二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

この顕微鏡技術の全体的な目標は、タンパク質、タンパク質の相互作用を単一分子およびナノメートルスケールで視覚化することです。したがって、この方法は、発癌性シグナル伝達プロセスにおける分子相互作用など、生物学の分野におけるいくつかの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、感度が高く、特異的であり、単一分子およびナノメートルの分解能を提供することです。

この手順を実演するのは、私の研究室のシニアリサーチであるTahan博士です RAとRAF R-B-D-P-A-M Cherry oneのクローニング後、パッケージングをウイルス粒子に断片化し、テキストプロトコルに従ってU2 OS細胞に感染します。8ウェルガラス底チャンバーのウェルあたり約5.5倍から第4安定発現細胞のイメージングプレート用試料を調製し、フェノールレッドフリーDMEMを350マイクロリットルにスライドさせる。グルタルアルデヒドを含む新鮮なパラアルデヒドを使用して細胞を固定し、固定剤をPBSまたはイメージングバッファーボルテックス100ナノメートルの金粒子に交換した後、イメージング中にステージドリフトを追跡するためにウェルあたり35マイクロリットルを追加します。

顕微鏡に近づき、この時点でシャッターを閉じたまま405ナノメートルと561ナノメートルのレーザーの電源を入れ、561ナノメートルのダイクロイックミラーとノッチフィルターが所定の位置にあることを確認します。画像取得ソフトウェアを開きます。E-M-C-C-Dカメラの電源を入れて冷まし、露出時間を100ミリ秒に、E-M-C-C-Dゲインを適切な値に設定します。

対物レンズに液浸油を加え、サンプルを顕微鏡ステージの経年変化に固定します。次に、明視野または561ナノメートルレーザーを使用して、RAやその他の膜タンパク質をイメージングするためにサンプルに焦点を合わせます。開口数1.49の60 x APOクロメーターターフ対物レンズを使用し、顕微鏡をターフ構成にします。

芝生の対物レンズの後部開口部に当たったときに励起レーザーが中心から外れるように調整すると、カバースリップバッファーが面にレーザーがたわむ原因となります。臨界角に達し、レーザーが反射されるまで、レーザーの入射位置を調整し続けます。いくつかの金の粒子が表示されている画像を撮像するセルを検索します。

次に、細胞またはその領域を囲む関心領域を設定し、発現レベルが高いために十分な活性化がすでに起こっている場合に備えて金粒子を設定します。405ナノメートルレーザーをオフにし、561レーザーをオンにして取得を開始します。それ以外の場合は、工場の最低出力設定で405ナノメートルレーザーをオンにし、フレームあたり数十分子になるまで、または単一分子が十分に分離されるまで徐々に増やします。

データ取得が進むにつれて、405ナノメートルのレーザー出力を徐々に増やして、スポット密度をほぼ一定に保ちます。高 4 0 5 まで画像取得を続けます。電源が入らなくなります。

アクティベーションイベントは、イメージの処理を終了します。画像処理ソフトウェアをダウンロードします。MATLAB を開き、WFI 読み取りソフトウェアを読み込みます。

生の画像シーケンスを表示し、関心領域またはROIを決定し、処理するスタックの領域を選択するには、目的の領域の周りのボックスを左クリックしてドラッグします。取得中に関心領域が縮小されなかった場合は、より小さな領域を選択して計算時間を短縮し、領域の選択を解除してフレーム全体を処理します 画像内の任意の場所をクリックして、カバー スリップに吸収された金ナノ粒子などの一連の受託マーカーを定義します。これらは、十分に分離され、均一で、形状があり、画像スタック全体の視野に存在します。まず、候補となる金の粒子を左クリックし、その周りの小さなボックスをドラッグして選択します。

[パーティクル トラッキング] で、トラック ボタンをクリックします。ドリフトの程度を示す画像のスタック全体で選択した金の粒子の位置を示すグラフが表示されます。このプロセスを繰り返して、できるだけ多くの金の粒子を追跡し、一緒に追跡する粒子を決定します。理想的。

全体のドリフトは、最大で 0.1 ピクセルの大きさで、一度に 1 つずつです。一緒にトラッキングした金色のパーティクルと、パーティクル トラッキングの下にあるパーティクルを選択します。マーカーの追加ボタンをクリックします。

パーティクルがマーカーとして追加されたことを示す緑色の十字が表示され、ドリフトの補正に使用されます。シグマ範囲、スムージング範囲、しきい値を必要に応じて少し変更して調整します。[粒子の検索]ボタンをクリックして設定をテストし、PAMチェリーなどのプロセス粒子を視覚的に検査します。比較的丸くて明るい分子はボックス化され、そうでない分子は除外されます。

画像の処理を開始するには、[コードファイルの作成]ボタンをクリックし、ファイルを希望の名前で保存して、画像を後処理し、手のひら画像をレンダリングします。MATLABでpalmパッケージを起動し、作成したドットコアファイルをロードします。コースレンダリングされた画像は、コントロールボタンの横の画像ボックスに表示されます。

次の一般的な値を使用して個々の座標を並べ替えます。PAM Cherry の場合、結合フレームは 8 に相当します。ナノメートル単位の組み合わせ距離は 100 に等しく、最小 RMS は 4 に等しくなります。

最小適合度は 0.25 に等しく、最大偏心度は 1.4 に等しくなります。並べ替えボタンをクリックすると、高解像度の画像をレンダリングできるように設計された新しい座標セットが生成されます。最終イメージを適切にレンダリングするための値 (以前に決定された未処理のピクセル サイズ、レンダリングされたイメージの目的の特徴サイズ (通常は平均ローカリゼーションよりわずかに大きい値に設定される)、ピクセル サイズ (10 ナノメートルなど) など) を入力します。

レンダリング イメージの場合は、レンダリング ボタンをクリックして手のひらイメージを生成します。次に、図ウィンドウのツールバーにあるプラスとマイナスの拡大アイコンを使用して、ズームインおよびズームアウトし、生細胞内の単一分子を追跡します。このビデオで前述したように、組織培養表面を処理し、細胞をプレート化します。

カバーガラスの厚さが顕微鏡検査に適した厚さであることを確認し、細胞をトランスセクトし、実験に必要な処理とインキュベーションを行った後、培養皿をステージ上のインキュベーターに置きます。このステップで温度とCO2濃度が安定するまで、皿がステージに落ち着くまで数分間待ちます。レーザーをブロックします。

CO2制御が利用できない場合は、イメージングの直前にCO2に依存しない媒体に変更します リーボビッツのL 15のような背景蛍光を抑制し、最終的に前に示したように画像を取得し、適切な露光時間を設定して、時間分解能を損なうことなく良好な信号対雑音比を確保します。この図のBFC手のひらは、RAの結合ドメインまたはCRAFのRBDと相互作用するKRAS G 12 D変異体です。ここに示されている4つの組み合わせのそれぞれは、レンチウイルス感染細胞を使用してU2 OS細胞に導入され、そのうちの2つの構成は、親PAM Cherryと同じ実験設定を使用して、BFC再構成PAM Cherryの光活性化により405ナノメートルレーザーをオンにしたときに蛍光が急激に増加することで識別されるように、強い正のBFCシグナルを持っていました。

RN RおよびRAF RBD RCに感染した後、強力なBFCシグナルが生成されました。ここで、RNとRCは、個々の分子を拡大したときにPAM Cherryのn末端フラグメントとC末端フラグメントをそれぞれ示しており、個々のRAの拡散軌道を取得するために単一分子トラッキングパームを行ったこの実験では、それらのナノスケールの空間分布がはっきりと見られます。561ナノメートルおよび405ナノメートルのレーザーによる連続照明下のRAF RBD複合体。個々のPA m チェリー 1 分子 st.

スイッチを入れて数フレーム持続すると、動かないか動いていることが判明した暗い状態に入ります。この複数の分子の記録のプロットは、両方のタイプの軌跡を明確に示しています。拡散状態の同じ不均一な分布は、Mass masteredの連続するフレーム間の分子変位のヒストグラムから推測できます。

この技術は、コンストラクトが超越的であるか、トランスフェクションされているか、または適切に実行されている場合に安定して抑圧されているかに応じて、1〜3週間で実行できます。この手順を試みる際には、この手順に続く相互作用が不足している突然変異型のプーチンなどのコントロールを準備することを忘れないでください。クラスター分析などの他の方法を実行して、タンパク質相互作用が細胞内で空間的にどのように組織化されているかなどの追加の質問に答えることができます。

ラボの細胞追跡では、評価ベース、単一粒子の追跡を実行して、その発生後の拡散状態と遷移確率を決定できます。この技術は、がん生物学の分野で私たちの研究室で、RAドライブ相互作用、およびヒト腫瘍細胞における彼女のファミリー受容体のホモ化と化を探索するために使用されています。このビデオを見た後、目的のタンパク質相互作用を調査するために生検手のひらを設計して実装する方法を十分に理解しているはずです。

アンチウイルスと腫瘍細胞との作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行する場合は常に標準的なバイオセーフティプロトコルなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。