ラピッド

本手順の全体的な目的は、パラホルムアルデヒド固定済みの脳組織に対して迅速なin situハイブリダイゼーションを行うことです。これは、まず脳組織切片を脱水し、前処理試薬1、2、および3で処理することで達成されます。次のステップでは、切片を一次オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズさせ、その後、二次、三次、および四次プローブでハイブリダイズさせます。

次に、標的RNAを検出するためにファストレッド基質を加えます。最終ステップとして、Image Jソフトウェアを用いてmRNAシグナルのレベルを定量します。最終的に、実験群と対照群を比較することで、RNA遺伝子発現の変化を得ることができます。

本手法の既存手法に対する主な利点は、比較的簡便で安価かつ再現性が高く、完了までに2日もかからない点にあります。本研究は、私とRoss University School of Veterinary MedicineのJohn Jay Lenan、およびFlorida Atlantic University College of MedicineのJean SozaとRU Taoによって開発されました。本手順では、脱水処理にあたり、-80 °Cのフリーザーに保管されている顕微鏡スライドボックスから4枚のスライドを取り出します。

P-P-I-B-D-A-P-BおよびHT two A遺伝子の試験セクションを割り当て、ボールペンでマークしてラベルを貼ります。次に、スライドを室温の100% alcoholに5分間浸します。その後、ドラフトチャンバー内でスライドを5分間乾燥させます。前処理として、各セクションに前処理用試薬1を20 µLずつピペットで添加し、スライドを湿潤トレイのラックレールに置きます。

水平シェーカーを用いて、低速で10分間、水分トレイを静かに振盪させます。次に、2回、2分間ずつ二重蒸留水でスライドを洗浄します。その後、前処理試薬2を450 milliliters含ませた1000 milliliterのビーカーにスライドを浸します。

次に、RNA構造を復元させるため、スライドを100 °Cで計5分間煮沸します。その後、二回蒸留水で2分ずつ2回洗浄します。スライドを100%アルコールに5分間浸します。

その後、スライドを5分間乾燥させます。ドラフトチャンバー内で、疎水性ペンを使用して組織切片の選択領域の周囲に円を描きます。続いて、プローブの浸透性を高めるために、各選択領域に前処理試薬3を10 µLずつピペッティングし、水分保持トレーに蓋をします。

次に、水平シェーカーを備えたハイブリダイゼーションオーブンにトレイを入れます。オーブンの温度を40 °Cに設定し、トレイを30分間緩やかに振盪させます。その後、スライドを2回、それぞれ2分間ずつ二回蒸留水で洗浄します。このステップで、選択した領域に10 µLのP-P-I-B-D-A-P-BまたはHTR two Aプローブをピペットで分注します。

次に、試薬の蒸発を防ぐため、水分保持トレーに蓋をします。オーブン内で40 degrees Celsiusで2時間インキュベートしながら、水平シェーカーを用いて低速でスライドを静かに振盪させます。続いて、洗浄バッファーでスライドを2分間ずつ2回洗浄し、選択した各領域に増幅試薬1を10 microlitersずつピペットで分注します。

スライドを40 °Cで30分間振盪しながらインキュベートします。次に、洗浄バッファーを用いてスライドを1回につき2分間、2回洗浄し、選択した各領域に増幅試薬2を10 µLずつピペットで加えます。スライドを40 °Cで15分間振盪しながらインキュベートします。

その後、スライドを洗浄緩衝液で2分間、2回洗浄します。毎回、選択した各領域に増幅試薬3を10 µLずつピペットで分注します。スライドを振盪し、40 °Cで30分間インキュベートします。

次に、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬4を10 µLずつピペットで滴下します。シェイクしながら、スライドを40 °Cで15分間インキュベートします。

次に、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬5を10 µLずつピペットで点滴します。シェイカーで振盪しながら、室温で30分間インキュベートします。

続いて、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬6を10 µLずつピペットで滴下します。シェーカーで振盪しながら、室温で15分間インキュベートします。

次に、洗浄バッファーを用いてスライドを再度2回、各2分間洗浄します。続いて、選択した各領域に赤色試薬を10 µLずつピペットで滴下し、スライドを室温の水平シェーカー上の保湿トレイに置き、低速で10分間静かに振盪させます。その後、2回、二重蒸留水を用いて10分間スライドを洗浄します。

毎回、スライドをオーブンにて60 °Cで15分間乾燥させます。その後、スライドをドラフトチャンバー内でキシレンに5分間浸します。次に、選択した各領域にキシレンベースのマウント剤を20 µLピペッティングし、カバーガラスで覆います。

このステップでは、画像ファイルをメインのImageJウィンドウにドラッグ＆ドロップします。メニューバーから「Image」を選択してください。次に、ドロップダウンメニューから「Type」を選択し、「8-bit」を選択します。

次に、「adjust」を選択し、さらに「threshold」を選択してダイアログボックスを開きます。ダイアログボックス内の下限バーの値を調整し、不要な背景を除去します。メニューバーに移動して「Analyze」を選択し、次に「analyze particles」を選択して2つ目のダイアログボックスを開きます。

粒子サイズを10に設定します。次に、「show outlines」を選択し、「display results」と「summarize boxes」を選択します。最後に、「okay」をクリックして、ダイアログボックスで粒子データを確認します。

スプレッドシートでの計算では、データをExcelシートに入力し、生理食塩水群の粒子数の平均をベースラインとして設定します。次に、各セクションのパーセントレベルを算出し、それに基づいてグラフを作成します。ここでは、赤点で示されたハイブリダイゼーションシグナルの光学顕微鏡像を示します。

生理食塩水およびMDMAを事前に投与し、深く麻酔したラットの組織をパラホルムアルデヒドで固定しました。使用したオリゴヌクレオチドプローブはD-A-P-B-P-P-I-BおよびHT two Aです。この図は、MDMAを事前に投与したラットにおける視床下部のHT two A遺伝子発現への影響を示しており、HT two, a発現の20%減少が観察されました。この手法により、神経科学分野の研究者が、パラホルムで固定した脳組織を用いたin situハイブリダイゼーションによって、メッセンジャーRNAの遺伝子発現をより容易に測定できるようになります。