前処理し、その後、ウイル​​ス薬の混合物は、各ウイルスシステムのそれぞれの細胞単層に接種する前に、副治療濃度に希釈しました。 図1に示すように 、CHLAとPUG両方がその後の感染から細胞単層を保護不可逆的効果をもたらす、無細胞ビリオンと相互作用するように思われました。 80％ブロックMV及びRSVに対して観測された - 60に対し2つの試験化合物は、HCMV、HCV、およびDENV-2に対してほぼ100％の阻害を達成しました。これらの結果はsuggEST CHLAとPUGは、それらを不活性化し、その感染性を中和することにより、これらの無料のウイルス粒子に直接的な影響を持っていること。 図2では 、添付ファイル、および侵入/融合アッセイは、HCMV、HCV、DENV-2、MV、およびRSVからこれらの初期のウイルスの侵入関連イベントに対してCHLAとPUGの影響を調査するために実施しました。 CHLAとPUGの両方が効果的に得られたウイルス感染の阻害（：灰色のバーを点灯図2、「添付ファイル」）によって示されるように、それぞれの宿主細胞に調査し、ウイルスの結合を防ぎます。 100％ -両方の化合物によるウイルスの添付ファイルに対する抑制効果は90に至るまで、HCMV（ 図2B）、HCV（図2C）、DENV-2（図2D）、およびRSV（ 図2F）に対して同様でした。一方、PUGはTWの阻害率と、（ 図2E）結合MV CHLAに対してより効果的であると思われました80％ - O化合物は、50の間で変化します。多くのウイルスの侵入を阻止することが知られている制御処理ヘパリンもまた、阻害さHCMVの付着、DENV-2、RSV、広告MVが、HCVに対してあまり効率的でした。その後の「ウイルスの侵入/融合アッセイは、「CHLAとPUGは、ウイルスの侵入/融合相中にその活性を保持しているか否かを調べた（ 図2、「侵入/融合」：暗い灰色のバー）。それぞれの細胞単層の90％保護効果- 50を得、 -ここでも、CHLAとPUGの両方を効果的に（F図2B）を調べ、ウイルスのウイルスの侵入/融合ステップを損なうことが観察されました。 DENV-2のヘパリンも強力に阻害侵入/融合およびRSV感染症が、HCMV、HCV、及びMV（平均の&lt;40％阻害）に対してあまり有効でした。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>このウイルス</td><td>細胞型</td></tr><tr><td> HCMV </td> &lt;TD&gt; HEL </td></tr><tr><td> HCV </td><td>ホ - 7.5 </td></tr><tr><td> DENV-2 </td><td>ベロ</td></tr><tr><td> MV </td><td> CHO-SLAM </td></tr><tr><td> RSV </td><td> HEp-2 </td></tr></tbody></table> 表1：ウイルス感染のための宿主細胞型の代表的な結果で説明した各ウイルス感染システムに用いられる細胞型が示されています。細胞に関するさらなる詳細は、参考文献31に見出すことができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig1.jpg" /> 図1.試験化合物のCHLAとPUGによるウイルス感染の不活性化の異なるウイルスが長期間にわたって試験化合物で処理した。（1.5インキュベート-滴定前に3時間、ライトグレーの棒グラフ）または短期間（すぐに希釈し、濃い灰色サブ治療concentraに希釈前の37℃でのバー）ると、各宿主細胞に感染のその後の分析最終ウイルス濃度（左図）実験（A）回路図（PFU /ウェルまたはMOI）、長期ウイルス薬のインキュベーション期間（I）および（ii）その後のインキュベーション時間は、右側のテーブル内の各ウイルスのために示しました。 （B）HCMV、（C）HCVの分析は、（D）DENV-2、（E）MV、及び（F）RSVは、各追加のパネルに示されています。結果は、3回の独立した実験からの平均（SEM）の標準誤差±手段は、ウイルス感染のDMSO陰性対照処理と示されたデータに対してプロットされています。この図は、参照31から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53124/53124fig2.jpg" /> 図2.ウイルスの付着および侵入/融合に対する試験化合物のCHLAとPUGの抗ウイルス活性の評価。（A）実験手順、ウイルス濃度（PFU /ウェルまたはMOI）、および試験化合物との付加及び処理の時間（I、II、III）は回路図および関連する表に各ウイルスのために提示されています。ウイルス付着分析（薄い灰色の棒）において、異なる細胞型の単層を、4℃でそれぞれのウイルスおよび試験化合物と同時処理し、その後、1時間4℃で予め冷却した（1.5 - 3時間; I）その後のインキュベーションのために接種し、および試験化合物を洗浄する前に、（37℃; ii）及びウイルス感染の検査。ウイルスの侵入/融合分析（濃い灰色の棒）で、シードされた細胞の単層は、1時間4℃で予備冷却し、次いで1.5 4℃でそれぞれのウイルスでチャレンジ - 3時間（I）。次いで、細胞を洗浄し、温度がウイルス侵入/融合事象を促進するために37°Cに移行した時に追加のインキュベーション期間のための試験化合物（II）で処理しました。インキュベーションの終わりに、細胞外のウイルスは、いずれのクエン酸緩衝液（pH 3.0）またはPBS洗浄によって除去し、細胞をさらにウイルス感染の分析のために（III）でインキュベートしました。 （B）HCMV、（C）HCVについての結果は、（D）DENV-2、（E）MV、及び（F）RSVは、各追加のパネルに示されています。データは、ウイルス感染のDMSO陰性対照処理に対してプロットされており、3つの独立した実験からの平均±SEMとして示されます。この図は、参照31から変更されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53124/53124fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、新規抗ウイルス剤を特定し評価するために、ウイルス侵入の特定のステップを調べるプロトコルを提示します。

Cell-based systems are useful for discovering antiviral agents. Dissecting the viral life cycle, particularly the early entry stages, allows a mechanistic ...

本手順の全体的な目的は、ウイルス侵入の初期段階における特定のステップに対する試験化合物の抗ウイルス効果を判定することです。まず、ウイルス感染用の宿主細胞を播種します。次に、異なる時間および温度条件下で、ウイルス感染と試験化合物の処理を行います。次に、薬剤処理した接種物を洗い流し、細胞に基礎培地を添加します。最後のステップは、細胞をインキュベートすることです。最終的に、ウイルスの感染性を分析し、ウイルス感染の初期エントリー段階に対する試験化合物の影響を判定します。例えば、ルミノメーターを用いて、レポーターウイルスによる感染後の細胞におけるルシフェラーゼ活性を評価します。この手法の主な利点は、抗ウイルス剤、特にウイルスの侵入を標的とする薬剤を特定する際に、よりメカニズムに基づいたアプローチが可能になることです。まず、試験化合物であるtrilogy acidまたはCHLA、およびPUNIC collagenまたはPUGのストックソリューションをDMSOで調製します。陽性対照として用いるheparinは、滅菌二回蒸留水に溶解させます。次に、アッセイ用に宿主細胞を培養し、準備します。ヒト肝細胞癌HUH 7.5細胞を、FBSおよび抗生物質を添加した新鮮なDMAM中で一晩培養します。被験化合物の細胞毒性を試験する間は、実験全体を通してバイオセーフティレベル2の手順に従ってください。細胞に、基礎培地で希釈した0から500 µMまでの濃度勾配のCHLAまたはPUGを添加するか、陰性対照として1% DMSOを添加し、その後、細胞培養インキュベーターを用いて37 °Cで72時間インキュベートします。培地を除去し、200 µLのPBSで細胞を2回洗浄します。次に、100 µLのXT Tアッセイ試薬を加え、37 °Cで3時間インキュベートします。その後、マイクロプレートリーダーを用いて、参照波長690 nm、測定波長492 nmでの吸光度を測定します。これらの値から、所定の計算式を用いて生存率（%）を算出します。各化合物の50%細胞毒性濃度を決定します。ウイルス不活化アッセイを開始します。最初のプレートでは、ウェルあたり1×10⁴個の細胞を播種します。96ウェルプレートを用い、細胞を37°C、5% CO₂条件下で一晩インキュベートし、感染のための接着を促します。テキストプロトコルに従い、Gaiaルシフェラーゼレポーター標識ヘパティティスCウイルス（HCV）粒子を調製します。滅菌チューブ内で、100 µMのCHLAまたはPUGを100 µLと、10⁴ FFU（Focus forming units）のHCVを100 µL混ぜ合わせ、ポジティブコントロールミックスを作成する。HCVを、最終濃度が1000 µg/mLとなるようにヘパリンと共に混合する。37°Cで3時間インキュベートします。3時間後、ウイルス化合物混合液を室温で9.8 mLの基礎培地を用いて50倍に希釈します。次に、新たなウイルス化合物混合液を調製し、0時間インキュベーション用のサンプルとして、この混合液を直ちに基礎培地で希釈します。細胞から培養液を除去した後、希釈したウイルス薬剤溶液を1ウェルあたり100 µLずつ、3連（triplicate）で加えます。これにより、各ウェルには10² FFUが含まれることになります。37 °C、5% CO₂条件下で3時間インキュベートし、細胞へのウイルス感染を行います。インキュベーション後、ウェルからウイルス懸濁液を除去し、200 µLのPBSで細胞を2回、穏やかに洗浄します。ウイルスの複製および上清へのルシフェラーゼレポーターの放出のため、細胞を100 µLの基礎培地で72時間インキュベートします。その後、培養液およびマイクロチューブから上清を回収し、4°Cで17,000 ×gで5分間遠心分離します。細胞残渣を除去するため、各上清20 µLにGaussiaルシフェラーゼアッセイ試薬50 µLを混合し、ルミノメーターを用いてルシフェラーゼレポーター活性による発光を測定します。ウイルス付着アッセイプレートの製造元の指示に従い、96ウェルプレートの各ウェルに1×10⁴個の細胞を播種し、細胞を接着させるため一晩インキュベートします。翌朝、細胞単層を含む96ウェルプレートを4°Cで1時間冷却します。テスト化合物とウイルス混合液を氷上で調製します。例えば、1% DMSOを含むH-C-V-C-H-L-A-H-C-V溶液、または10² FFUのウイルスを含むHCVヘパリン陽性対照溶液などです。各処理について、細胞培養ウェルから培地を穏やかに吸引します。その後、温度が上昇しないように注意しながら、ウイルス試験化合物混合液 100 µLを3つのウェルに加えてください。プレートを4 °Cに維持した冷蔵庫内で3時間インキュベートします。ウイルス粒子は4 °Cで細胞表面に吸着しますが、内部に取り込まれることはありません。次に、上清を吸引します。氷冷したPBS 200 µLで細胞を2回緩やかに洗浄し、各ウェルに基礎培地 100 µLを加え、37 °Cで72時間インキュベートします。最後に、感染細胞からのルシフェラーゼレポーターの放出量を定量します。各サンプルウェルから上清を回収し、ウイルス融合および進入を評価するためにガウスルシフェラーゼアッセイを行います。細胞培養プレートを4 °Cで1時間予冷しておきます。細胞を接着させるため一晩インキュベーションした後、ウェルから既存の培地を除去し、氷上の10² FFU-HCVを細胞に感染させます。プレートを4 °Cで3時間インキュベートします。非吸着ウイルスを除去するため、氷冷PBS 200 µLを用いて細胞を2回静かに洗浄します。次に、氷上で、基底培地に溶解した試験化合物またはコントロールとして1% DMSO含有基底培地を用いて細胞を処理し、プレートを37°Cで3時間インキュベートします。これにより、37°Cで起こるウイルスの侵入に対する試験化合物の影響を評価できます。培地を吸引し、内部に取り込まれていないウイルスを200 µLのクエン酸緩衝液またはPBSで2回洗浄します。各ウェルに100 µLの基礎培地を加え、37 °Cでさらに72時間インキュベートします。上清を回収し、放出されたルシフェラーゼレポーターを検出するために、前述の通りガウスルシフェラーゼアッセイを行います。以下に、試験化合物がHCVに及ぼす影響を示します。活性化においては、ウイルスを感染させる前に、試験化合物とともに0時間または3時間インキュベートしました。各処理におけるウイルス感染の抑制率をプロットした。陰性対照であるDMSOでは抑制は見られない。CHLAは、インキュベーション0時間の接触直後および3時間の長期インキュベーション後のいずれにおいても、高い抑制能を示している。別の試験による追加の結果を以下に示します。この一般的な実験デザインを適用し、化合物PUGについて検討したところ、CHLAおよびPUGが胚肺線維芽細胞においてヒトサイトメガロウイルス（HCMV）の感染性をさらに抑制することが示されました。また、HCVの付着に対するCHLAおよびPUGの影響をここに示します。細胞をテスト化合物存在下または非存在下でウイルスと共に4 °Cでインキュベートし、その後、未結合のウイルスを除去して、ウイルスに感染させるために37 °Cでインキュベートしたことを思い出してください。網掛けのバーは、C-H-L-A-P-U-GまたはヘパリンがHCVの細胞内への侵入に及ぼす影響を示しています。この場合、ウイルスの付着をまず4 °Cで行ったことに注意してください。次に、未結合のウイルスを除去した後、ウイルス侵入のため、細胞を試験化合物とともに37°Cでインキュベートした。同様に、HCMVの場合、胚肺線維芽細胞への感染において、CHLAまたはPUGによる処理は、ウイルスの付着および侵入を強く抑制することを示している。この手順を行う際は、結果の正確性に影響するため、指示された温度で各ステップを実施することが重要である。

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