の共焦点分析を用いました

本手法の全体的な目的は、*Xenopus laevis*における発現を利用して、無傷の上皮における蛍光タグ付きリガンドの分泌と拡散を可視化することです。この手法は、初期胚発生における細胞系譜の決定に不可欠であることが知られているモルフォゲン勾配の形成に関する重要な疑問を解決するのに役立ちます。本技術の主な利点は、無傷の上皮におけるリガンド分布を可視化するための簡便な手法であることです。

本プロトコルの重要な部分は、通常通りにプロセシングおよび分泌され、蛍光タグが付着しているにもかかわらず受容細胞において応答を誘発させることができる、生物学的に活性なリガンドを生成することです。共焦点顕微鏡は、独立したレーザーと検出器を用いて、三次元組織内における蛍光タグ付きタンパク質の局在を研究するのに最適な方法であり、これにより複雑な組織型においてもクリーンな解析が可能となり、堅牢なデータを収集することができます。記述されたプロトコルに従って、蛍光タグ付きリガンドのmRNAコーティングの作製およびXUS lavis胚の取得を行った後、必要に応じて膜RFPなどのリネージトレーサーとともに、16〜32細胞期の単一細胞にmRNAを注入します。また、その影響を解析するために、モジュレーターを蛍光リガンドおよびリネージマーカーと共に共注入することも可能です。

隣接する細胞にも注入することが有用な場合があります。ここでは、以前に注入した細胞に隣接して、2番目の細胞に注入を行います。一方の細胞には、GFPタグ付きリガンドをコードするmRNAと、膜RFPなどのリネージトレーサーを注入し、もう一方の細胞には、モジュレーターをコードするmRNAと、膜ceruleanなどの別のリネージトレーサーを注入します。胚を12.5 °Cのインキュベーターに移し、new coopまで培養します。翌日、胚がステージ8に達した時点で、1%アガロースでコーティングされたディッシュにNAM 2を満たし、タングステン針を用いたカットガラスピペットを使用して胚を移します。

注入胚および対照胚の動物極から、中胚葉が含まれないように注意して円形の外胚葉を切り出します。1%アガロースでコーティングした55 mmペトリ皿に動物外胚葉を移し、蛍光タンパク質を成熟させてレリーフを生成させるため、胚を4時間培養します。顕微鏡スライドグラスにPVC絶縁テープを2層にわたって貼り付け、完全に平坦にします。

動物キャップを固定するためのテープを14 by 10 millimeterの長方形に切り出します。次に、リリーフスライドにNM twoを2滴分、別々にピペッティングします。その後、先端をカットしたP 20チップを用いて、各スライドに最大15個の動物外植片を移し、ピンセットで外植片の頂端側が上を向くように方向を調整します。

ダイヤモンドペンでガラスカバースリップに傷をつけ、それを割って小さなカバースリップを作成します。レリーフスライドに適合させるため、曲げた19ゲージの針を使用して、ガラスカバースリップをレリーフスライド上にゆっくりと下ろします。これにより、動物極キャップ細胞の頂端層を圧縮します。

ネイル varnish を用いてスライドを封印し、暗所で 20 分間乾燥させた後、4 ～ 6 時間以内に撮像します。健全な動物極キャップ（animal caps）を確保するため、カスタムスライドおよびカバーガラス内で animal caps が正しく方向付けられている必要があります。スライドへの載置は慎重に行ってください。

スライドを密封する際にマニキュアを使いすぎないことが重要です。使いすぎるとテープにしわが寄り、後でスライドの密封状態が損なわれる原因となります。習熟すれば、関心のある条件ごとに20個の良好なアニマルキャップを採取するために、約25個の胚に注入を行う必要があります。これらは翌日に共焦点顕微鏡で解析することが可能です。

イメージングを行うには、低倍率の対物レンズを使用してX explanを確認します。次に、より高解像度のイメージングを行うため、63 x 1.4のオイル浸漬対物レンズに切り替えます。MIAN用の405、GFP用の488、および561を含む必要なレーザーをオンにします。

MRFPについては、すべての蛍光色素を検出できるようレーザー出力を最適化します。電圧とゲインを必要最小限に抑えながら32個の検出器アレイを使用し、Lambdaモードを選択して、405 nm、488 nm、および561 nmのレーザーを選択します。より広い視野を確保するため、画像のズームを0.6倍に設定してください。

次に、フレームサイズを希望の画像サイズに設定します。これにより、解析に十分な解像度が確保され、S/N比を向上させるために平均化回数を4回から8回に設定し、このデータセットに合わせてピンホールを最適化します。561 nmレーザーに基づき、1エリアユニットを使用し、405、488、561を用いて測定しました。

Diicミラーを用いて、膜結合型Saru、GFP、および膜結合型RFPから放出される光を収集します。本実験では、415から720 nmの範囲で、約10 nmごとに光を収集しました。ここに示すテキストプロトコルに従って画像解析を行います。これは、対照条件下での動物胚のX軸方向におけるGFPタグ付きsonic hedgehogの分布を示しています。sonic hedgehog GFPは分泌され、注入されたmRNAを発現している領域の外側へと拡散します。

しかし、モジュレーターであるSULF1が存在すると、Sonic Hedgehog GFPの分布はより制限されます。そして、このサンプルでは、Sonic Hedgehog GFPを産生している細胞クローンのごく近傍にのみ、少数の焦点が観察されます。この図は、ここに示すように細胞に注入された、蛍光タグ付きの2種類のWntリガンドの特性解析を示しています。Wnt8aおよびWnt11b-HAE-GFPはいずれも動物極外胚葉細胞の膜に蓄積しますが、Wnt8a-HAE-GFPの方がWnt11bよりも効率的に蓄積します。この図は、膜結合型Ceruleanで標識された細胞クローンで発現させたWnt8a-HAE-GFPの分布を示しています。

蛍光標識されたリガンドが、ソース細胞から拡散し、上皮の周囲の細胞へと移動していく様子が観察されます。ここに示すように、画像解析ソフトウェアを用いて、複数の実験サンプルにおける蛍光標識windリガンドの分布データを抽出します。mem Saru発現クローンからの距離とGFP蛍光レベルを測定し、windの拡散範囲と勾配の形状を決定します。

リガンドの分布を測定した後、このプロトコルを別のアッセイと組み合わせることで、受容細胞の応答をモニタリングし、シグナル伝達経路の出力を評価することも可能です。このようにして、モルフォゲンの閾値範囲の決定を試みることができます。