Name: 代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製でショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: 学ぶミトコンドリア富化画分の調製法。ショウジョウバエを用いて差動遠心分離によりミトコンドリアを分離し、代謝物シフトの検出感度を向上させる。全個体解析では検出困難な微妙な代謝変化を明らかにする手法です。

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この作業は、アデルフィ大学の教員開発助成金とNIGMSからの助成金R15GM113156からEVCに授与された助成金、NIGMSからの助成金R01GM067862、およびDMRに授与されたNIAからの助成金R01AG027849によって支援されました。

1.試薬およびソリューション<ol><li>フライ食品やメディアの準備<ol><li>熱フライ成分90℃に設定したホットプレートで水にw / vの0.79パーセント寒天11％の砂糖、2％自己消化酵母、5.2％のコーンミール、。均質やや密な混合物が得られるまで定期的に攪拌します。各食品を飛ぶmlの5と100バイアルの合計フライ食品の550ミリリットルの最終容量を準備します。 </li><li> 、加熱源から削除食品がダウン80℃に冷却するまで、時々攪拌し、95％エタノールに溶解した0.2％tegosept-4-ヒドロキシ安息香酸メチルを加えます。 </li><li> 2等量の食品を分割します。他のボリュームへの1つのボリュームとエタノール1.1 mlにエタノールに溶解したラパマイシンの50mMの1.1ミリリットルを追加します。ラパマイシンおよび食品へのエタノール溶液を攪拌します。温度が薬を追加する前に、50℃に低下していることを確認してください。 </li></ol></li><li>分離バッファ<ol><li>単離緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの3-（N &lt;500mlのを準備します/ em&gt;のモルホリノ）プロパンスルホン酸（MOPS）および1mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、2.5 mg / mlのウシ血清アルブミン（BSA）]水に。 </li><li>水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。 </li><li>ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。 </li></ol></li><li>洗浄バッファー<ol><li>水で洗浄緩衝液[225mMのマンニトール、75mMのスクロース、10mMの塩化カリウム、10mMのトリスHClおよび5mMのKH 2 PO 4]の500ミリリットルを準備します。 </li><li>水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2に調整します。初期のpHが酸性になります。 </li><li>ソリューションを殺菌し、4℃でそれを保存するために、0.22μmの細孔径を有する滅菌フィルターの保存瓶を使用してください。 </li></ol></li></ol> ショウジョウバエ株の2飼育<ol><li> 、開発中の幼虫密度を制御培養瓶に両親の25組を配置し、それらが48時間の卵を産むことを可能にします。 </li> &lt;LI&gt;卵の密度を調整するために48時間後の親オブジェクトを削除します。 </li><li>繰り返しは、新興のF1子孫を使用して、2.1と2.2の手順ので、この濃度制御の二世代が達成されます。 </li><li>大人を収集するには、二酸化炭素（CO 2）と性別によって別々に使用してハエを麻酔。 <ol><li> 5 PSIの連続的な流れで高圧のタンクから、純粋なCO 2を配信するために単段レギュレータを使用してください。静電気を避けるために、水を用いてフラスコをフィルタリング500ml中にCO 2を触媒するためにプラスチックチューブを使用します。 </li><li>フラスコを密封するために一つの穴にゴム栓を使用してください。 CO 2パッドにフラスコの側方開口部を接続するためのプラスチック製のチューブを使用してください。 </li><li> 10〜15分を超えないためのパッドでハエを置きます。実験条件でそれらを配置する前に24時間、麻酔から回復できるようにします。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの濃縮された画分のための十分な代謝物を生成するには、サンプルあたり300ハエを使用しています。ここでは、女性を使用していますが、genderは他の実験では異なる場合があります。自家製1Lの人口統計ケージに150ハエを転送します。バイアル中のフライ食品の5ミリリットルへのアクセスを許可します。 </li><li>別の1リットルケージに残りの150ハエを転送します。 150以上のハエでケージを人口過剰にするしないでください。 </li><li>実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用してください。全動物の抽出物は、動物全体の1サンプルを生成するために、より多くの代謝物を得ているので隔離し、転送50女性は1ケージに飛びます。ミトコンドリアの分離株については、実験条件ごとに6つの複製サンプルを使用しています。 </li><li> 12時間の光と12時間の暗のサイクルで25℃でのケージを置きます。 </li><li>食品の品質を維持するために、食品の5 mlのバイアル中で2〜3日ごとに新鮮な食品を提供します。 </li><li> 10日間の食品のハエを維持します。このステップは、ラパマイシン処理7のために必要とされます。他の治療法や条件が異なります。 </li></ol>ミトコンドリア画分の3の単離<ol><li> 1ケージ（150ハエ）からハエをダンプ冷却した単離緩衝液1mlを充填したガラス - テフロンダウンスホモジナイザー。 </li><li>ダウン15ストローク用乳棒アップとを移動させることにより、均質化します。無傷ミトコンドリアを維持するために氷の上にモルタルを続けます。 </li><li> 4℃で5分間、300×gで1.5mlチューブと遠心分離機にホモジネートを転送します。 </li><li>ミトコンドリアを濃縮するために4℃で10分間6000×gで上清および遠心してください。 </li><li>上清を細胞質画分を含んでいるので、上清を廃棄または別の実験のためにそれを使用しています。洗浄バッファー300μlの中にペレットを再懸濁。 </li><li>第2のかご用3.5 - を繰り返して、3.1を繰り返します。極低温マイクロチューブの両方でケージの再懸濁したペレットを組み合わせます。 </li><li> 4℃で10分間、6,000×gで遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、液体窒素中でペレットをフラッシュ凍結。 </li><li> -80℃以下の温度で濃縮されたミトコンドリア画分を保管してください。 <ol><li>また、動物全体の事前のためのparation、極低温マイクロチューブに大人を配置します。 -80℃以下の温度で液体窒素や店舗成人のバイアルをフラッシュ凍結。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Scheffler, I. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheffler%2C+IE+%22Mitochondria+%28Scheffler%2C+Mitochondria%29%22">Mitochondria (Scheffler, Mitochondria)</a>. , Wiley-Liss. 484(2007).</li>
<li>Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria--a+nexus+for+aging%2C+calorie+restriction%2C+and+sirtuins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria--a nexus for aging, calorie restriction, and sirtuins.</a> Cell. 132 (2), 171-176 (2008).</li>
<li>Raimundo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+pathology%3A+stress+signals+from+the+energy+factory%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+molecular+medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial pathology: stress signals from the energy factory.</a> Trends in molecular medicine. 20 (5), 282-292 (2014).</li>
<li>Embley, T. M., Martin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+evolution%2C+changes+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic evolution, changes and challenges.</a> Nature. 440 (7084), 623-630 (2006).</li>
<li>Lane, N., , <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLane%2C+N+%22Power%2C+Sex%2C+Suicide%3A+Mitochondria+and+the+Meaning+of+Life%22">Power, Sex, Suicide: Mitochondria and the Meaning of Life</a>. 368, Oxford University Press. USA. (2006).</li>
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<li>Zhu, C. -T., Ingelmo, P., Rand, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G%C3%97G%C3%97E+for+Lifespan+in+Drosophila%3A+Mitochondrial%2C+Nuclear%2C+and+Dietary+Interactions+that+Modify+Longevity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetics%22%5BJournal%5D)">G×G×E for Lifespan in Drosophila: Mitochondrial, Nuclear, and Dietary Interactions that Modify Longevity.</a> PLoS genetics. 10 (5), e1004354(2014).</li>
<li>Madala, N. E., Piater, L. A., Steenkamp, P. A., Dubery, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+statistical+models+of+metabolomic+data+reveals+different+metabolite+distribution+patterns+in+isonitrosoacetophenone-elicited+Nicotiana+tabacum+and+Sorghum+bicolor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Multivariate statistical models of metabolomic data reveals different metabolite distribution patterns in isonitrosoacetophenone-elicited Nicotiana tabacum and Sorghum bicolor cells.</a> SpringerPlus. 3, 254(2014).</li>
<li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+Studies+Of+Mammalian+Tissues+I+.+Isolation+Of+Intact+Mitochondria+From+Rat+Liver+Some+Biochemical+Properties+Of+Mitochondria+And+Submicroscopic+Particulate+Material%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cytochemical Studies Of Mammalian Tissues I . Isolation Of Intact Mitochondria From Rat Liver Some Biochemical Properties Of Mitochondria And Submicroscopic Particulate Material.</a> Journal of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nature protocols. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Corcelli, A., Saponetti, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+isolated+in+nearly+isotonic+KCl+buffer%3A+focus+on+cardiolipin+and+organelle+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria isolated in nearly isotonic KCl buffer: focus on cardiolipin and organelle morphology.</a> Biochimica et biophysica acta. 1798 (3), 681-687 (2010).</li>
<li>Roede, J. R., Park, Y., Li, S., Strobel, F. H., Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+mitochondrial+phenotyping+by+high+resolution+metabolomics%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Detailed mitochondrial phenotyping by high resolution metabolomics.</a> PloS one. 7 (3), e33020(2012).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

このプロトコルの中で最も重要なステップは次のとおりです：1）豊かな空間に十分なハエを飼育します。これは、150以上のハエそれぞれと人口統計ケージを人口過剰にするしないことが非常に重要です。 2）食品の競争と栄養ストレスを避けるために頻繁にケージの食品を変更します。 3）ミトコンドリア画分の単離の間に整合性を確保するために4℃ですべてのサンプルを維持します。また、単離緩衝液、洗浄緩衝液、および使用前にガラステフロンダウンスホモジナイザーを冷却することをお勧めします。濃縮されたミトコンドリアの派閥のサイトゾル汚染を低減するために、ステップ3.5からのミトコンドリアペレットを、洗浄緩衝液で洗浄することができます。 濃縮されたミトコンドリア分画からの代謝物の抽出は、複製試料（6反復/実験条件）の高い番号が必要です。合計で、24のケージは 、図1及び2のために使用されます。我々は、すべての抽出を行うことをお勧めします実験的な変動性を減少させるために同じ日amples。実現可能なものの、このプ...

この手順の目標は、 キイロショウジョウバエを用いたメタボロミクス研究のために十分なミトコンドリア代謝物を得濃縮されたミトコンドリア画分を開発することです。我々の経験では、全細胞抽出法を用いたメタボロミクス解析は、 ショウジョウバエの微妙なミトコンドリアの代謝産物の変化を検出することができません。しかし、従来メタボロミクス解析にミトコンドリア分画、ミトコンドリア代謝産物シフトを同定するための感度を増加させます。 ミトコンドリアは、細胞が正常な機能1に必要なエネルギーの90％を提供する責任細胞小器官です。近年では、ミトコンドリアが単にアデノシン三リン酸（ATP）を産生するよりも細胞および生物機能においてはるかにダイナミックな役割を果たし、現在は代謝恒常性2,3の調節のためのハブとして認識されていることが認識されています。ミトコンドリアは、DISいる内共生プロセスの結果であります着色した微生物の系統は、15億年前の4〜合併しました。ミトコンドリアは、真の細胞小器官へと進化したように、内部共生からの遺伝子は、新興核ゲノムに組み込まれました。 37遺伝子は酸化的リン酸化5の酵素複合体のサブユニットであるミトコンドリアのタンパク質をコードする13の、ミトコンドリアDNAに残したままの動物では、今日、約1,500ミトコンドリアタンパク質は、核コードです。ミトコンドリアおよび核コンパートメント間の調整は、適切なミトコンドリア機能を維持するために必要とされます。 ここに記載された方法を用いて、我々は、ミトコンドリアと核ゲノムとの間の調整の操作から生じるショウジョウバエにおけるミトコンドリアの代謝変化を検出することができました。私たちは、その姉妹種DからするのmtDNAにショウジョウバエのひずみを使用しましたシミュ単一D.上に配置しました核背景6 メラノ 。この「中断」mitonuclear遺伝子型はDの 「ネイティブ」、または共進化mitonuclear遺伝子型と比較しましたそのネイティブDに同じ核ゲノムを運ぶメラノミトコンドリアDNAをメラノ 。 D.ショウジョウバエとD.シミュの mtDNAsは〜100アミノ酸とmitonuclear通信7,8に影響を与える &gt; 500同義置換により異なります。私たちは、薬理学的なストレスに応答して代謝物のシフトを研究するために全体のフライを抽出し、ミトコンドリアの濃縮された抽出物を生成しました。ここでは、ミトコンドリアに富む画分を使用した場合、我々はDを運ぶネイティブ、共同発展の遺伝子型との間にミトコンドリアの代謝物の顕著なシフトを検出することを示しますショウジョウバエの mtDNAs と D を運ぶ破砕遺伝子型シミュのmtDNA。対照的に、これら2つの遺伝子型の間で代謝産物の変化は、全体のハエ抽出物を利用する通常の方法を用いて微妙です。したがって、この方法はmtDNAsがでミトコンドリアの変化を仲介する方法を理解するためのパスを提供しました異なる薬剤への応答。

<table><tbody><tr><td>0.2% テゴセプトメチル 4-ヒドロキシ安息香酸</td><td>VWR</td><td>AAA14289</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792799</td><td></td></tr><tr><td>マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-モルフォリノ) プロパンスルホン酸 (MOPS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38057&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES3098T-B7</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>ハエを麻酔するためのCO2パッド</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>1 L ケージ</td><td>Web レストラン ストア</td><td>999RD32</td><td></td></tr><tr><td>1 L ケージ蓋</td><td>Web レストラン ストア</td><td>999LRD</td><td></td></tr><tr><td>ガラス テフロン ドンス ホモジナイザー&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>NC9661231</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>ラパマイシン&nbsp;</td><td>LCラボラトリーズ&nbsp;</td><td>R-5000</td><td></td></tr><tr><td>抗ポリン</td><td>MitoSciences</td><td>MSA03</td><td></td></tr><tr><td>抗アルファ チューブリン</td><td>開発研究 ハイブリドーマ バンク</td><td>12G10</td><td></td></tr><tr><td>ピアス BCA タンパク質アッセイ キット&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>CO2パッド</td><td>Tritech Research, Inc</td><td>MINJ-DROS-FP</td><td></td></tr><tr><td>フィルターフラスコ</td><td>enasco</td><td>SB08184M</td><td></td></tr><tr><td>ゴム栓</td><td>enasco</td><td>S08512M</td><td></td></tr></tbody></table>

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で<em&gt;ショウジョウバエ</em

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

ミトコンドリアはアミノ酸代謝、炭水化物代謝、脂肪酸酸化に関与しているため、ミトコンドリア機能の欠陥は、これらの複雑な病気に苦しむ人々の生活を危険にさらすことがよくあります。ミトコンドリアの代謝変化を検出することは、ミトコンドリアの障害と薬理学的薬剤に対するミトコンドリアの応答を理解するために不可欠です。ミトコンドリア代謝は代謝調節の中核ですが、ミトコンドリア代謝の微妙な変化の検出は、全生物または全組織抽出を使用して得られる他の細胞質代謝産物の過剰発現によって妨げられる可能性があります。
ここでは、ショウジョウバエの顕著なミトコンドリア代謝変化を検出した単離法について説明しています。これは、全ハエとミトコンドリア濃縮製剤の間で区別されます。この分析法の感度を示すために、遺伝的に多様なミトコンドリアDNA(mtDNA)を持つショウジョウバエのセットを使用し、それらをラパマイシンという薬剤に曝露しました。この方法を用いて、ラパマイシンがミトコンドリアの遺伝子型依存的にミトコンドリア代謝を修飾することを示しました。しかし、これらの変化は、代謝物がミトコンドリアに富んだ画分から抽出された場合のメタボロミクス研究では、はるかに明確です。対照的に、全組織抽出物は、mtDNAとは無関係に、薬物ラパマイシンによって媒介される代謝変化のみを検出しました。

プロトコルを使用して上記で説明し、我々は発散mtDNAs 7にラパマイシン薬物の効果をテストするために、ミトコンドリアの濃縮された画分および全動物抽出物にメタボローム解析を行いました。私たちは、フライ食品で薬物を溶解することにより、ラパマイシンの200μMを配信しました。ハエは、10日間ラパマイシンに曝露しました。全フライ抽出物からのミトコンドリア抽出物からの代謝産物は、標準的な溶媒抽出方法を用いて、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC / MS）および液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（LC / MS / MS）を用いて得ました。 図1は、ミトコンドリア画分中のミトコンドリア濃縮の指標として、膜輸送タンパク質ポリンの濃縮を示しています。ポリンタンパク質は、細胞質ゾル画分に検出されませんでした。逆に、チューブリンタンパク質は、ミトコンドリア分画、suコマンドでは検出...

ミトコンドリアは、代謝と恒常性の調節において中心的な役割を果たしています。生物の生理機能に影響を与えるミトコンドリア代謝の微妙な変化は、全生物メタボロミクス研究で検出するのが難しい場合があります。ここでは、Drosophila melanogasterの微妙な代謝変化の検出を強化する単離法について説明します。

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

本実験の全体的な目的は、drosophila melanogasterを用いたメタボローム解析に十分な量のミトコンドリア代謝物を得るために、濃縮ミトコンドリア画分を回収することです。まず、ミトコンドリア濃縮画分から十分な代謝物を生成できるよう、十分な数のハエを飼育します。次に、ハエをガラス製のテフロン製ダウンズホモジナイザーでホモジナイズし、ミトコンドリアの完全性を損なうことなく細胞膜を破壊します。次に、ホモジネートを分画遠心分離にかけ、濃縮されたミトコンドリアサンプルを調製します。その結果、本プロトコルを用いることで、ミトコンドリア濃縮画分および個体全体の抽出液を用いたメタボローム解析のみでは検出されなかった、顕著なミトコンドリア代謝の変化が検出されました。個体全体のメタボローム解析と比較した本手法の主な利点は、メタボローム解析の前にミトコンドリアを単離することで、感度が向上し、ミトコンドリア代謝物の変動を検出できることです。実験を開始するために、フライフードの原材料をホットプレートで90 °Cに加熱します。混合液が均質になり、わずかに粘度が出るまで定期的に撹拌してください。フードを加熱源から取り外し、フードが80 °Cまで冷却されたら、95% Ethanolに溶解した0.2%TE decept methyl four hydroxy benzoateを加え、時々撹拌します。次に、フードを2等分します。餌の温度が50 °Cまで下がったことを確認し、エタノールに溶解した50 mM rapamycin 1.1 mLを1つ目の分量に、未処理のエタノール 1.1 mLを2つ目の分量にそれぞれ加えて撹拌します。成虫を回収するには、シングルステージレギュレーターを使用して、高圧タンクから純粋な二酸化炭素を供給します。5 psiの連続フローにおいて、プラスチックチューブを用いて二酸化炭素を500 mLのろ過フラスコに導き、チューブで二酸化炭素を水に通してバブリングさせることで、静電気の発生を防ぎます。そのためには、1つの穴が開いたゴム栓を使用してフラスコを密閉します。プラスチックチューブをフラスコの側面の開口部から二酸化炭素パッドに接続し、発育中の幼虫密度を制御します。25組の親を培養ボトルに入れ、48時間卵を産ませます。次に、卵の密度を調節するために親を排除し、出現したF1世代を用いてこれらの手順を繰り返し、この密度制御を2世代にわたって行います。密度制御条件下で2世代を経た後、ハエを雌雄に分け、パッドの上に置く時間は10～15分以内に留めます。実験条件に置く前に、麻酔から回復させるため24時間静置します。ミトコンドリア濃縮画分を得るのに十分な代謝物を生成するため、サンプルあたり300匹のハエを指定します。150匹のハエを手製の1リットルケージに移します。次に、残りの150匹のハエを別の1リットルケージに移します。ケージ1つあたり150匹を超えて過密にしないでください。実験条件ごとに6つの反復サンプルを使用し、ケージを25 °C、12時間の明暗サイクルで保持してショウジョウバエの飼育を完了させる。餌の品質を維持するため、2〜3日ごとに5 mLの餌を入れたバイアルを用いて新鮮な餌を供給し、合計10日間飼育する。1 mLの冷却した分離バッファーを満たしたガラス製テフロンホモジナイザーに、1つのケージからハエを移し替えることで分離を開始する。次に、ミトコンドリアを維持するために乳鉢を氷上に置き、ハエを15回ストロークしてホモジナイズします。乳棒をひねらないように注意しながら、ホモジナイズ液を1.5 milliliterチューブに移し、4 °Cで300 ×g、5分間遠心分離します。上清を別のチューブに移し、さらに4 °Cで6,000 ×g、10分間遠心分離してミトコンドリアを濃縮します。遠心分離後、細胞質画分を含む上清を廃棄します。ピペッティングにより、ペレットを300 µLの洗浄バッファーで再懸濁します。2回目の洗浄についても、前述の手順を同様に、穏やかに行います。次に、両方のケージから再懸濁したペレットをクライオジェニックマイクロ遠心チューブにまとめ、4 °Cで10分間、6,000 ×gで遠心分離します。上清を捨て、ペレットを液体窒素で急速凍結させます。最後に、ミトコンドリア濃縮画分を-80 °Cで保存します。このウェスタンブロットは、ミトコンドリア分画におけるミトコンドリアの効率的な分離を示す指標となる、ミトコンドリア膜輸送タンパク質poinの濃縮を示しています。poinタンパク質は細胞質分画では検出されず、一方で細胞質の微小管タンパク質であるtubulinタンパク質はミトコンドリア分画では検出されなかったことから、細胞質タンパク質の混入が最小限であることが示されました。主成分分析（PCA）は、マススペクトル分析から得られた値をBradford法によるタンパク質濃度で正規化し、対数変換を行い、各化合物の最小観測値で補正した値を用いて作成されました。完全な代謝物プロファイルを用いてPCAプロットを作成した。標準的なショウジョウバエ全抽出物から得られたネイティブ株および破壊株のミトコンドリアDNA代謝物プロファイルをPCAプロットで比較した。ミトコンドリア濃縮抽出物の代謝物プロファイルは、PC軸2に沿って完全に分離しており、ラパマイシン処理による主効果を反映している。代替M-T-D-N-A遺伝子型間の差はわずかであった。対照的に、ミトコンドリア濃縮抽出物のメタボロームプロファイルでは、通常食を摂取した野生型M mt DNA遺伝子型と、他の3つのサンプル（ラパマイシンを投与した野生型MTD NA、および通常食またはラパマイシン食を投与した代替型MTD NA）との間で分離が見られます。これは、代替型MTD NAの効果が、ラパマイシン処理による効果と同様にメタボロームプロファイルを変化させることを示唆しています。本プロトコルを実施する際は、レプリケート間のばらつきを抑えるため、すべての抽出操作を同じ日に行うことが推奨されます。サンプル調製の品質を向上させるため、事前に計画を立て、バイアルにラベルを貼り、繰り返し操作の間の待機時間を記録しておくことを推奨します。

preparation-mitochondrial-enriched-fractions-for-metabolic-analysis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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ヒト胚性幹細胞のミトコンドリア複合体活性の状態調査

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この手順では、成体マウスの脳ミトコンドリア関連のER膜またはMAMSとMAMSとミトコンドリア調製物からスフィンゴ糖脂質に富むマイクロドメイン画分から単離する方法を示しています。...

ミトコンドリア関連のER膜（MAMS）とスフィンゴ糖脂質マイクロドメインエンリッチド（GEMS）：マウス脳から単離

ミトコンドリアの機能制御メカニズムを完全に理解するためには、ミトコンドリアの構造と機能の関係の分析が必要です。この論文では、生きたショウジョウバエの卵巣と固定された卵巣のミトコンドリアの構造と機能を研究するための具体的な方法について説明し、実証しています。...

ミトコンドリアの構造と機能の研究にショウジョウバエ卵巣

このプロトコルではシリアル セクション電子線トモグラフィーのショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリアの構造を解明への応用を示す.

シリアル セクション電子線トモグラフィーによるショウジョウバエ間接飛翔筋のミトコンドリア微細構造 3D

本稿で、ショウジョウバエのグリセリン thoraxes...

ショウジョウバエのティッシュの最小限の量を使用してのグリセリンの繊維でミトコンドリアの酸素消費量の測定

ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS) のためのショウジョウバエ幼虫サンプル準備-メタボロミクスをベース

ショウジョウバエ幼生及び成体脳における細胞外酸性化と酸素消費量の測定のためのプロトコルを提案します。代謝のアナライザーは、適応し、最適化されたプロトコルで利用されています。マイクロ組織拘束このプロトコルの重要なコンポーネント設計し、特にこの分析での使用のために作成します。...

キイロショウジョウバエ幼虫と大人の脳の代謝解析

最近の進歩にもかかわらず、多くの酵母ミトコンドリアタンパク質は依然としてその機能が全く知られていません。このプロトコルは、タンパク質の分子機能の解明の基礎であったタンパク質の局所的な局在を決定するための、シンプルで信頼性の高い方法を提供します。...

出芽酵母サッカロミセスセレビシエにおけるサブソキアドタンパク質の局在化の評価

ここでは、マウス骨格筋からのミトコンドリア単離の詳細な方法と、その後のマイクロプレートベースの呼吸数アッセイを用いた酸素消費速度(OCR)による呼吸の分析について説明する。このパイプラインは、ミトコンドリア代謝に対する複数の環境的または遺伝的介入の影響を研究するために適用することができる。...

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

ここでは、PINK1B9欠損変異ショウジョウバエの生体エネルギーを解析するための高分解能肺活量測定プロトコルを紹介します。この分析法では、基質-アンカプラー-阻害剤-滴定(SUIT)プロトコルを使用します。...

ショウ ジョウバエのmelanogaster PINK1B9-Null変異体のミトコンドリア機能の解析(高分解能スピロメトリー)

学ぶミトコンドリア富化画分の調製法。ショウジョウバエを用いて差動遠心分離によりミトコンドリアを分離し、代謝物シフトの検出感度を向上させる。全個体解析では検出困難な微妙な代謝変化を明らかにする手法です。

代謝分析のためのミトコンドリア富化画分の調製で

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