ラピッドその場でハイブリダイゼーション

この手順の全体的な目標は、パラフォームアルデヒド接頭辞付き脳組織でC2の迅速なハイブリダイゼーションを実行することです。これは、最初に脳組織切片を脱水し、前処理1、2、および3の試薬で切片を処理することによって達成されます。第2ステップは、切片を第一級オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、次に第2、第3、第4のプローブとハイブリダイズすることです。

次に、高速赤色基質を添加して、ターゲットRNAを検出します。最後のステップは、Image JソフトウェアでmRNAシグナルのレベルを定量化することです。最終的には、実験群と対照群を比較することで、RNA遺伝子発現の変化を得ることができます。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、比較的単純で、安価で再現性があり、完了までに2日もかからないことです。この研究は、私とロス大学獣医学部のJohn Jay Lenan氏、フロリダアトランティック大学医学部のJean Soza氏とRU Tao氏によって開発されました。この手順では、彼女の脱水症は、マイナス摂氏80度の冷凍庫に保管された顕微鏡スライドボックスから4枚のスライドを取ります。

P-P-I-B-D-A-P-BおよびHTの2つのA遺伝子の検査に切片を割り当て、ボールペンで標識します。次に、スライドをアルコール100%に室温で5分間浸します。その後、各セクションに1つの試薬を前処理ピペット20マイクロリットルのヒュームフードでスライドを5分間乾燥させ、水分トレイのラックレールにスライドを置きます。

水平シェーカーでモイスチャートレイを低速で10分間静かに振ってください。次に、スライドを二重蒸留水で2分間2回洗います。スライドを前処理2試薬の450ミリリットルを含む1000ミリリットルのビーカーに浸します。

次に、スライドを100°Cで合計5分間煮沸し、RNA構造を回復させます。その後、スライドを二重蒸留水で2回、毎回2分間洗浄します。スライドを100%アルコールに5分間置きます。

次に、スライドを5分間乾かします。ヒュームフードで、疎水性ペンを使用して、ティッシュセクションの選択した領域の周りに円を描きます。続いて、前処理3試薬の10マイクロリットルを各選択領域にピペットで注入し、プローブの浸透性を高め、水分トレイを蓋で覆う。

次に、水平シェーカーを備えたハイブリダイゼーションオーブンにトレイを置きます。オーブンの温度を摂氏40度に設定し、トレイを30分間静かに振ってくださいその後、スライドを二重蒸留水で毎回2分間2回洗います。このステップでは、選択した領域に10マイクロリットルのP-P-I-B-D-A-P-BまたはHTR two Aプローブをピペットで固定します。

次に、試薬の蒸発を防ぐために、水分トレイを蓋で覆います。水平シェーカーでスライドを低速で静かに振とうし、オーブンで摂氏40度で2時間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2回ずつ2分間ずつ洗浄し、選択した各領域に10マイクロリットルの増幅試薬をピペットで移す。

スライドを振って、摂氏40度で30分間インキュベートします。次いで、スライドを洗浄バッファーで2回ずつ2回洗浄し、選択した各領域に増幅2試薬の10マイクロリットルをピペットで注入する。スライドを振って、摂氏40度で15分間インキュベートします。

その後、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。毎回、選択した各領域に増幅3試薬の10マイクロリットルをピペットで移します。スライドを振って、摂氏40度で30分間インキュベー

次に、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。選択した各領域に増幅4つの試薬を10マイクロリットルピペットで取り付けます。スライドを振って、摂氏40度で15分間インキュベートします。

次に、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。選択した各領域に増幅5つの試薬を10マイクロリットルピペットします。スライドを振盪し、室温で30分間インキュベー

その後、スライドを洗浄バッファーで2分間2回洗浄します。選択した各領域に増幅6試薬の10マイクロリットルをピペットします。スライドを振盪し、室温で15分間インキュベー

次に、スライドを再度2回、洗浄バッファーで毎回2分間洗浄します。次に、選択した各領域に10マイクロリットルの赤い試薬をピペットで移動し、スライドを水平シェーカーの水分トレイに室温で置き、低速で10分間静かに振とうします。次に、スライドを二重蒸留水で10分間2回洗います。

毎回、スライドをオーブンで摂氏60度で15分間乾燥させます。その後、スライドをキシレンのヒュームフードに5分間置きます。次に、選択した各領域に20マイクロリットルのキシレンベースの封入剤をピペットで固定し、カバースリップで覆います。

この手順では、画像ファイルをメイン画像Jウィンドウにドラッグアンドドロップします。メニューバーに移動し、画像を選択します。次に、ドロップダウンメニューからタイプを選択し、8ビットを選択します。

次に、[調整]を選択し、[しきい値]を選択してダイアログボックスを開きます。ダイアログボックスの下側のバーの値を調整して、不要な背景が削除されるようにします。メニューバーに移動して「分析」を選択し、「パーティクルの分析」を選択して 2 つ目のダイアログボックスを開きます。

粒子サイズを 10 に設定します。次に、[アウトラインの表示] を選択し、[結果の表示] と [集計ボックス] を選択します。最後に、[OK] をクリックして、ダイアログ ボックスにパーティクル データを表示します。

スプレッドシート計算では、データをExcelシートに入力し、生理食塩水グループ内の粒子の数をベースラインとして平均化します。次に、各セクションのパーセンテージレベルを計算し、それに応じてグラフを作成します。これは、赤い点で示されているハイブリダイゼーションシグナルの光顕微鏡図です。

以前に生理食塩水とMDMAで治療された深く麻酔されたラットでは、組織にパラホルムアルデヒドが接頭辞として付けられました。使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、D-A-P-B-P-P-I-B、およびHT two A.この図は、以前にMDMAで治療したラットにおける視床下部HT two A遺伝子発現への影響を示し、HT twoの発現が観察された。この技術により、神経科学の分野の研究者は、脳組織の高さを接頭辞として付加したパラフォームのin situ化を使用して、メッセンジャーRの遺伝子発現を測定することが容易になります。