代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で

本実験の全体的な目的は、drosophila melanogasterを用いたメタボローム解析に十分な量のミトコンドリア代謝物を得るために、濃縮ミトコンドリア画分を回収することです。まず、ミトコンドリア濃縮画分から十分な代謝物を生成できるよう、十分な数のハエを飼育します。次に、ハエをガラス製のテフロン製ダウンズホモジナイザーでホモジナイズし、ミトコンドリアの完全性を損なうことなく細胞膜を破壊します。

次に、ホモジネートを分画遠心分離にかけ、濃縮されたミトコンドリアサンプルを調製します。その結果、本プロトコルを用いることで、ミトコンドリア濃縮画分および個体全体の抽出液を用いたメタボローム解析のみでは検出されなかった、顕著なミトコンドリア代謝の変化が検出されました。個体全体のメタボローム解析と比較した本手法の主な利点は、メタボローム解析の前にミトコンドリアを単離することで、感度が向上し、ミトコンドリア代謝物の変動を検出できることです。

実験を開始するために、フライフードの原材料をホットプレートで90 °Cに加熱します。混合液が均質になり、わずかに粘度が出るまで定期的に撹拌してください。フードを加熱源から取り外し、フードが80 °Cまで冷却されたら、95% Ethanolに溶解した0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoateを加え、時々撹拌します。次に、フードを2等分します。

餌の温度が50 °Cまで下がったことを確認し、エタノールに溶解した50 mM rapamycin 1.1 mLを1つ目の分量に、未処理のエタノール 1.1 mLを2つ目の分量にそれぞれ加えて撹拌します。成虫を回収するには、シングルステージレギュレーターを使用して、高圧タンクから純粋な二酸化炭素を供給します。5 psiの連続フローにおいて、プラスチックチューブを用いて二酸化炭素を500 mLのろ過フラスコに導き、チューブで二酸化炭素を水に通してバブリングさせることで、静電気の発生を防ぎます。

そのためには、1つの穴が開いたゴム栓を使用してフラスコを密閉します。プラスチックチューブをフラスコの側面の開口部から二酸化炭素パッドに接続し、発育中の幼虫密度を制御します。25組の親を培養ボトルに入れ、48時間卵を産ませます。

次に、卵の密度を調節するために親を排除し、出現したF1世代を用いてこれらの手順を繰り返し、この密度制御を2世代にわたって行います。密度制御条件下で2世代を経た後、ハエを雌雄に分け、パッドの上に置く時間は10～15分以内に留めます。実験条件に置く前に、麻酔から回復させるため24時間静置します。

ミトコンドリア濃縮画分を得るのに十分な代謝物を生成するため、サンプルあたり300匹のハエを指定します。150匹のハエを手製の1リットルケージに移します。次に、残りの150匹のハエを別の1リットルケージに移します。ケージ1つあたり150匹を超えて過密にしないでください。

実験条件ごとに6つの反復サンプルを使用し、ケージを25 °C、12時間の明暗サイクルで保持してショウジョウバエの飼育を完了させる。餌の品質を維持するため、2〜3日ごとに5 mLの餌を入れたバイアルを用いて新鮮な餌を供給し、合計10日間飼育する。1 mLの冷却した分離バッファーを満たしたガラス製テフロンホモジナイザーに、1つのケージからハエを移し替えることで分離を開始する。

次に、ミトコンドリアを維持するために乳鉢を氷上に置き、ハエを15回ストロークしてホモジナイズします。乳棒をひねらないように注意しながら、ホモジナイズ液を1.5 milliliterチューブに移し、4 °Cで300 ×g、5分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、さらに4 °Cで6,000 ×g、10分間遠心分離してミトコンドリアを濃縮します。

遠心分離後、細胞質画分を含む上清を廃棄します。ピペッティングにより、ペレットを300 µLの洗浄バッファーで再懸濁します。2回目の洗浄についても、前述の手順を同様に、穏やかに行います。

次に、両方のケージから再懸濁したペレットをクライオジェニックマイクロ遠心チューブにまとめ、4 °Cで10分間、6,000 ×gで遠心分離します。上清を捨て、ペレットを液体窒素で急速凍結させます。最後に、ミトコンドリア濃縮画分を-80 °Cで保存します。

このウェスタンブロットは、ミトコンドリア分画におけるミトコンドリアの効率的な分離を示す指標となる、ミトコンドリア膜輸送タンパク質poinの濃縮を示しています。poinタンパク質は細胞質分画では検出されず、一方で細胞質の微小管タンパク質であるtubulinタンパク質はミトコンドリア分画では検出されなかったことから、細胞質タンパク質の混入が最小限であることが示されました。主成分分析（PCA）は、マススペクトル分析から得られた値をBradford法によるタンパク質濃度で正規化し、対数変換を行い、各化合物の最小観測値で補正した値を用いて作成されました。

完全な代謝物プロファイルを用いてPCAプロットを作成した。標準的なショウジョウバエ全抽出物から得られたネイティブ株および破壊株のミトコンドリアDNA代謝物プロファイルをPCAプロットで比較した。ミトコンドリア濃縮抽出物の代謝物プロファイルは、PC軸2に沿って完全に分離しており、ラパマイシン処理による主効果を反映している。代替M-T-D-N-A遺伝子型間の差はわずかであった。

対照的に、ミトコンドリア濃縮抽出物のメタボロームプロファイルでは、通常食を摂取した野生型M mt DNA遺伝子型と、他の3つのサンプル（ラパマイシンを投与した野生型MTD NA、および通常食またはラパマイシン食を投与した代替型MTD NA）との間で分離が見られます。これは、代替型MTD NAの効果が、ラパマイシン処理による効果と同様にメタボロームプロファイルを変化させることを示唆しています。本プロトコルを実施する際は、レプリケート間のばらつきを抑えるため、すべての抽出操作を同じ日に行うことが推奨されます。

サンプル調製の品質を向上させるため、事前に計画を立て、バイアルにラベルを貼り、繰り返し操作の間の待機時間を記録しておくことを推奨します。