Name: ラピッドその場でハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶラット脳組織における迅速なその場でハイブリダイゼーション法。パラホルムアルデヒド固定脳切片を用いて、セロトニン受容体遺伝子htr2aの発現を検出し、神経科学研究における遺伝子発現解析を効率化します。

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この研究は、NIHの助成金（R15DA029863）、フロリダアトランティック大学の学部研究助成金（M30014）と獣医学の研究助成金のロス大学によってサポートされていました。我々は、この作業のために（±）3,4-メチレンジ（±MDMA）を提供するための国立薬物乱用研究所（メリーランド州ロックビル）を感謝したいと思います。

以下で説明する動物の使用手順は、獣医、フロリダアトランティック大学のロス大学での施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されました。無菌テクニックと手袋が必要ですが、このプロトコルを使用している間、RNaseフリーの環境は必要ありません。 1.準備<ol><li>組織の調製と切片<ol><li>三つのグループに無作為にラットを割り当てます;、SAL /接頭辞および/ ​​3,4-メチレンジ接頭辞新鮮/生理食塩水（0.9％のNaCl SAL）（MDMAを、 表1で詳細を参照してください）。 </li><li> 2時間間隔でSALとMDMAのグループに、腹腔内に、それぞれ1ミリリットル/ kgのSALおよび10mg / kgのMDMAの3用量を投与。動物は6日間の治療を生き残るためにできるようにします。 </li><li> 7日目に、深い麻酔（ すなわち 、角膜の点滅の損失とTAのためにラットに腹腔内に5mg / kgのキシラジンの組み合わせでは100mg / kgのケタミンの投与IL）は反射神経をつまみます。 </li><li>新鮮/ SALグループの場合、速やかに（参考文献5で詳細を参照）、ラットを刎ねる、新鮮な脳のテストのための脳を削除します。 </li><li> SAL /接頭辞と接頭辞/ MDMAのグループの場合、胸骨約10 -12 cmのに沿ってカットを行い、その後、胸骨の終わりを公開します。 </li><li>止血剤と胸骨の端を持ち、鋭いハサミで両側に横方向に振動板をカットして、肋骨と肺に平行全体に上方カット。 </li><li>片手で、小さなピンセットで心臓の腹側先端を保持します。もう一方の手で、18 Gの注射針を用いて左心室を穿刺（針のアダプタ側を氷冷SAL及びパラホルムアルデヒドコンテナおよび蠕動ポンプにY字型のシリコンホースが接続されている注意してください。参照9を参照してください ）。 </li><li>流量（約5 ml /分）の中レベルのSALポンプの電源をオンにし、リターンCIRCの脱出を可能にするために鉗子で右心房を穿刺ピュレーション。 30分間SAL灌流を維持します。 </li><li>中レベルのパラホルムアルデヒドポンプの電源をオンにし、氷冷4％パラホルムアルデヒドを30分間動物を灌流することができます。 </li><li>灌流装置を取り外して、動物を首を切ります。頭蓋骨の正中線を切断posteroanteriorを行い、その後、頭蓋骨の空洞10を露出するために頭蓋骨フラップ。 </li><li>頭蓋骨の空洞からへらで脳を取り出し、4％パラホルムアルデヒドの25ミリリットルを含む50 ml遠心チューブに脳を置きます。 24時間4ºCの冷蔵庫でパラホルムアルデヒド含有チューブ内の脳をしてください。 </li><li> 3日間4ºCで30％ショ糖溶液25mlを含む50 mlの遠心管に脳に移動します。最後に、使用するまで-80℃でのビニール袋の中に脳を格納します。 </li><li>埋め込むメディアとチャックの脳をマウントし、-26ºCの温度でクライオスタットで脳を含む埋め込むメディアを凍結します。新鮮なフリーズをカットnは20μmのセクションに脳とパラホルムアルデヒド接頭辞脳10μmのセクションに。セクションにスライドに触れることにより、RTの顕微鏡スライドにセクションを転送します。 </li><li>空気乾燥、室温で4時間。使用するまで-80℃でタイトな密封された袋に切片スライドを保管してください。 </li></ol></li><li>脱水<ol><li> -80℃の冷凍庫からスライドを取り、3つのテストにセクションを割り当てる：HT2A、PPIB（ポジティブコントロール）またはのdapB（陰性対照）。ボールペンでマークとラベルのセクション（鉛筆は使用しないでください）​​。室温で5分間、100％アルコールでスライドを沈めます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。 </li></ol></li><li>前処理<ol><li>スライド上のセクションへの前処理-1試薬（アルカリホスファターゼの不活性化）のピペットを20μl。 （トレイが反応solutioからの蒸発を防止するための高湿度を維持するために、蓋で覆われていることに注意して水分トレイのラックレールにスライドを置きますN）。 </li><li>ゆっくり10分間低速で水平シェーカー上で水分トレイを振ります。 2分間の二重蒸留水 （ddH 2 O）で二回スライドを洗浄します。前処理-2試薬（パラホルムアルデヒド固定によって誘発される架橋結合の破壊）の150ミリリットルを含む200ミリリットルビーカーでスライドを沈めます。 100ºC（RNA構造11の熱による復元）で5分間の合計スライドをゆでます。 </li><li> 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。 5分間、100％アルコールでスライドを置きます。ヒュームフード中で5分間スライドを乾燥させます。組織セクションで選択した領域の周りに円を描くように疎水性のペンを使用して（例えば、 図2で説明したように視床と視床下部を含む非皮質構造）。 </li><li>ピペット10の各選択領域に前処理-3試薬（プローブの浸透の増加）のμL、および蓋を水分トレイをカバーしています。ハイブリダイゼーションオーブンでトレイを置きます水平シェーカーを搭載し、40ºCでオーブンの温度を設定します。 30分間穏やかトレイを振ります。 2分間のddH 2 Oで二回スライドを洗浄します。 </li></ol></li></ol> 2.ハイブリダイゼーションおよび増幅<ol><li>選択された領域にそれぞれHTR2A、PPIBとのdapBプローブ試薬のピペット10μL、。試薬の蒸発を防止するための蓋付き水分トレイを覆います。静かに低速で水平シェーカーセットに振ります。 2時間オーブンで40ºCでスライドをインキュベートします。 </li><li> 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-1試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。 </li><li> 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-2試薬ピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。 </li><li>スライドを2回洗浄ワット2分間の洗浄バッファー番目。選択した各領域に増幅-3試薬のピペット10μL、30分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。 </li><li> 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-4試薬のピペット10μL、15分間40ºCでスライドを振るとインキュベートします。 </li><li> 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-5試薬ピペット10μL、室温で30分間スライドを振るとインキュベートします。 </li><li> 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。選択した各領域に増幅-6試薬ピペット10μL、15分間室温でスライドを振るとインキュベートします。 2分間の洗浄用緩衝液で2回スライドを洗浄します。 </li></ol> 3.信号検出<ol><li>選択した各エリアにレッド試薬のピペット10μL（試薬は1:60の比率で赤-BとRed-Aの混合物であると私使用されるべきであることに注意してくださいmmediately）。 RTで水平シェーカー上水分トレイにスライドを置き、10分間低速で軽く振ります。 </li><li> 10分間（のddH 2 O）で2回スライドを洗浄します。 15分間オーブンで60ºCでスライドを乾燥させます。 5分間ヒュームフードの下でキシレンにスライドを置きます。ピペット選択した各領域にキシレン系取り付けメディアの20μLとカバーガラスでカバーします。 </li></ol> 4.イメージキャプチャ<ol><li> 4×20×対物レンズの倍率で選択された領域（ 例えば、視床下部は、1と3図 ）のデジタル顕微鏡写真を取ります。画像ファイルを保存します。 </li></ol> 5.画像の粒子解析<ol><li>ドラッグして、メインImageJのウィンドウに画像ファイルをドロップします。メニューバーに移動し、「イメージ」を選択し、隣のドロップダウン・メニューから「タイプ」を選択し、「8ビット」を選択します。 </li><li>選択し、 &#39;のThrを選択し、「調整」esholdは &#39;ダイアログボックスを開きます。不要なバックグラウンドが除去されるように、ダイアログボックス内の下のバーの値を調整します。その後、2番目のダイアログボックスを開くには、「粒子の分析」を選択し、メニューバーに移動し、「分析」を選択します。 </li><li> 10で粒子のサイズを設定し、次の「表示のアウトライン」を選択し、「結果の表示」と「集計」ボックスをオンにします。最後に、ダイアログボックスでパーティクルデータを表示するには「OK」をクリックします。 </li></ol> 6.スプレッドシート計算<ol><li> Excelシートにデータを入力し、ベースラインとして、SALグループ内の粒子の数を平均します。各セクションのパーセンテージレベルを計算し、それに応じてグラフ（ 図4）を作ります。 </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
<li>Bosch, O. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verbal+memory+deficits+are+correlated+with+prefrontal+hypometabolism+in+18FDG+PET+of+recreational+MDMA+users%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+On%22%5BJournal%5D)">Verbal memory deficits are correlated with prefrontal hypometabolism in 18FDG PET of recreational MDMA users.</a> PLoS On. 8, e61234(2013).</li>
<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
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<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
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<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

in situハイブリダイゼーションテストの主な懸念事項の1つは、RNase酵素のためにRNA保存に使用される適切な技術を選択することです。これらの酵素が細胞や環境に広く存在し、結果に影響を与える可能性があることはよく知られています。しかしながら、酵素活性は、組織をドライアイス/アルコール溶液5,12に入れることによって迅速に区別することができる。リボプローブ13を使用したハイブリダイゼーションには迅速な保存が重要ですが、オリゴヌクレオチドプローブの実験条件についてはほとんど知られていません。オリゴヌクレオチドプローブを用いたこの研究では、パラホルムアルデヒドが接頭辞が付けられた脳と、氷/アルコール溶液中で素早く保存された新鮮な脳との間に差はないことがわかりました。これは、パラホルムアルデヒドをプレフィックスした脳RNAが、オリゴヌクレオチドプローブを使用したハイブリダイゼーションの品質に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆しています。接頭辞付きの脳は新鮮な脳と比較して簡単に切片化できるため、このプロトコルはハイブリダイゼーションテストのための代替組織準備を提供します。</p...

セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン;5-HT)症候群は、抗うつ薬1などの5-HT促進薬によって引き起こされる急性神経障害であり、同時に娯楽目的でのMDMA使用の状況でも発生します2。急性症候群に関連して発生する気分のむら、学習、記憶障害の原因となる分子メカニズムはよく理解されていません3,4。 In situハイブリダイゼーションは、シングルセルレベルで発現する可能性のある特定のmRNAの検出と定量を可能にする強力な研究ツールです。in situハイブリダイゼーションを行う従来の方法は、目的の遺伝子を特異的にハイブリダイズする放射性標識リボプローブを利用することです。しかし、主な欠点は、この方法では複雑で時間のかかるプローブ調製とハイブリダイゼーションのステップ、およびRNaseフリーの環境で維持された新鮮な凍結組織へのアクセスが必要になることです5,6。
>jove_content<オリゴヌクレオチドプローブは、リボプローブ7に必要なものよりも短いRNA断片をハイブリダイズするために最近開発されました。さらに、プローブは特異性を犠牲にすることなく、低いバックグラウンドシグナルを生成する8。 この新たに開発されたプローブ技術は、免疫細胞化学研究室で一般的に入手可能なパラホルムアルデヒド接頭辞を有する脳組織上でin situハイブリダイゼーションを使用することができます。
ここでは、パラホルムアルデヒド接頭辞付きラット脳上のオリゴヌクレオチドプローブを用いたin situハイブリダイゼーションのプロトコルを説明し、新鮮な凍結脳5,6で観察された知見と比較します。このプロトコルは、MDMA物質の乱用が脳内の5-HT2A受容体遺伝子htr2a mRNAの変化を引き起こすという仮説を検証するために使用されます。まず、MDMA処理を行い、その後、パラホルムアルデヒド組織灌流、thr2aプローブのin situハイブリダイゼーション、データ解析を行いました。dapB(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする細菌の遺伝子)はネガティブコントロールとして、ppiB(ペプチジルプロリルイソメラーゼBをコードするハウスキーピング遺伝子)はポジティブコントロールとして使用されることに注意してください。

<table><tbody><tr><td>RNAscope ネガティブコントロールプローブ-DapB</td><td>高度な細胞診断、INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>高度な細胞診断、INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope 2.0 HD 試薬キット - Red</td><td>高度な細胞診断、INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope プローブ - Rn-Ppib</td><td>高度な細胞診断、INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rat Htr2a</td><td>高度な細胞診断、INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>水平シェーカー</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション オーブン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス 顕微鏡スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>疎水性ペン</td><td>ベクトル</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

ラピッド<em&gt;その場で</emセロトニン症候群のラットのパラホルムアルデヒド接頭辞脳にオリゴヌクレオチドプローブを使用して&gt;ハイブリダイゼーション

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-メチレンジオキシメタンフェタミン(MDMA;エクスタシー)の毒性は、急性セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン;5-HT)症候群によるセロトニン作動性mRNA発現の領域特異的な変化を引き起こす可能性があります。この仮説は、セロトニン5-HT2A受容体遺伝子htr2aを検出するためにin situハイブリダイゼーションを使用して検証できます。従来、放射性リボプローブを用いたこのような手技は、数日かかる複雑なワークフローや、RNaseフリーの環境に保存された新鮮な凍結組織を使用する必要があるという難しさから困難でした。最近、短いオリゴヌクレオチドプローブの開発により、in situハイブリダイゼーション手順が簡素化され、パラホルムアルデヒド接頭辞を持つ脳切片の使用が可能になりました。ここでは、接頭辞を付けた脳組織に非放射性オリゴヌクレオチドプローブを用いた詳細なプロトコールについて説明します。この研究に使用したハイブリダイゼーションプローブには、dapB(ジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードする細菌遺伝子)、ppiB(ペプチジルプロリルイソメラーゼBをコードするハウスキーピング遺伝子)、およびhtr2a(5-HT2A受容体をコードするセロトニン遺伝子)が含まれます。この方法は、比較的簡単で、安価で、再現性があり、完了するのに2日未満しかかかりません。

（NT &lt;25）オリゴヌクレオチドのRNAプローブを用いて、ハイブリダイゼーションはパラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結脳から調製した視床下部細胞における赤い点として検出することができます。 HTR2Aの mRNA分子は、（実線の矢印で示される）いくつかの細胞中に存在するが、他のものではない（白抜き矢印）。我々は、パラホルムアルデヒド、接頭辞及び新鮮凍結組織（ 図1）との間に差がないことを観察しました。成功したハイブリダイゼーションは、肉眼（ 図2）により最初に評価することができます。我々はのdapBプローブとハイブリダイズ （丸印）選択した領域は、肉眼（ 図2A-B）に可視シグナルを示さなかったことがわかりました。対照的に、PPIBプローブとハイブリダイズ領域は均一領域全体に分配された信号を示した（ 図2C-D）を調べました。 HTR2A試験でながら、信号は、矢印で示す（一定の核内に存在します。 <strongすべての...

このプロトコルは、パラホルムアルデヒド接頭辞を持つ脳に理想的な迅速かつ簡素化されたin situハイブリダイゼーション法を説明しています。したがって、新鮮な凍結組織を使用しながら、長時間の複雑なステップの必要性を減らすことができます。 この方法は、ラットのセロトニン5-HT2A受容体遺伝子htr2aの同定を使用して検証されます。

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

本手順の全体的な目的は、パラホルムアルデヒド固定済みの脳組織に対して迅速なin situハイブリダイゼーションを行うことです。これは、まず脳組織切片を脱水し、前処理試薬1、2、および3で処理することで達成されます。次のステップでは、切片を一次オリゴヌクレオチドプローブでハイブリダイズさせ、その後、二次、三次、および四次プローブでハイブリダイズさせます。次に、標的RNAを検出するためにファストレッド基質を加えます。最終ステップとして、Image Jソフトウェアを用いてmRNAシグナルのレベルを定量します。最終的に、実験群と対照群を比較することで、RNA遺伝子発現の変化を得ることができます。本手法の既存手法に対する主な利点は、比較的簡便で安価かつ再現性が高く、完了までに2日もかからない点にあります。本研究は、私とRoss University School of Veterinary MedicineのJohn Jay Lenan、およびFlorida Atlantic University College of MedicineのJean SozaとRU Taoによって開発されました。本手順では、脱水処理にあたり、-80 °Cのフリーザーに保管されている顕微鏡スライドボックスから4枚のスライドを取り出します。P-P-I-B-D-A-P-BおよびHT two A遺伝子の試験セクションを割り当て、ボールペンでマークしてラベルを貼ります。次に、スライドを室温の100% alcoholに5分間浸します。その後、ドラフトチャンバー内でスライドを5分間乾燥させます。前処理として、各セクションに前処理用試薬1を20 µLずつピペットで添加し、スライドを湿潤トレイのラックレールに置きます。水平シェーカーを用いて、低速で10分間、水分トレイを静かに振盪させます。次に、2回、2分間ずつ二重蒸留水でスライドを洗浄します。その後、前処理試薬2を450 milliliters含ませた1000 milliliterのビーカーにスライドを浸します。次に、RNA構造を復元させるため、スライドを100 °Cで計5分間煮沸します。その後、二回蒸留水で2分ずつ2回洗浄します。スライドを100%アルコールに5分間浸します。その後、スライドを5分間乾燥させます。ドラフトチャンバー内で、疎水性ペンを使用して組織切片の選択領域の周囲に円を描きます。続いて、プローブの浸透性を高めるために、各選択領域に前処理試薬3を10 µLずつピペッティングし、水分保持トレーに蓋をします。次に、水平シェーカーを備えたハイブリダイゼーションオーブンにトレイを入れます。オーブンの温度を40 °Cに設定し、トレイを30分間緩やかに振盪させます。その後、スライドを2回、それぞれ2分間ずつ二回蒸留水で洗浄します。このステップで、選択した領域に10 µLのP-P-I-B-D-A-P-BまたはHTR two Aプローブをピペットで分注します。次に、試薬の蒸発を防ぐため、水分保持トレーに蓋をします。オーブン内で40 degrees Celsiusで2時間インキュベートしながら、水平シェーカーを用いて低速でスライドを静かに振盪させます。続いて、洗浄バッファーでスライドを2分間ずつ2回洗浄し、選択した各領域に増幅試薬1を10 microlitersずつピペットで分注します。スライドを40 °Cで30分間振盪しながらインキュベートします。次に、洗浄バッファーを用いてスライドを1回につき2分間、2回洗浄し、選択した各領域に増幅試薬2を10 µLずつピペットで加えます。スライドを40 °Cで15分間振盪しながらインキュベートします。その後、スライドを洗浄緩衝液で2分間、2回洗浄します。毎回、選択した各領域に増幅試薬3を10 µLずつピペットで分注します。スライドを振盪し、40 °Cで30分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬4を10 µLずつピペットで滴下します。シェイクしながら、スライドを40 °Cで15分間インキュベートします。次に、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬5を10 µLずつピペットで点滴します。シェイカーで振盪しながら、室温で30分間インキュベートします。続いて、スライドを洗浄バッファーで2分間、2回洗浄します。選択した各領域に増幅試薬6を10 µLずつピペットで滴下します。シェーカーで振盪しながら、室温で15分間インキュベートします。次に、洗浄バッファーを用いてスライドを再度2回、各2分間洗浄します。続いて、選択した各領域に赤色試薬を10 µLずつピペットで滴下し、スライドを室温の水平シェーカー上の保湿トレイに置き、低速で10分間静かに振盪させます。その後、2回、二重蒸留水を用いて10分間スライドを洗浄します。毎回、スライドをオーブンにて60 °Cで15分間乾燥させます。その後、スライドをドラフトチャンバー内でキシレンに5分間浸します。次に、選択した各領域にキシレンベースのマウント剤を20 µLピペッティングし、カバーガラスで覆います。このステップでは、画像ファイルをメインのImageJウィンドウにドラッグ＆ドロップします。メニューバーから「Image」を選択してください。次に、ドロップダウンメニューから「Type」を選択し、「8-bit」を選択します。次に、「adjust」を選択し、さらに「threshold」を選択してダイアログボックスを開きます。ダイアログボックス内の下限バーの値を調整し、不要な背景を除去します。メニューバーに移動して「Analyze」を選択し、次に「analyze particles」を選択して2つ目のダイアログボックスを開きます。粒子サイズを10に設定します。次に、「show outlines」を選択し、「display results」と「summarize boxes」を選択します。最後に、「okay」をクリックして、ダイアログボックスで粒子データを確認します。スプレッドシートでの計算では、データをExcelシートに入力し、生理食塩水群の粒子数の平均をベースラインとして設定します。次に、各セクションのパーセントレベルを算出し、それに基づいてグラフを作成します。ここでは、赤点で示されたハイブリダイゼーションシグナルの光学顕微鏡像を示します。生理食塩水およびMDMAを事前に投与し、深く麻酔したラットの組織をパラホルムアルデヒドで固定しました。使用したオリゴヌクレオチドプローブはD-A-P-B-P-P-I-BおよびHT two Aです。この図は、MDMAを事前に投与したラットにおける視床下部のHT two A遺伝子発現への影響を示しており、HT two, a発現の20%減少が観察されました。この手法により、神経科学分野の研究者が、パラホルムで固定した脳組織を用いたin situハイブリダイゼーションによって、メッセンジャーRNAの遺伝子発現をより容易に測定できるようになります。

rapid-situ-hybridization-using-oligonucleotide-probes-on

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

このプロトコルは、非放射性の関係...

二重蛍光その場で</em新鮮な脳切片における>ハイブリダイゼーション

このビデオでは、セロトニン症候群に罹患したラットの脳組織において、オリゴヌクレオチドプローブを用いたセロトニン受容体RNA合成の検出を実演しています。このプロトコールには、組織の前処理、プローブハイブリダイゼーション、および顕微鏡下でセロトニン受容体RNA発現を可視化および定量するための酵素検出が含まれます。...

オリゴヌクレオチドプローブを用いたラット脳切片におけるRNA発現の研究のためのin situハイブリダイゼーション

出典:Jolly, S., et.al.二重蛍光In Situハイブリダイゼーションと免疫標識を組み合わせて、マウス脳切片における3つの遺伝子の発現を検出します。J. Vis. Exp. (2016).このビデオでは、ダブル蛍光in...

マウス脳切片における遺伝子発現を検出するための二重蛍光In Situハイブリダイゼーションの実施

RNA in situハイブリダイゼーション(ISH)は、細胞や組織内のRNAの可視化を可能にします。ここでは、RNAscope...

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

特定の細胞タイプへの遺伝子発現の局在化は、特異的な抗体がないために困難な場合があります。ここでは、ダブル蛍光 RNA in situ ハイブリダイゼーションと免疫染色を組み合わせることにより、遺伝子発現を 3...

ダブル蛍光を組み合わせます<em&gt;その場で</em&gt;マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション

私たちは、ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激(rTMS)を適用し、25mmの字型コイルを両側の頂点から1cm外側に配置し、コイルを45°角度付けました。rTMSには、社内の水冷システムを20分以上使用しました。...

ラットの脳の片側半球に反復経頭蓋磁気刺激

側坐核ドーパミン D1-アルファ受容体の同定は、中枢神経系疾患の中に D1 受容体の機能不全を明らかにするため重要です。特定の脳領域の RNA 分子を可視化する交配アッセイの in situ新規 RNA...

検出技術その場で革新的な RNA 側坐齧歯動物の核内ドーパミン D1-アルファ受容体の同定

このプロトコルはmultilabel FISHおよび蛍光性のIHC信号を達成することを目標に、新しい凍結および固定マウス頭脳セクションの蛍光性in situ の交配(魚)および蛍光性のimmunohistochemistry...

マルチプレックス蛍光 In Situ ハイブリダイゼーションと蛍光免疫組織化学の融合による新鮮、凍結、または固定マウスの脳切片の結合(英語)

DetectSynは、治療または疾患状態にわたる相対シナプス(シナプス前およびシナプス後関与)数の変化を測定する、偏りのない迅速な蛍光アッセイです。この技術は、培養ニューロンおよび固定組織の両方において使用することができる近接ライゲーション技術を利用する。...

DetectSyn:シナプス密度の変化を検出するための迅速で偏りのない蛍光法

私たちは、マウス脈絡叢のインスリン受容体アイソフォームIR-AおよびIR-BをマッピングするためのDuplex in situ...

RNA In Situ ハイブリダイゼーションアッセイによるマウス脳内のインスリン受容体AおよびBの精密な可視化

学ぶラット脳組織における迅速なその場でハイブリダイゼーション法。パラホルムアルデヒド固定脳切片を用いて、セロトニン受容体遺伝子htr2aの発現を検出し、神経科学研究における遺伝子発現解析を効率化します。

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