Name: 細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 20 s
Description: 学ぶ 細菌人工染色体を用いたプラス鎖RNAウイルスの感染性ウイルス粒子の作製法。日本脳炎ウイルスのcDNAクローンからウイルスを回収し、遺伝学的ワクチン開発やウイルス複製メカニズムの研究に応用する。

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著者は、YMLの支援に対するユタ科学技術研究基金と、SIYの支援に対する韓国国立研究財団の助成金（2009-0069679および2010-0010154)に感謝したいと思います。この研究は、ユタ州立大学のユタ農業試験場の支援を受け、ジャーナル論文番号UAES#8753として承認されました。また、著者は編集支援をしてくれたデボラ・マクレラン博士に感謝します。

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

現在のプロトコルが正常JEV、その機能的なcDNAを構築することが本質的に困難であることが証明されたとフラビウイルスの二つの異なる株（CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28）の全長の感染性cDNAクローンを生成するために使用されていますなぜなら、宿主細胞毒性およびクローニングされたcDNAの遺伝的不安定性の伝播8,74-76このプロトコルは、三つの主要なコンポーネントが含ま：。最初、高忠実度の逆転写酵素を用いてウイルスRNAの忠実なcDNAコピーの合成/増幅を最大化します/ DNAポリメラーゼ。第二に、最終的な完全長cDNAの組立工程にサブクローニング最初のcDNAからの非常に低コピー数ベクターのBACにおける毒性系列（未発表データ）74,77,78を含むウイルスPRM-Eコード領域をクローニングします。第三、明らかにより大きいDNA inseを許容120〜350キロバイトの平均サイズ、19-21で外来DNAを収容することができ、クローニングベクター、BACを利用他のクローニングベクターが行うよりも、RTS。このクローニングアプローチは、他の多くのプラス鎖RNAウイルス、〜10から32キロバイトの大RNAゲノムと特にに一般的に適用されます。そのゲノムが宿主細​​胞リボソームによるタンパク質に翻訳されるようなウイルスのmRNAを作用するための感染性cDNAクローンの発生は、特に、ポジティブ鎖RNAウイルスは、RNAウイルスの逆遺伝学系の開発における重要なステップです。従って、ウイルス複製は、感受性の宿主細胞へのcDNA由来のゲノム長RNA分子を導入することによって開始することができます。感染性JEV cDNAクローンの利用可能性は、組換えDNA技術と組み合わせると、このような遺伝子発現73,79およびゲノム複製として、分子レベルでウイルスのライフサイクルの様々な態様の理解を増加している。63,64にも、完全長のJEV cDNAクローンは、抗ウイルスワクチン28および遺伝子送達ベクターの開発のための貴重なツールであることが証明されました。&lt;SUP&gt; 80,81 すべてのプラス鎖RNAウイルスと同様に、高度に感染性RNAをin vitroで合成することが可能なJEV cDNAのための信頼できる機能を構築する際に、複数の重要なステップがあります。理想的には、全長cDNAのクローンから転写された合成RNAの配列は、ウイルスゲノムRNA、ウイルスRNA複製の開始のために必要とされ、特に5 &#39;および3&#39;末端配列と同一であるべきです。60-62現在のプロトコルでは、本物の5 &#39;末端および3&#39;末端は、最後の下流のウイルスゲノムの最初のアデニンヌクレオチドの上流にSP6プロモーター配列を配置し、ユニークな人工のXba I制限部位を配置することによって確保されましたそれぞれウイルスゲノムのチミンヌクレオチド、。 Xba I-直線化し、MBN処理されたcDNAをTEのランオフ転写によって生成された本物の5 &#39;末端および3&#39;末端を有する合成RNAを頂きましたmplateメートル7 G（5 &#39;）で下塗りし、SP6 RNAポリメラーゼのppp（5&#39;）キャップアナログを使用。このプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。 インビトロ転写のために、別のバクテリオファージRNAポリメラーゼ（例えば、T3またはT7）は、明確に定義されたプロモーター配列と組み合わせて使用することができる。27、それが中に存在しない場合、ランオフサイト、別の制限部位を利用することができるように直線化cDNAからのウイルスゲノムとするならば、合成RNAは、本物の3 &#39;末端で終わります。合成RNAは、その3 &#39;末端に3つまたは4つのウイルス関連のないヌクレオチドが含まれている場合、3&#39;末端のヌクレオチド配列の重要性は、RNAの感染力で約10倍の減少によって実証されている。in vitro転写反応において27、両方M 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Aおよびm 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）Gキャップ類似体は、後者の場所ウイルス5の上流に無関係な余分なGヌクレオチドが、等しく良好に使用することができ&#39;末端が、そのさらには、合成RNAの感染性または複製を変更しません。27 cDNAテンプレート自体は感染性ではないのでまた、DNアーゼI消化によるRNA転写物からcDNA鋳型の除去は、RNAの感染性試験の必要はありません。27 BAC技術は現在、プラス鎖RNAウイルス、すなわち二つJEVs、CNU / LP2 27、SA 14 -14-2 28（ゲノムサイズ、〜11 KB）の一握りのための感染性cDNAクローンの構築に適用されています。 2デング熱ウイルス、BR / 90 26とNGC 29（〜11キロバイト）牛ウイルス性下痢ウイルス、SD1（〜12キロバイト）; 25 2古典的ブタ熱ウイルス、Cとパーダーボルン（〜12キロバイト）; 24ボーダー病ウイルス、ギフホルン（〜12キロバイト）; 24豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス、PL97-1 / LP1（〜15キロバイト）; 30伝染性胃腸炎ウイルス、PUR46-MAD（〜29キロバイト）; 16ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、DF-2（〜29キロバイト）; 32重症急性呼吸器症候群コロナウイルス、ウルバーニ（〜30キロバイト）; 9中東呼吸器症候群コロナウイルス、EMC / 2012（〜30キロバイト）; 17およびヒトコロナ、OC43（〜 31 KB）31のcDNAの構築のためのBACを使用することの主な利点は、大規模な、1または2コピーのBACプラスミドの高い遺伝的安定性です。しかし、その非常に低コピー数の固有の性質があるため、BAC DNAと染色体DNAを、ホストとのBAC DNAの純度の結果としての削減の非常に低い収率で、また大きな欠点です。現在のプロトコルでは、BAC DNAの収量は 、E を成長させることによって最大化されます大腸菌 DH10B栄養豊富な培地の2×YTで感染性BACてpBAC / SA 14 -14-2で形質転換しました。この努力にもかかわらず、平均利回りはわずか〜15μgのの2×YTブロスの500ミリリットルからBAC DNAのです。また、BAC DNAの純度が最高の精製のためのCsCl-EtBrを密度勾配遠心分離を使用することによって達成されますむしろ、一般的に使用される列ベースのプラスミド分離より。しかし、それは心に留めておくことは重要であるBAC- 形質転換したE.それがクローニングされたcDNAの遺伝的安定性を危うくする可能性があるため、 大腸菌が過剰成長べきではない、と高い成長が必ずしも大きい利回り以上純度BAC DNAにはつながりません。 ここで説明するプロトコルは、JEVのためのBACとして遺伝的に安定、全長感染性cDNAクローンの構築および増殖のための最適化、効率的、かつ合理化法である、手順をもう一度事実上不可能と思いました。この同じクローニング戦略は、多くの他のプラス鎖RNAウイルスに適用することができます。一般的に、感染性cDNAクローンは、ウイルスの複製および病因にその生物学的機能を研究するために、ウイルスRNAゲノムに変異（例えば、欠失、挿入、および点変異）の様々なを紹介することが可能となります。このcDNAベースの逆遺伝学系を開発することを可能にし、TESTワクチンと目的の特定のプラス鎖RNAウイルスの病原性因子を標的とする治療候補。また、この感染性cDNA技術は、生物医学研究の多くの用途のために、目的の外来遺伝子を発現することができるウイルスベクターとして利用することができます。

RNAのウイルス学者は、1970年代後半における組換えDNA技術の出現は、その後、RNAウイルスの遺伝子操作のための細菌中でのプラスミドとして増殖することができたcDNAクローンの中にウイルスRNAゲノムを変換することができた。1最初のRNAウイルスであることがクローン化された分子は、バクテリオファージQβ、 大腸菌に感染するプラス鎖RNAウイルスでした。 大腸菌に導入された場合QβゲノムRNAの完全なcDNAコピーを含むプラスミドは、感染Qβファージを生じましたコリ 2その後すぐに、この技術は、ポリオウイルス、ヒトおよび動物のプラス鎖RNAウイルスに適用しました。ポリオウイルスのゲノムRNAの完全長cDNAを有するプラスミドは、感染哺乳動物細胞にトランスフェクトし、感染性ビリオンを産生することができたときに3を 、クローン化したcDNAを、ウイルスRNA複製を開始するために細胞内で転写されるべきこの「DNA発射」アプローチでは。しかし、それは、転写が開始される方法および転写産物が正しいウイルス配列にどのように処理されるかは不明です。この懸念は、代替「RNA-立ち上げ」の開発につながっているのアプローチ、ウイルスRNAゲノムの完全なcDNAコピーは 、Eによって認識されるプロモーター下にクローニングされます宿主細胞に導入された場合、完全なウイルス複製サイクルを受ける定義の5 &#39;および3&#39;末端を有する、インビトロでの合成RNAの産生のための大腸菌やファージRNAポリメラーゼ。このアプローチの最初の成功は、ブロムモザイクウイルスについて報告された4,5 、6,7植物のプラス鎖RNAウイルス。それ以来、RNA-打ち上げのアプローチは、カリシウイルス、アルファウイルス、フラビウイルス、アルテ、およびコロナウイルスなどのプラス鎖RNAウイルス、広範囲のために開発されました。1,4,5,8- DNA-との両方で、FULの建設を逆遺伝学システムをRNA発射、〜10の大RNAゲノムリットル長cDNAクローンは、ポジティブ鎖RNAウイルスの感染性DNAまたはRNAを生成するための鍵であるが、ウイルスゲノムのサイズが大きくなるように、かなりの技術的な課題となる。具体的には9-17 -32キロバイトは、完全長cDNAのクローニング機能には3つの大きな障害を提示している。18 RT-PCRの忠実度は、ウイルスRNAの長さに反比例するので、最初の難しさは、忠実なのcDNAコピーの合成です。長いRNA分子がE.で不安定なプラスミド中のcDNA断片を作製することが可能な、予期しない配列を含有する可能性が高いので、第二のハードルは、潜在的に毒性の配列の存在であります大腸菌 。それは&gt; 10 kbのウイルスのcDNAインサートを収容することができるクローニングベクターを見つけることは困難であるため、第三の、最も重要な問題は、適切なベクターが利用可能です。過去30年間にわたり、これらの障壁は、酵素学、方法論、ANにはいくつかの進歩によって克服されていますDのvectorology。これらのうち1,4,5,8は 、最も有望で革新的な開発は、大きなプラス鎖RNAウイルスなどの感染細菌人工染色体（BACの）のクローニングです。 BACベクターは 、Eに基づいて、低コピープラスミドクローニング（1-2コピー/細胞）であります〜120〜350キロバイトの平均DNAインサートサイズの大腸菌出生率、19-21 DNA断片は、一般的なクローニングベクターへのクローニングと同様にBACベクター中に挿入されます。結果としてBACクローンは 、Eの多くの世代にわたって安定しています大腸菌。現在までに22,23、BAC技術は、3つの正鎖RNAウイルスファミリーの&gt; 10のメンバー、 すなわち 、 フラビウイルス科 、24-29 アルテ 、30とコロナのための感染性cDNAクローンを作成するために使用されています。9,16,17 、31,32 例として、日本脳炎ウイルス（JEV）を使用して、本研究は、することができ、詳細な手順を報告プラス鎖RNAウイルスの様々な遺伝的に安定、全長感染性BACを構築するために使用されます。で発生JEVは、JEV感染が深刻なしばしば致命的な神経疾患日本脳炎を引き起こす可能性がヒトでは人獣共通感染蚊ベクトルによって鳥、豚、および他の脊椎動物のホスト間の自然の中で伝送されるフラビウイルス33。34,35です（JE）、36 〜50,000-175,000臨床例推定年間発生率とアジアと西太平洋、37,38の一部。39,40 JEVのゲノムは、〜11-kbの、一本鎖、正センスRNA分子であり、で構成されてい5における2つの非コード領域（のNCR） &#39;および3&#39;末端により隣接する単一のオープンリーディングフレーム（ORF）41,42 ORFは、指定された、10の個々のタンパク質を生成する宿主およびウイルスのプロテアーゼによって切断されるポリタンパク質をコードC、のprM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、およびNS5また、N末端 ​​からC末端への方向インチ34,43,44、電子NS1（NS1 &#39;）のXtendedでは、フォームがコドンNS2Aの8-9でのことで-1リボソームフレームシフト表現されている。これら11タンパク質のうち45,46、3つの構造タンパク質（C、のprM、およびE）は、感染の形成のために不可欠ですビリオン、47,48と残りの8非構造タンパク質（NS5にNS1、およびNS1 &#39;）はウイルスRNA複製、49-51粒子アセンブリ、52-56と自然免疫の回避のために非常に重要である。57〜59の両方の5&#39;および3 「のNCRは、保存された一次配列を含み、ウイルスRNA複製を調節するために重要であるRNA二次/三次構造、60〜62を形成する 。63,64 このプロトコルは、SA 14 -14-2全長のJEVの感染性BACを生成するためのツール、方法、および戦略について説明します。28この機能BACクローンは、プロモーターに含まれるJEVゲノムRNAの完全なcDNAコピー、65が含まれています SP6 RNAポリメラーゼのための上流ウイルス5 &#39;末端およびin vitroでのランオフ転写のためのウイルスの3&#39;末端の下流の独特のXba I制限部位の。このBAC技術は、プラス鎖RNAウイルスの配列に完全に機能するcDNA分子クローンの構築に適用可能です。

<table><tbody><tr><td><ストロング>1.Molecular Cloning</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2xYT Broth</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2377[</td><td></td></tr><tr><td>3H]UTP</td><td>PerkinElmer</td><td>NET380250UC</td><td>Radioactive</td></tr><tr><td>50 ml Tube</td><td>Thermo Scientific (Nalgene)</td><td>3114-0050</td><td></td></tr><tr><td>250 ml Bottle</td><td>Beckman Coulter</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>アガロース (低融点)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>16520-100</td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>AvrII</td><td>New England BioLabs</td><td>R0174S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0136S</td><td></td></tr><tr><td>BsiWI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0553S</td><td></td></tr><tr><td>BsrGI</td><td>NewイングランドBioLabs</td><td>R0575S</td><td></td></tr><tr><td>ブタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A399-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>塩化セシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1595-1</td><td></td></tr><tr><td>クロラムフェニコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>発がん性</td></tr><tr><td>DE-81 濾紙</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3658-023</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18427-088</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 DH10B&nbsp;</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18297-010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td>毒性および高変異原性</td></tr><tr><td>フィルターカラム (Plasmid Maxiprep Kit)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-26</td><td></td></tr><tr><td>氷酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td>刺激性</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>10901393001</td><td></td></tr><tr><td>ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>I9392</td><td>可燃性</td></tr><tr><td>イソプロパノール&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0918</td><td>Flammable</td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>12795-027</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9650</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Amresco</td><td>0663</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>緑豆ヌクレアーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0250S</td><td></td></tr><tr><td>針 (18G, 20G)</td><td>BD</td><td>305196, 305175</td><td>バイオハザード (鋭利物廃棄物)</td></tr><tr><td>NotI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0189S</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチド</td><td>統合 DNA 技術</td><td>カスタム オリゴヌクレオチド合成</td><td></td></tr><tr><td>PacI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0547S</td><td></td></tr><tr><td>pBeloBAC11</td><td>New England BioLabs</td><td>ER2420S (E4154S)</td><td></td></tr><tr><td>Phenol (Buffer-Saturated)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15513-039</td><td>毒性および高腐食性</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15593-031</td><td>毒性および高腐食性</td></tr><tr><td>フェノール:グアニジン イソチオシアネート</td><td>Life Technologies (Ambion)</td><td>10296-010</td><td>有毒、腐食性、および刺激性</td></tr><tr><td>Pme I</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0560S</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>Amresco</td><td>0698</td><td></td></tr><tr><td>RNase 阻害剤</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>10777-019</td><td></td></tr><tr><td>rNTP Set</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>27-2025-01</td><td></td></tr><tr><td>シーラブルポリプロピレンチューブ (16 &times; 76 mm)&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>342413</td><td></td></tr><tr><td>SfiI</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0123S</td><td></td></tr><tr><td>Sma I</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>R0141S</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Amresco</td><td>0227</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SP6 RNA ポリメラーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0207S</td><td></td></tr><tr><td>スピンカラム (プラスミド Miniprep キット)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>K2100-11</td><td></td></tr><tr><td>Syringe</td><td>HSW NORM-JECT</td><td>4200.000V0</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td></td></tr><tr><td>tRNA (酵母)</td><td>Life Technologies (Invitrogen)</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>XbaI&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>2。細胞培養</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルファ ミニマル エッセンシャル メディウム</td><td>ライフ テクノロジーズ (Gibco)</td><td>12561-049</td><td></td></tr><tr><td>コニカル チューブ (50 mL)</td><td>VWR</td><td>21008-242</td><td></td></tr><tr><td>クリスタル バイオレット&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C0775</td><td></td></tr><tr><td>培養皿 (150 mm)&nbsp;</td><td></td><td>TPP93150&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>キュベット(2mmギャップ)</td><td>ハーバード装置</td><td>450125&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td>毒性および発がん性</td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>61100-061</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム モノ塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA(0.25%)</td><td>Life Technologies (Gibco)</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>ビタミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>名前</strong<></td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>strongコメント</td></tr><tr><td>3。装置</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アガロースゲル電気泳動システム</td><td>Mupid</td><td>MPDEXU-01</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>Heracell 150i</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST16R</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロポレーター</td><td>ハーバード Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>長波紫外線ランプ (ハンドヘルド)</td><td>UVP</td><td>UVGL-58</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>368826</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Life Technologies (Applied Biosystems)</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer</td><td>科学産業</td><td>G-560</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Jeioテック</td><td>WB-10E</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌人工染色体：プラス鎖rnaウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

リバースジェネティクスは、クローン化されたcDNAから感染性ウイルスを完全に救出するアプローチであり、そのゲノムが細胞のmRNAと同じ極性を持つポジティブストランドRNAウイルスの分野に革命をもたらしました。cDNAベースのリバースジェネティクスシステムは、ウイルスのゲノムRNAを直接操作できる独創的な方法であり、それにより、ウイルスの複製と病因におけるウイルスRNA要素と遺伝子産物の両方の分子および遺伝学的研究のための組換えウイルスを生成します。また、遺伝的に定義されたワクチンや外来遺伝子の送達のためのウイルスベクターの開発を可能にする貴重なプラットフォームを提供します。しかし、日本脳炎ウイルス(JEV)など多くのポジティブストランドRNAウイルスでは、クローニングされたcDNAが不安定であり、機能的なcDNAの構築と増殖に大きな障害となっています。ここでは、本レポートでは、ウイルスRNAの単離、cDNA合成、cDNAサブクローニングと修飾、完全長cDNAの組み立て、cDNAの線形化、in vitroの一般的な実験手順を使用して、細菌人工染色体(BAC)として遺伝的に安定した完全長感染性JEV cDNAを作成および増幅する際の戦略的考慮事項について説明しますRNA合成、およびウイルスの回復。このプロトコルは、さまざまなポジティブストランドRNAウイルス、特にゲノムが>10kbのウイルスの完全長cDNAをBACベクターにクローニングするのに適用できる一般的な方法論を提供します。そこから感染性RNAをバクテリオファージRNAポリメラーゼでin vitroで転写できます。

すべてのプラス鎖RNAウイルスの場合は、逆遺伝学システムの信頼性と効率がシーケンスウイルスゲノムRNAのコンセンサス配列と等価であるクローン化された完全長cDNAの遺伝的安定性に依存しています。27 図1は、五員環を示し、 JEV SAのBACとして、全長感染性cDNAを構築するためのステップ戦略14 -14-2 28：ステップ1、JEV感染BHK-21細胞（ 図1A）の細胞培養上清からのウイルスRNAの精製;ステップ2、全ウイルスゲノム（ 図1B）に及ぶ4重複するcDNAアンプリコン（F4にF1）の合成;ステップ3、BACベクターに4つの連続cDNA断片のそれぞれのサブクローニング、てpBAC / F4（ 図1C）にてpBAC / F1を作成します。 すなわちステップ4、SP6 ​​RNAポリメラーゼを用いたインビトロランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更、SP6を置きますサイレント点突然変異、9134→T（てpBAC / F3 KO）を導入し、挿入することによって、ヌクレオチド9131で、既存の内部のXba I部位を排除し、すぐにウイルス5 &#39;末端（てpBAC / F1 SP6）の上流のプロモーター配列、ウイルス3 &#39;末端（てpBAC / F4 RO）（ 図1D）のすぐ下流に新たな人工のXbaIランオフサイト。ステップ5、フルレングスのSA 14 -14-2のcDNA BAC、てpBAC / SA 14 -14-2（ 図1E）。 表1に、このクローニング手順で使用されるオリゴヌクレオチドのアセンブリ。28 機能性JEV cDNAの構築のために、最初の重要なステップは、RT-PCRのための鋳型として精製されたウイルスRNAを使用して、4つの重複するcDNAフラグメントの合成である。 図2は 4であったRT-PCR産物のための代表的な結果を提供します0.8％で電気泳動アガロースゲル。このゲルは、全長のJEV cDNAは4オーバーラップするcDNA断片に増幅されていることを明確に示しています。時折、RT-PCR反応が原因cDNA合成/増幅中のプライマーの非特異的アニーリングを、予想される生成物より大部分が小さい1つ以上の追加のウイルス特異的または非特異的な生成物を生じる可能性があります。一方、ほとんど又は全く予期されるRT-PCR産物は、ウイルスRNAの単離または不適切なRT-PCRのパフォーマンス中に偶発ためのRNaseの混入の増幅されたことになります。 次の重要なステップは、partial-または全長標準的な組換えDNA技術を使用して、比較的簡単な手順であるBACにおけるJEVのcDNAのクローニングおよび変形例である。69 図3は含むBACクローンを精製するための代表的な結果を提示します塩化セシウム-EtBrを勾配にバンディングによってJEV SA 14 -14-2の完全長cDNA。この実験では、401700×gで16時間遠心分離した後、二つの異なるバンド、 すなわち 、E。上記の大腸菌の染色体DNAおよび以下のスーパーコイルBACプラスミドDNAは、長波長紫外線の下でチューブの中央に表示されます。下のBAC DNAバンドの最小量（〜400μl）を慎重にチューブの側のシリンジで穴を突っついによって回収しました。その後、EtBrをブタノール抽出によりBAC DNAから抽出し、EtBrを無BAC DNAをエタノール沈殿により濃縮しました。 最後のステップは、許容細胞へのRNAトランスフェクション（ 図4）の後に、全長SA 14 -14-2 BAC（てpBAC / SA 14 -14-2）からインビトロで転写合成RNAの特異的感染の決意です。ステップ1、3 &#39;末端に、全長SA 14 -14-2 cDNAの線形化：このステップは、3つの連続ステップが含まウイルスゲノム（ 図4A）の末端;ステップ2、ランオフ転写（ 図4B）により線形化cDNAからの合成RNAの産生;ステップ3、合成RNA（ 図4C）でトランスフェクトしたBHK-21細胞における組換えウイルスの救出。実験的に、てpBAC / SA 14 -14-2の2つの独立したクローンをのXba I消化で線状化および Xba I消化によって生成された4塩基の5 &#39;オーバーハングを除去するために、MBNで処理しました。線形化のBACは、エタノール沈殿を行い、フェノール - クロロホルム抽出によってクリーンアップされました。 2つの精製の​​BACの線形化を、0.8％アガロースゲル（ 図5A）で実証されました。フェノール - クロロホルム抽出は、線形化のBACは、RNaseフリーであることを確認するために慎重に行う必要があります。 2線形化のBACのそれぞれがm 7 G（5 &#39;）pppの（5の存在下で、SP6 RNAポリメラーゼを使用してランオフ転写のためのcDNAテンプレートを務め&#39;）キャップアナログ。合成RNAの完全性は、基準1kbのDNAラダー（ 図5B）と一緒に、0.6％アガロースゲル上で2つの転写反応混合物のアリコートを実行することによって示された。この単純なアッセイでは、主要な顕著なRNAバンドが常にちょうど移行しました3キロバイトの下にDNAバンドを参照し、シャープであるように思われました。しかし、分解したRNAは、同じゲルに塗抹外観を持っているでしょう。 感染中心アッセイは、合成RNAの特異的感染を決定するためのゴールドスタンダードです。このアッセイは、（3×10 5細胞/ウェル）、ナイーブBHK-21細胞を含む6ウェルプレート中で10倍段階希釈したエレクトロポレーションした細胞の同等のアリコートを播種し、RNA試料とBHK-21細胞を電気穿孔し、アガロースオーバーレイすることによって行いました細胞単層の上に。 4日間のインキュベーションの後、生存細胞をホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色したの細胞（ 図6A）に送達感染性RNA分子の数に対応する感染性センター（プラーク）の数を、定量化するolution。 インビトロ転写のために用いたcDNAテンプレートは非感染性であることが証明されているため、転写反応混合物の27アリコートを直接エレクトロポレーションに使用しました。エレクトロポレーションは、RNAトランスフェクションのために好ましい方法です。あるいは、RNAは、DEAEデキストラン、およびカチオン性リポソームを用いて、他の方法によってトランスフェクトすることができます。 RNAのエレクトロポレーションは、非常に有効であるが、塩がエレクトロポレーション反応やエレクトロポレーションキュベットが再利用されているか存在している場合は、電気パルスの「アーク放電」は、まれにしか発生しません。 RNAトランスフェクト細胞におけるウイルスタンパク質の発現を、抗NS1ウサギ抗血清（ 図6B）を用いて、免疫蛍光アッセイによって試験しました。 RNAトランスフェクト細胞の上清中に蓄積されたウイルス粒子の産生でしたプラークアッセイ（ 図6C）によってalyzed。これらの実験の結果は、cDNA由来の合成RNA、組換えウイルスの高力価を生成し、許容BHK-21細胞に感染性であることを明確に示します。 <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> オリゴヌクレオチド </td><td> 配列（5 &#39;から3&#39;） </td><td> 位置 b </td><td> 極性 </td></tr><tr><td> 1RT </td><td> TAGGGATCTGGGCGTTTCTG GCAAAT </td><td> 2578-2603 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 1F </td><td> aatcccgggAGAAGTTTATC TGTGTGAACTT </td><td> 1-22 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 1R </td><td> attgcggccgcCCACGTCGT TGTGCACGAAGAT </td><td> 2532-2553 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 2RT </td><td> TTCTGCCTACTCTGCCCCTC CGTTGA </td><td> 5975-6000 </td><td>蟻ISENSE </td></tr><tr><td> 2F </td><td> aatcccgggTCAAGCTCAGT GATGTTAACAT </td><td> 1800-1821 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 2R </td><td> attgcggccgcGATGGGTTT CCGAGGATGACTC </td><td> 5929-5950 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3RT </td><td> ACGGTCTTTCCTTCTGCTGC AGGTCT </td><td> 9426-9451 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 3F </td><td> aatcccgggGAGGATACATT GCTACCAAGGT </td><td> 5500-5521 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 3R </td><td> attgcggccgcGTAAGTCAG TTCAATTATGGCT </td><td> 9380-9401 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4RT </td><td> AGATCCTGTGTTCTTCCTCA CCACCA </td><td> 10952から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> 4F </td><td> aatcccgggAGTGGAAGGCT CAGGCGTCCAA </td><td> 9200-9221 </td><td>センス</td></tr><tr><td> 4R </td><td> attgcggccgcAGATCCTGT GTTCTTCCTCACC </td><td> 10956から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> SP6F </td><td> cataccccgcgtattcccac TA </td><td></td><td>センス</td></tr><tr><td> SP6R </td><td> ACAGATAAACTTCTctatag tgtcccctaaa </td><td> 1-14 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> F1F </td><td> aggggacactatagAGAAGT TTATCTGTGTG </td><td> 1-17 </td><td>センス</td></tr><tr><td> F1R </td><td> TGGATCATTGCCCATGGTAA GCTTA </td><td> 638から662 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X1F </td><td> CGAATGGATCGCACAGTGTG GAGAG </td><td> 8403-8427 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X1R </td><td> AAAGCTTCAAACTCAAGATA CCGTGCTCC </td><td> 9120-9148 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> X2F </td><td> GGAGCACGGTATCTTGAGTT TGAAGCTTT </td><td> 9120-9148 </td><td>センス</td></tr><tr><td> X2R </td><td> cacgtggacgagggcatgcc tgcag </td><td></td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td> ROF </td><td> CCAGGAGGACTGGGTTACCA AAGCC </td><td> 10670から10694 </td><td>センス</td></tr><tr><td> ROR </td><td> agggcggccgctctagAGAT CCTGTGTTCTTCCTCACCAC </td><td> 10954から10977 </td><td>アンチセンスの</td></tr><tr><td colspan="4"> JEV配列は大文字で示されており、BAC配列は小文字で示されています。 Bのヌクレオチド位置は、JEV SA 14 -14-2（Genbank受託番号JN604986）の完全なゲノム配列を意味します。 </td></tr></tbody></table> 表1：cDNA 合成、PCR増幅、およびBAC突然変異誘発に使用したオリゴヌクレオチド。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig1.jpg" /> 図1。0; BACとして JEV SA 14 -14-2の完全長cDNAの構築のための戦略JEV粒子からのウイルスRNAの（A）の単離。 JEV SA 14 -14-2のゲノムRNAの概略図が示されています。全ウイルスゲノムをカバー（B）は、4つの重複するcDNAフラグメントの合成（F4のF1）。 （C）BACベクターに4重複するcDNA断片のサブクローニング、てpBAC / F4にてpBAC / F1を作成します。 （D）in vitroでのランオフ転写のためのクローン化cDNAの変更。 pBAC / F1 SP6は、ウイルス 5 &#39;末端の上流にSP6プロモーター配列を含むてpBAC / F1の誘導体です。 pBAC / F3 KOはサイレント点突然変異（T→9134、アスタリスク）が含まれてpBAC / F3の誘導体です。 pBAC / F4 ROはウイルス3 &#39;末端の下流の人工のXbaIランオフサイトが含まれていてpBAC / F4の誘導体です。 （E </<html>強い&gt;）、全長SA 14 -14-2 BACのアセンブリ（てpBAC / SA 14 -14-2）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig2.jpg" /> JEV SA 14 -14-2 の完全長ゲノムRNAをまたがる4重複cDNA断片（F1〜F4は）図2.合成 。 4 RT-PCR産物は0.8％アガロースゲルでの電気泳動により評価されます。 M、1kbのDNAラダー。 4 cDNA断片の予想サイズは、ゲル画像の下部に表示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /ftp_upload/53164/53164fig3.jpg &quot;/&gt; JEV SA 14 -14-2 の完全長cDNAを含むBAC図3. 精製 BACプラスミドを大腸菌から単離されますSDS-アルカリ溶解法によって大腸菌 DH10Bをさらに塩化セシウム、EtBrを勾配にバンディングによって精製しました。発表16×76ミリメートルシール性ポリプロピレンチューブを使用してのCsCl-EtBrを勾配の一例である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig4.jpg" /> BACで組み立て た全長のJEV SA 14 -14-2 cDNAからの 感染性ウイルスの回収の図4.概要 。cDNAテンプレートの（A）線形化。 JEV BACがで切断されたフルレングスMBNで処理をXba Iと。 （B）RNA転写物の合成。線形化されたcDNAをM 7 G（5 &#39;）pppの（5&#39;）のキャップ類似体の存在下でSP6 RNAポリメラーゼによって転写されます。 （C）の合成JEVsの回収。 in vitroで転写されたRNAは、合成ウイルスの高力価を生成し、エレクトロポレーションにより、BHK-21細胞にトランスフェクトされている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig5.jpg" /> cDNAをテンプレートとして、全長のJEV BACを用いたin vitro 転写により RNAの図5の合成 。線形化、全長のJEV BACの（A）の生成、てpBAC / SA 14 -14-2。 pBACの二つの独立したクローン/ SA 14 -14-2（Cl.1とCl.2）はMBNとXbaIで消化し ​​、その後の処理により直線化されています。線形化されたBACは、0.8％アガロースゲルでの電気泳動によって検査されます。ランオフ転写によって合成RNAの（B）の製造。 2線形化のBACのそれぞれは、SP6 RNAポリメラーゼランオフ転写のための鋳型として使用します。 2つの転写反応物のアリコートを、0.6％アガロースゲル上で実行されています。 Mは、1キロバイトのDNAラダー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/53164/53164fig6.jpg" /> 全長のJEVのBACおよび合成ウイルスの回収から転写された合成RNAの図6.特定の感染。BHK-21細胞はモックエレクトロポレーション（モック）であるか、又はFRに由来するRNA転写産物を電気穿孔全長のJEV BAC（Cl.1とCl.2）の二つの独立したクローンのそれぞれをOM。 （A）RNAの感染力。細胞は、アガロースを重層し、トランスフェクション後4日目にクリスタルバイオレットで染色します。 RNAの感染性細胞（左パネル）にエレクトロポレーション、感染性RNAの量を推定するために、感染中心アッセイにより決定されます。また、感染性センターの代表画像（​​右パネル）が示されています。 （B）タンパク質発現。細胞を4ウェルチャンバースライド中で培養します。 20時間後、トランスフェクション（HPT）において、RNAエレクトロポレーションした細胞におけるウイルスタンパク質の発現は一次抗NS1ウサギ抗血清および二次Cy3結合ヤギ抗ウサギIgG（赤色）を用​​いて免疫蛍光アッセイにより分析されます。核を4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（青）で対比されています。免疫蛍光画像は、対応する微分干渉コントラスト画像にオーバーレイされます。 （C）ウイルス収量。細胞は1で培養します50 mmの培養皿。 22と40 HPTで、RNAエレクトロポレーションした細胞の培養上清中に蓄積された感染性ビリオンの生産をプラークアッセイにより検討されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53164/53164fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

ここでは、日本脳炎ウイルスの正鎖ゲノムRNAの完全長cDNAを含む感染性細菌人工染色体を作成するためのプロトコルが提示されます。このプロトコルは、他のポジティブストランドRNAウイルスの機能的cDNAを構築するために使用できるため、ウイルス生物学を研究するための強力なゲノムツールとなります。

細菌人工染色体：プラス鎖RNAウイルスの研究のための機能ゲノミクスツール

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

この手順の全体的な目的は、日本脳炎ウイルスのように、ゲノムが細胞内mRNAと同じ極性を持つプラス鎖RNAウイルスのクローンcDNAから、感染性ウイルス粒子を回収することです。このcDNAに基づくリバースジェネティクスは、ウイルスゲノムRNAの直接的な操作を可能にする画期的な手法であり、これによりウイルスの複製や病原性の分子遺伝学的研究のための組換えウイルスを生成することができます。また、この技術は、外来遺伝子を導入するための遺伝学的に定義されたワクシニアウイルスベクターの開発を可能にする貴重なプラットフォームを提供します。これらの手法は、陰性または陽性株、および特に10 kb以上のゲノムを持つRNAウイルスのフルレングスcDNAクローニングに適用可能です。本手順の実演は、私の研究室のメンバーであるリサーチアシスタントのSang-Im Yun、ポストドクターのByung-Hak SongとJin-Kyoung Kim、および学部生のJordan Frankが行います。本出版物のビデオパートでは、目的の配列を含む細菌人工染色体（BAC）の調製、バックプラスミドから転写されたRNAの合成、およびRNAの感染性とウイルス収量の測定方法について解説します。BACプラスミドを作成する前に行うすべての手順は、テキストプロトコルに詳細に記載されています。本手順では、まず BACプラスミドを保持する E. coli DH10B の単一コロニーを、クロラムフェニコールを含む 3 mL の 2X YT ブロスで培養します。この培養物を 35 °C で、225 ～ 250 RPM で振盪しながら 10 時間インキュベートします。10時間後、培養をスケールアップします。次に、500 µLの培養液を500 mLの培地に接種し、激しく振盪しながら6時間培養します。6時間後、細菌培養液を250 mLボトル2本に入れ、4°Cで3,100 g、15分間遠心分離します。その後、各ペレットを30 mLのGTE溶液で再懸濁します。リゾチームを500 µL加え、懸濁液を氷上で10分間インキュベートします。その間に、次のステップで使用する新鮮な溶解液を準備します。10分後、溶解液を60 mL加え、溶液が透明になるまで旋回混和します。室温で10分間反応させます。次に、各ボトルに45 millilitersの中和溶液を加え、十分に混ざるまでボトルを転倒混和させます。その後、氷上で10分間静置します。高gの冷却遠心分離により、中和されたライセートを回収します。次に、上清を2本の新しい250 mLボトルに回収します。それぞれに0.6体積の100%イソプロパノールを加え、氷上で20分間静置します。次に、沈殿物を遠心分離して回収し、上清を捨てて、ペレットを5 mLのTEバッファーに溶解します。2つの液量を1本の50 mLチューブにまとめ、等量の5 M塩化リチウムを加えて混合物を氷上で10分間インキュベートし、RNAを沈殿させます。20分間の冷却遠心分離を行い、RNA沈殿物を回収します。次に、上清を新しい 250 milliliter チューブに移し、2倍量の 100%isopropanol を加えてチューブを氷上に置き、DNAを沈殿させます。20分後、遠心分離で沈殿物を集め、上清を吸引除去し、DNAペレットを 9.5 milliliters のTE buffer で再懸濁させ、DNA溶液を 50 milliliter チューブに移します。エチジウムブロミドを用いた塩化セシウム密度勾配を調製し、準備を続けます。18ゲージの針を装着したシリンジを用いて、混合液を密封可能なポリプロピレンチューブに充填し、チューブを密封します。密封したチューブを超遠心機で一晩回転させ、塩化セシウム密度勾配を形成させます。翌日、塩化セシウム密度勾配からBACプラスミドのDNAバンドを回収します。18Gの針を用いて勾配の上部に空気抜き穴を作り、20Gの針とシリンジを用いて勾配の側面からBAC DNAを回収し、回収物を1.7 mLマイクロ遠心チューブに移します。洗浄を行うため、2.5容量分の飽和ブタノール水を加え、通常通りボルテックスで混合します。次に、混合液を室温で遠心分離し、下層の水相を新しい1.7 milliliterのマイクロ遠心チューブに移します。エチジウムブロマイドを完全に除去するため、この洗浄操作を計6回繰り返します。続いて、BAC DNAを沈殿させます。チューブに、液量の1/10量となる3 molar酢酸ナトリウムと、2.5 volumesの100% ethanolを加えます。混合液を氷上で10分間インキュベートします。その後、沈殿物を室温で遠心分離し、DNAペレットを1 milliliterの70% ethanolで洗浄します。再度遠心分離を行い、ペレットを回収します。最後に、ペレット化したDNAを10分間風乾させ、200 microlitersのTE bufferで溶出させます。まず、合計100 µLの液量で、Xba-oneを用いてBACプラスミドの大スケール制限酵素消化を行います。この消化反応を37 °Cで12〜15時間実施します。次に、さらに25 unitsのムング豆ヌクレアーゼを加え、30 °Cで2時間追加でインキュベートします。インキュベーション後、蒸留水を用いて液量を300 µLまで調整します。次に、希釈したサンプルに等量のフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、1分間激しくボルテックスし、チューブを遠心分離して上層の水相を新しいチューブに移すことで、フェノール抽出を行います。次に、クロロホルムを用いて抽出を繰り返します。続いて、エタノール沈殿により直線化したBAC DNAを回収します。遠心分離でDNAペレットを回収し、上清を捨てて、1 mLの70%エタノールでペレットを洗浄します。再び遠心分離を行い、ペレットを風乾させます。10分間乾燥させた後、DNAペレットを30 µLの蒸留水に溶解させます。その後、回収したBAC 1 µLを0.8%アガロースゲルで確認します。次に、RNA定量用のトリチウム標識UTPを含め、線状化したBAC DNAを用いて25 µLのランオフ転写系を構築します。反応を37 °Cで1時間行います。その後、ランオフ転写反応液の1〜2 µLを0.6%アガロースゲルで確認します。150 mmディッシュに1枚あたり3 million cellsで播種し、24時間培養したBHK-21細胞を用います。細胞単層を冷たい溶液Aで洗浄し、トリプシン処理により細胞を剥離させます。270 gで2分間遠心分離し、細胞を回収します。次に、細胞を50 millilitersの冷えた溶液Aに再懸濁し、再度遠心分離します。この洗浄操作を3回繰り返します。最後の洗浄後、細胞を溶液Aを用いて20 million per milliliterの濃度で再懸濁します。その後、細胞懸濁液の400 microliter分注量を、2 microgramsの合成RNAとともに2 millimeterキュベット内で混合します。最適な条件下で速やかに混合液をエレクトロポレーションし、細胞を10分間静置させる。次に、細胞を600 µLの完全培地を含むマイクロ遠心チューブに移す。続いて、エレクトロポレーション後の細胞を1 mL量で10倍段階希釈して調製する。各希釈液を100 µLずつ、BHK21細胞のモノレイヤー上に播種する。4〜6時間インキュベートした後、FBS添加MEMに0.5%アガロースを加えたものを細胞の上に重層し、さらに4日間培養する。BHK21細胞を、モック電極導入するか、あるいはフルレングスのJEV-BACの2つの独立したクローン由来のRNA転写物を電極導入した。4日後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、細胞内の感染性RNAを観察した。この染色を用いて、感染中心（infectious centers）を定量化した。次に、RNA電極導入後の20時間において、抗NS1ウサギ抗血清および赤色に見えるCy3結合二次抗体を用いて、ウイルス蛋白の発現を調べた。核は青色に見えるDAPIで対比染色した。その後、導入後22時間および40時間において、RNA電極導入細胞の培養上清に蓄積した感染性ビリオンの産生量をプラークアッセイにより調べた。このビデオを視聴することで、日本脳炎ウイルスなどの陽性株のクローニングされたcDNA、またはRNAから、感染性ウイルスを完全にレスキューする方法について深く理解することができます。日本脳炎ウイルスやその他のヒト病原体を扱うことは非常に危険であることに留意してください。この手順を実施する前に、適切なバイオセーフティトレーニングを受ける必要があります。

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