Name: 二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: 学ぶBiFC-PALM顕微鏡法でU2OS細胞におけるRas-Rafタンパク質相互作用をナノスケールで可視化する方法。この技術はがんシグナル伝達経路の理解を進め、単一分子レベルの動態解析に応用できる。

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著者は、有益な議論をしてくれたSteven Chu博士とJoe W. Gray博士、BiFC-PALMプロジェクトに関する彼の最初の仕事を提供してくれたHenry Marrに感謝します。そして、彼女の技術支援に対してはAlexis Shoemakerに感謝します。この作業は、OHSUからX.N.へのスタートアップ資金によってサポートされています。Nan研究室での研究は、NIH 5U54CA143836-05、Damon Runyon Cancer Research Foundation、M. J. Murdock Charitable Trust、およびFEI社の支援も受けました。

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著者らは開示するものは何もない。

PALMはそのまま生物学的試料のナノスケールイメージングを可能にし、最近の単一分子の超解像顕微鏡技術である間BIFCは、細胞内でのPPIを検出し、可視化するために一般的に使用される技術となっています。手のひらでBIFCの組み合わせは、ナノメートルの空間分解能と単一分子感度で、細胞内のPPIの選択的イメージングを達成しました。 BIFC-PALMは、両方の技術の有用性を拡張し、この作品で実証されたように、それらの天然の細胞コンテキストでのPPIの分子の詳細を明らかにすることで大きな期待を示しています。具体的には、ナノメートルの分解能は、生物医学研究の課題であった分子スケールで特定のPPIの空間的および時間的規制の詳細な調査を可能にします。前述したようにしかし、BIFC-PALMは、相補性と低速発色団成熟の不可逆性によって制限されます。 分割PAmCherry1は原理を示すために使用されたUBIFC-PALMのtility。 PAmCherry1が広く、優れた光物理的特性のためにPALM実験に使用されています。 PPIに結合されたときにBIFCプローブとしてPAmCherry1を使用...

タンパク質-タンパク質相互作用薬（PPI）は、生物学1の基本である、しっかりと多くの時間と長さスケール全体の時空間的機構を介して調節されています。細胞膜上の細胞シグナル伝達に対する研究は、例えば、特定のPPIおよび細胞プロセス2を容易に動的な、ナノスケール空間区画を明らかにしました。したがって、十分な空間的・時間的解像度、高い特異性、高感度で生物学的システムでのPPIを調査する能力は、生物学のメカニズムの理解を達成するための鍵です。 二分子蛍光相補（BIFC）は、細胞内の分解能でセル内のPPIを可視化するためのいくつかの既存のツールの一つであり、生細胞の互換性3から5 を 。技術は比較的簡単であり、2つの非蛍光フラグメントに蛍光タンパク質の分裂を伴います。遺伝的に2つの相互作用するタンパク質にタグ付けされたときに近接させ、フラグメントは、蛍光シグナルを生じる、完全な蛍光タンパク質を形成するように再構成することができます。適切に設計すると、BIFCプローブは自発的にのPPIの不存在下で再構成してはいけません。このように、BIFCアッセイにおける蛍光シグナルは、高い特異性でのPPIの直接可視化を可能にするのPPIの存在下で生じます。読み出しとして蛍光を使用することのさらなる利点は、とりわけ、高いスループットと高含有量スクリーニングアッセイ、と高感度、細胞内の解像度、および互換性があります。これらの利点のために、異なる親蛍光タンパク質に基づくBIFCプローブの数が開発されています。従来の光学顕微鏡法に基づいて、すべての他の検出手法のように、しかしながら、BIFCの空間分解能は、光の回折による〜250nmのに限定されています。これは、ナノスケールでのPPIの調節を研究するための挑戦になり、先に言及したと脂質ラフト6 aで例示されるようにします、NDラスナノクラスター7は 、そのようなシグナル伝達などの多くの細胞プロセスを理解するための重要な長さスケールです。 BIFCはPPIの10を撮像するための空間分解能でこの制限を克服するために、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）8,9と組み合わされています。 PALMは、確率論的活性化し、単一の蛍光分子のsubdiffractiveローカライズを通じて蛍光イメージングでの回折限界を回避する最近の超解像顕微鏡技術です。各作動サイクルでは、蛍光分子は、数千光子に数百を放射し、検出器上の単一分子の画像を生じます。画像は、回折限界（幅〜250 nm）であるが、その重心は、典型的には、検出された光子の数に応じて10〜50ナノメートルのオーダで、非常に高い精度で判定することができます。試料中の各蛍光分子を活性化し、局在化することにより、高解像度画像を再構成することができます。 Performe生細胞上のD、単一のセル11からのタンパク質の拡散軌跡の数千の単一分子追跡（smt-）PALMさらに許可取得。重要なのは、Palmは確率的な活性化を達成するために、このような光活性化蛍光タンパク質（PA-のFP）などの特殊な蛍光プローブを使用しています。 BIFCとPalm用の蛍光タンパク質の両方ので、それらは、アミノ酸159と160の間に2つの断片に、Palm用PAmCherry1、一般的に使用されるPA-FPを分割して組み合わせました。 分割PAmCherry1に基づいBIFCシステムは、2つの断片の自発的な再構成からの低バックグラウンドシグナルを示しています。遺伝的に相互作用するタンパク質のペアにタグ付けすると、2つの断片を（RN =は1から159残基; RC =メット+残基160から236）であっても37℃、より低い温度でインキュベートすることなく、完全なPAmCherry1タンパク質を形成するために、効率的に再構成し、これそのような親mCherryを13などの他のBIFCペア12には当てはまりません。 Furthermo再、再構成PAmCherry1タンパク質は、高コントラスト比、正確な単一分子の局在化と高解像度のPALM画像化のために重要である他、間中光子収量、高速光活性化、などの親PAmCherry1の光物理的特性を、保持していました。 このプロトコルでは、分割PAmCherry1（ 図1A）を用いて、U2OS細胞中のRas-Rafの相互作用を撮像するBIFC-PALMの使用が記載されています。最初のステップは、PAmCherry1フラグメント（ すなわち 、RN及びRC）と目的タンパク質との間の融合タンパク質を発現するための構築物を設計することです。理論的には、候補タンパク質（A及びB）の対ごとに、融合タンパク質の8組をテストするために存在する：RN-A / RC-B。 RN-A / B-RC。 RC-A / RN-B; RC-A / B-RN; -RN / RC-B; -RN / B-RC。 -RC / RN-B;そしてA-RC / B-RN。このプロセスは、しばしば考慮候補タンパク質の構造的または生化学的特性を取ることによって簡略化することができます。 Rasの場合には、タンパク質であります翻訳後のC末端CAAXボックスで変更された（C =システイン、A =脂肪族; X =任意の）、その後、AAXモチーフが切断されます。したがって、RNまたはRCは、RasのN末端に融合することができます。これは、4つ（ 図1B）への融合タンパク質のペアの数を減少させます。 Rafは、Rasの結合ドメイン（RBD;残基51から131）が使用され、両端にタグを付けることができます。これら4融合構成が生成されました：RN-KRAS / RC-RafのRBD。 RN-KRAS / RafのRBD-RC。 RC-KRAS / RN-RafのRBD。 RC-KRAS / RafのRBD-RN。 さらに、フラグメントおよび目的のタンパク質との間のリンカーを考慮する必要があります。約10アミノ酸の柔軟なリンカーは、しばしば、それが相補性を生じるのに十分な自由度を提供するように使用されます。マルチクローニングサイト（MCS）14から生成されたランダムな配列を含む、正常に適用されてきた多くの人が、ありますが、そのようなリンカーは、（GGGGS）×2です。リンカーの長さはdependin最適化する必要があるかもしれません目的のタンパク質とその向きの相互作用の大きさにグラム。 PAmCherry1断片はのMCSに隣接すると、小さなクローニングバックボーンに含まれている（材料リストを参照してください）​​。目的の遺伝子は、制限部位を介して、またはライゲーション非依存の方法で挿入することができます。クローニングおよび配列確認の後、発現カセットは、リコンビナーゼ反応、高忠実度、高効率のクローニング法を使用して発現ベクターに移されます。 次に、得られた発現構築物は、標的細胞株を感染するためにレンチウイルスにパッケージング、安定な細胞株が所望される場合、標的細胞株にトランスフェクトまたはれています。一過性トランスフェクションは、BIFC構成の迅速な検証を可能にしますが、潜在的な問題に注意する必要があります。化学薬品を使用してトランスフェクションは、多くの場合、高い自己蛍光が得られ、細胞を強調。一方、全内部反射蛍光（TIRF）microscoの使用PPIは、細胞膜上で行われるときpyがTIRF理想、照明量を制限することにより、このバックグラウンド信号を軽減することができます。また、一過性トランスフェクションは、多くの場合、遠くのPPIの検出にアーチファクトを引き起こす可能性がある内因性タンパク質のものを超える、高レベルのタンパク質発現を導きます。したがって、それは、適切なBIFC設定が初期テストを通じて決定された後に安定な細胞株を確立することをお勧めします。安定な細胞株はまた、ドキシサイクリン誘導15を介して調節可能な発現の可能性を有します。 感染後、細胞を、抗生物質、典型的にはピューロマイシン、ネオマイシンで各構築物のための1つの選択されています。試料調製、画像収集、およびデータ分析のための後続のステップは、プロトコールに詳細に説明します。 このアプローチでは、ラス-RafのRBDのBIFC-PALM画像内のナノスケールのクラスターの形成が日常観察される（ 図2A &lt;/強いです&gt;）。一貫して、ラス-RafのRBDのSMT-PALM軌道が拡散状態（ 図2B-D）での不均質な分布を示しています。これらの結果は、Ras-Rafの複合体は、潜在的な生物学的な意味で、おそらくモノマー及びクラスターとして、細胞膜上の複数の状態で存在することを示唆しています。この作業は、従来BIFC、蛍光の共局在化、または蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を用いて得ることが困難となり、ナノメートルの空間分解能および単一分子感度を有する細胞でのPPIの選択的なイメージングにBIFC-PALMのパワーを示しています。 BIFC実験を設計し、その結果を解釈する際には、BIFCプロセスが分割PAmCherry1を含め、ほとんどの場合、中に不可逆的であることを心に留めておくことは重要です。二つの断片を組み合わせて、完全なPAmCherry1タンパク質、二つの断片間の結合を形成し、一旦このように、PPIは永続的になります。これはBIFCとBIFC-PALの使用を制限PPIのダイナミクス（ すなわち 、結合反応速度ではなく、それが形成されると、タンパク質複合体の拡散ダイナミクス）を監視すると、時間にMがあっても、PPI複合体の誤局在につながる可能性があります。 BIFC-PALM実験を設計する際に考慮すべき付加的な要因は、蛍光タンパク質に固有の発色団の成熟の遅れです。 2つのタンパク質が相互作用し、FPのフラグメントが一緒に来たら、彼らは一般的に数秒程度（EYFP 3 60秒のハーフタイム）にリフォールディング。しかし、その後の発色団の成熟と蛍光シグナルが分程度で開発しています。蛍光はスプリット金星、高速折りたたみYFP変異体の再構成後10分以内に検出することができるが、一般的には成熟のためのハーフタイムは、多くの場合、約60分で16です。分割PAmCherry1は、同様の速度を有することが観察されました。したがって、BIFCとBIFC-PALMは現在、リアルタイムのPPIの動態を監視するための悪い選択です。他の私このようなFRETと最近開発された二量体化に依存する蛍光タンパク質17としてthodsは、この目的のために、より適しているかもしれません。

<table><tbody><tr><td>顕微鏡フレーム</td><td>Nikon</td><td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>60X 油浸 TIRF 対物レンズ、1.49 NA</td><td>ニコン</td><td>CFI Apo TIRF 60x H</td><td></td></tr><tr><td>EMCCD カメラ</td><td>Andor</td><td>iXon Ultra 897</td><td></td></tr><tr><td>561 nm レーザー</td><td>オプト エンジン</td><td>MGL-FN-561</td><td></td></tr><tr><td>405 nm レーザー</td><td>コヒーレント</td><td>CUBE-405 50mW</td><td></td></tr><tr><td>561 nm ダイクロイック ミラー</td><td>セムロック</td><td>&nbsp;Di01-R405/488/561/635-25x36</td><td></td></tr><tr><td>561 nmフィルター</td><td>Semrock</td><td>FF01-525/45-25</td><td></td></tr><tr><td>405/561 nmノッチフィルター</td><td>Semrock</td><td>NF01-405/488/568-25</td><td></td></tr><tr><td>温度とCO2制御ステージ</td><td>東海ヒット</td><td>INUBG2ATW-PLAM</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry1_1-159-MCS</td><td>Addgene</td><td>60545</td><td></td></tr><tr><td>pENTR-D-TOPO-PAmCherry160-236-MCS</td><td>Addgene</td><td>60546</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.2-DEST</td><td>Life Technologies</td><td>12489-019</td><td></td></tr><tr><td>pLenti-DEST</td><td>Addgene</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.addgene.org/Eric_Campeau/ Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>Thermo Scientific</td><td>F-531</td><td></td></tr><tr><td>In-Fusion HD Cloning</td><td>Clontech</td><td>639649</td><td></td></tr><tr><td>LRClonase</td><td>Life Technologies</td><td>11791</td><td></td></tr><tr><td>Vira Power Lentivirus Packaging</td><td>Life Technologies</td><td>K497500</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE Transfection Reagent</td><td>Roche</td><td>13873800</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek II チャンバーカバーガラス</td><td>Thermo Scientific</td><td></td> <td>155409#1.5 ガラス底皿</td></tr><tr><td>U2OS細胞</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>293T/17細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッドのDMEM</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11995</td><td></td></tr><tr><td>DMEM フェノールレッドなし</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 21063</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 10082</td><td></td></tr><tr><td>Leibovit's L-15, フェノールレッドなし</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>21083-027</td><td></td></tr><tr><td>減少血清中程度</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>31985</td><td></td></tr>リン<tr><td>酸塩緩衝生理食塩水</td><td>生命技術</td><td>14040</td><td></td></tr>シ<tr><td>リンジ</td><td>BDバイオサイエンス309604</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr>レンチ<tr><td>ウイルス濃縮器</td><td>クロンテック</td><td>631231</td><td></td></tr><tr><td>レトロウイルス濃縮器</td><td>クロンテック</td><td>631455</td><td></td></tr><tr><td>10cm培養ディッシュ</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル培養プレート</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>107689</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Life Technologies</td><td>A11138</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Calbiochem</td><td>345812</td><td>Neomycin</td></tr><tr><td>Doxycyline</td><td>Fisher</td><td>BP2653</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>フィッシャー</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグ</td><td>マ 158127</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G6257</td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>シグマ</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>シグマ</td><td>3777</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M2643</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化カリウム</td><td>シグマ221473</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>フィッシャーBP358</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td>フィ<td>ッシャーM33</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100nm金粒子</td><td>BBIソリューション</td><td>EM。GC100</td><td></td></tr><tr><td>分子グレードの水</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10977</td><td></td></tr><tr><td>Dpn1</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0176</td><td></td></tr><tr><td>PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Miniprepキット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Midiprepキット</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410</td><td></td></tr><tr><td>0.6 ml微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量遠心チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-408-137</td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>BD バイオサイエンス 352063</td><td></td><td></td></tr><tr><td>14 ml ポリプロピレン丸底チューブ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>50ml チューブ</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>PCRチューブ</td><td>GeneMate</td><td>C-3328-1</td><td></td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Life Technologies</td><td>15544</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>フィッシャー</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>コンピテントセル</td><td>Life Technologies</td><td>C4040</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（bifc-palm）

Photoactivated Localization Microscopy with Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC-PALM)

タンパク質間相互作用(PPI)は、生物学にとって重要な分子イベントです。しかし、従来の光学顕微鏡の分解能は回折が~250nmに制限されているため、細胞内で十分な分解能と感度でPPIを可視化することは依然として課題です。二分子蛍光相補型(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることで、PPIを細胞内で1分子の感度とナノメートルの空間分解能で可視化することができます。BiFCは、蛍光コントラストでPPIを視覚化するために一般的に使用される手法であり、蛍光タンパク質を2つの非蛍光フラグメントに分割することが含まれます。PALMは、ナノメートルおよび単一分子スケールで生体サンプルをイメージングするための最近の超解像顕微鏡技術であり、光活性化可能な蛍光タンパク質(PA-FP)などの光変換可能な蛍光プローブを使用します。BiFC-PALMは、PALMと互換性のあるPA-FPであるPAmCherry1を分割することにより、そのモノマー性、良好な単一分子輝度、高コントラスト比、および化学量論測定への有用性を実証しました。アミノ酸159と160に分割すると、PAmCherry1は、PPIに対する高い特異性と低い非特異的再構成で、37°Cで効率的に再構成するBiFCプローブにすることができます。Ras-Raf相互作用は、BiFC-PALMがナノメートルスケールで単一分子の分解能で相互作用を調べるのにどのように役立つかを示す例として使用されています。その拡散は、1分子トラッキング(smt-)PALMを使用して生細胞で追跡することもできます。このプロトコルでは、BiFC-PALMの融合タンパク質を設計する際に考慮すべき要素について説明し、サンプル調製、画像取得、およびデータ解析のステップを説明し、いくつかの例示的な結果を示します。高い空間分解能、特異性、感度を提供するBiFC-PALMは、無傷の生体サンプル中のPPIを研究するための有用なツールです。

示さBIFC-PALMの例は、CRAFのラス結合ドメイン（RBD）（ 図1A）との相互作用KRAS G12D変異体です。議論したように、それはRasの膜局在化、ひいては生物学的活性を破壊になるので、RNまたはRCフラグメントは、RasのC末端にタグ付けされていませんでした。これは、8から4（ 図1B）に可能な組み合わせを減少させました。これらの4つの組み合わせの各々は、レンチウイルス感染を用いてU2OS細胞に導入しました。プロトコールで詳述されるように細胞を固定し、そしてBIFC信号はPALMセットアップを用いて評価しました。 405 nmレーザーがオンになったときに正BIFC信号を有する細胞は、蛍光の急激な増加により同定しました。 561 nmのレーザーは、撮像実験を通じてでした。この蛍光の急激な変化は、405 nmのレーザーで照射する際BIFC-再構成PAmCherry1の光活性化に起因するものです。試料中の複数の領域は、このアプローチを用いて評価しました。、およびBIFC信号強度は、405 nmのレーザーからの高出力パルスの前後の画素強度の増加を平均することによっ...

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

Protein-protein interactions (PPIs) are key molecular events to biology. However, it remains a challenge to visualize PPIs with sufficient resolution and ...

この顕微鏡技術の全体的な目的は、単分子およびナノメートルスケールでタンパク質およびタンパク質間相互作用を可視化することです。これにより、腫瘍形成シグナル伝達プロセスにおける分子相互作用など、生物学分野におけるいくつかの重要な疑問を解決することが可能になります。本技術の主な利点は、感度と特異度が高く、単分子およびナノメートル分解能を提供できる点にあります。本手順の実演は、私の研究室のシニアリサーチアソシエイトであるDr.Tahanが行います。テキストプロトコルに従い、クローニングしたRAsおよびRAF R-B-D-P-A-M Cherry断片をウイルス粒子にパッケージングし、U2 OS細胞に感染させます。イメージング用のサンプルを調製するため、8ウェルガラスボトムチャンバースライドの各ウェルに、フェノールレッドフリーのDMEM 350 µLを用いて、安定発現細胞を約5.5 × 10⁴個ずつ播種します。新鮮なグルタラルデヒド含有パラルデヒドを用いて細胞を固定し、固定液をPBSまたはイメージングバッファーに置換した後、100 nmの金粒子をボルテックスで撹拌し、イメージング中のステージドリフト追跡用に各ウェルに35 µLずつ添加します。顕微鏡に近づき、シャッターを閉じた状態で405 nmおよび561 nmのレーザーを電源オンにします。561 nm用のダイクロイックミラーとノッチフィルターが適切に配置されていることを確認してください。画像取得ソフトウェアを起動します。EMCCDカメラの電源を入れ、冷却させ、露光時間を100 msに、EMCCDゲインを適切な値に設定します。対物レンズにイマージョンオイルを滴下し、試料を顕微鏡ステージに固定します。次に、明視野または561 nmレーザーを用いて、RAおよびその他の膜タンパク質をイメージングするために試料に焦点を合わせます。開口数1.49の60x APO色収差補正対物レンズを使用し、顕微鏡をTURF構成に設定します。励起レーザーを調整し、対物レンズの後方開口部への入射位置をずらして、カバーガラスバッファー界面に到達した際にレーザーが屈折するようにします。臨界角に達し、レーザーが全反射するまで、レーザーの入射位置を調整し続けてください。視野内に複数の金粒子が含まれている、イメージング対象の細胞を探します。次に、細胞全体またはその一部、および金粒子を囲む関心領域（ROI）を設定します。発現レベルが高く、既に十分な活性化が起こっている場合にこのように設定します。405 nmレーザーをオフにし、561 nmレーザーをオンにした状態で撮影を開始します。それ以外の場合は、405 nmレーザーを工場出荷時の最低出力設定でオンにし、1フレームあたり数十個の分子が現れ、単一分子が十分に分離して見えるまで徐々に出力を上げます。データ収集を継続しながら、スポット密度をほぼ一定に保つために405 nmレーザーの出力を徐々に上げます。高出力の405 nmレーザーによって反応がさらに誘発されなくなるまで、画像収集を続けてください。アクティベーションイベントを終了し、画像の処理を行います。画像処理ソフトウェアをダウンロードしてください。MATLABを開き、WFI読み取りソフトウェアをロードします。生の画像シーケンスを確認し、関心領域（ROI）を決定します。処理するスタックの領域を、目的の領域を左クリックしてボックスで囲むことで選択してください。撮影時に関心領域が絞り込まれていなかった場合は、計算時間を短縮するために、より狭い範囲を選択してください。選択を解除してフレーム全体を処理するには、画像上の任意の場所を右クリックします。次に、カバーガラス上に吸着した金ナノ粒子など、孤立しており形状が均一で、画像スタック全体にわたって視野内に存在する基準マーカー（フィデューシャマーカー）を定義します。まず、候補となる金粒子を左クリックし、その周囲に小さなボックスを描くことで選択することから始めてください。「Particle Tracking」の下にある「Track」ボタンをクリックします。選択した金粒子の位置が、画像のスタック全体でどのようにドリフトしているかを示すグラフが表示されます。このプロセスを繰り返し、可能な限り多くの金粒子を追跡し、共に移動している粒子を特定します。全体のドリフトは、一度に最大でも0.1ピクセル程度の大きさです。粒子追跡の下で、共に追跡された金粒子を選択してください。「マーカー追加」ボタンをクリックします。粒子がマーカーとして追加され、ドリフト補正に使用されることを示す緑色の十字が表示されます。値をわずかに変更し、シグマ範囲、スムージング範囲、および閾値を必要に応じて調整してください。[粒子検索]ボタンをクリックして設定をテストし、処理される粒子を視覚的に確認します。PAM cherryのような、比較的丸く明るい分子がボックスで囲まれ、それ以外は除外されます。画像の処理を開始するには、[make cord file]ボタンをクリックし、画像のポストプロセスおよびパーム画像のレンダリングを行うために、任意の名前でファイルを保存します。MATLABでpalmパッケージを起動し、作成したばかりのdot coreファイルをロードします。コントロールボタンの隣にある画像ボックスに、粗いレンダリング画像が表示されます。以下の標準的な値を用いて個々の座標をソートします。PAM Cherryの場合、結合フレーム数は8、結合距離は100 nm、最小RMSは4とします。最小適合度（goodness of fit）を0.25、最大偏心率（eccentricity）を1.4に設定します。ソートボタンをクリックして、高解像度画像のレンダリングに使用するキュレーション済み座標の新しいセットを生成します。最終的に画像を正しくレンダリングするために、事前に決定した生ピクセルサイズや、通常は平均局在化精度よりわずかに高い値に設定されるレンダリング画像での希望フィーチャーサイズ（例：10 nanometersなど）などの値を入力してください。レンダリング画像を表示するには、レンダリングボタンをクリックして手のひらの画像を生成してください。次に、図ウィンドウのツールバーにあるプラスおよびマイナスの拡大アイコンを使用してズームイン・ズームアウトし、生細胞内の単一分子を追跡します。組織培養表面の処理および細胞の播種は、本ビデオの前半で説明した通りに行ってください。細胞の切断および実験に必要な処理やインキュベーションを行った後、カバーガラスが顕微鏡の設定に適した厚さであることを確認し、培養皿をステージ上のインキュベーターに設置します。温度とCO2濃度が安定するまで、皿をステージ上で数分間静置します。レーザーを遮断してください。CO2制御が利用できない場合は、背景蛍光を抑えるため、イメージングの直前にLeibovitz's L 15などのCO2非依存性培地に変更してください。最後に、時間分解能を損なうことなく十分なS/N比を確保できるよう適切な露光時間を設定し、前述のように画像を取得します。この図におけるBFC PAMは、CRAFのRas結合ドメイン（RBD）と相互作用するKRAS G12D変異体です。ここに示した4つの組み合わせは、いずれもレンチウイルス感染を用いてU2 OS細胞に導入されました。そのうち2つの構成では、親PAM Cherry1と同様の実験設定で実証されているように、BFC再構成PAM Cherry1の光活性化により、405 nmレーザーを照射した際に蛍光が急激に増加し、強いBFC陽性シグナルが確認されました。RN RおよびRAF RBD RCの感染後、強力なBFCシグナルが生成されました。ここで、RNとRCはそれぞれPAM Cherry oneのn末端およびC末端フラグメントを表しています。個々の分子を拡大すると、ナノスケールの空間分布を明確に確認することができ、本実験では単一分子トラッキングPAMを用いて個々のRAの拡散軌跡を取得しました。561 nmおよび405 nmのレーザーで連続的に照射した状態のRAF RBD複合体です。個々のPA m cherry one分子のst。スイッチオンし、ダーク状態に入る前の数フレームの間、分子が不動であるか、あるいは移動していることが判明しました。複数の分子の記録を示すこのプロットは、これら両方のタイプの軌跡を明確に示しています。同様の拡散状態の不均一な分布は、連続するフレーム間での分子変位のヒストグラムからも推測できます。Mass mastered。この手法は、適切に実施すれば、コンストラクトを一過性に発現させるか、トランスフェクションするか、あるいは安定的に発現させるかによって、1週間から3週間で完了します。この手順を行う際は、本手順に続き、相互作用を欠く変異型Putinなどのコントロールを準備することが重要であるという点に留意してください。また、タンパク質相互作用が細胞内でどのように空間的に組織化されているかなど、追加の疑問に答えるために、クラスター解析などの他の手法を実施することも可能です。ラボでの細胞トラッキングの評価基盤として、単一粒子追跡を行うことで、拡散状態およびその後の転移確率を決定できます。この手法は、当研究室のがん生物学分野において、RA駆動の相互作用や、ヒト腫瘍細胞におけるHERファミリー受容体のホモおよびヘテロ二量体化を探索するために用いられています。このビデオを視聴することで、目的のタンパク質相互作用を調査するためのバイオプシー用パームスの設計および実装方法について、十分に理解できるはずです。抗ウイルス剤および腫瘍細胞を取り扱うことは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、常に標準的なバイオセーフティプロトコルなどの予防措置を講じてください。

photoactivated-localization-microscopy-with-bimolecular-fluorescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

タンパク質の細胞内局在は、細胞シグナル伝達の時空間制御を決定する上で重要です。ここで、我々は、細胞内のタンパク質の空間的な相互作用を監視するための簡単​​な方法として、二分子蛍光相補（BiFC）を記述する。...

二分子蛍光相補

このビデオでは、タンパク質間相互作用を評価するためのBiFC-PALM(光活性化局在顕微鏡と二分子蛍光相補の組み合わせ)について説明しています。BiFCは、2つの蛍光タンパク質フラグメントと2つの相互作用する目的のタンパク質との融合を伴います。2つのタンパク質が相互作用すると、フラグメントが近接し、2つの部分が一緒になって機能的な蛍光タンパク質を再構成できます。単一の蛍光色素の蛍光は、PALMによって細胞内の単一分子レベルで局在します。...

二分子蛍光相補結合光活性化局在顕微鏡法

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

インビボでのタンパク質複合体の形成は、二分子蛍光相補性によって視覚化することができる。相互作用パートナーは、蛍光タグの相補的部分に融合し、一過性にタバコの葉で表現、2つのタンパク質の接近したとき、再構成可能な蛍光シグナルをもたらしている。...

タバコプロトプラストと葉で二分子蛍光相補性によって可視化し、タンパク質間相互作用

PI（4,5）P 2は、様々な細胞機能を調節するが、細胞の原形質膜でのナノスケール組織はあまり理解されています。標識PI（4,5）プレクストリン相同ドメインに融合された二重色蛍光プローブとP 2によって、我々はナノメートルスケールでの原形質膜中のP 2空間分布（4,5）PIを研究するための新規な方法を記載します。...

新規蛍光プローブと形質膜におけるホスファチジルイノシトール4,5-ビスリン酸の単分子超解像イメージング

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

生きた細胞の細胞内小器官のマルチカラー単一膜蛋白質のローカリゼーションのためのプロトコルを紹介します。蛍光物質を添付、自己ラベリング タンパク質を使用します。~ 18 の精度と同じ細胞小器官の異なる膜コンパートメントに位置するタンパク質をローカライズできる...

単一の膜タンパク質生きた哺乳類細胞の細胞内小器官のマルチカラー ローカリゼーション顕微鏡

従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。...

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

適切なサルコメアネットワークの形成は、iPSC由来心筋細胞の成熟にとって重要である。我々は、心臓の発達を促進する培養条件を改善するために、幹細胞由来心筋細胞の構造成熟の定量的評価を可能にする超解像ベースのアプローチを提示する。...

一分子局在顕微鏡を用いたヒトiPSC由来心筋細胞におけるαアクチニンネットワークの解析

学ぶBiFC-PALM顕微鏡法でU2OS細胞におけるRas-Rafタンパク質相互作用をナノスケールで可視化する方法。この技術はがんシグナル伝達経路の理解を進め、単一分子レベルの動態解析に応用できる。

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

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