肺腫瘍細胞募集試験
2019年2月26日
本稿では、腫瘍の転移の動物モデルにおける肺腫瘍細胞蓄積を定量化する方法について説明します。
この方法は、転移の分子メカニズムに関する腫瘍生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、遠隔器官内の腫瘍細胞の募集を定量化できることである。まず、非酵素細胞解離試薬を使用して、蛍光タンパク質発現ルイス肺癌(LLC)を、標準的なプロトコルに従って培養容器から細胞を除去することから始めます。
得られた細胞溶液を遠心分離前に15ミリリットルの円錐管に移し、遠心分離機は1回の洗浄につき5ミリリットルのPBSでペレットを2回洗浄する。2回目の洗浄後、40マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通して細胞を濾過し、1ミリリットル濃度の6細胞に10倍に希釈します。その後、29ゲージの針を備えた1ミリリットルの注射器に細胞をロードし、8〜10週齢のC57-Black-6、オスマウスの尾静脈に100マイクロリットルの細胞を注入します。
適切な実験エンドポイントで、はさみを使用して各マウスの腹側表面から皮膚を取り除き、肋骨と横隔膜を切断して胸腔を露出させます。右心室を通してPBSの15ミリリットルを洗い流し、心臓と胸腺を取り除くために25ゲージの翼を持つ注入針とチューブを使用してください。気管を鉗子でつかみ、引き上げ、気管の周りの結合組織を解剖して肺を収穫する。
次にPBSで肺を洗浄し、蛍光顕微鏡で蛍光細胞を可視化するために1つのローブを取り外します。肺組織を消化するには、まず尾頭葉をはさみでサイコロにし、肺片を10ミリリットルの注射器に入れる。プランジャーでシリンジを閉じ、5ミリリットルの消化液をシリンジに吸い込み、肺組織が溶液全体に広まるまでプランジャーを注射器シャフトの中と外に移動させる。
肺スラリーを50ミリリットルのチューブに分配し、逆シェーカーで37°Cと150rpmで15分間組織を消化します。インキュベーションの終わりに、肺細胞が完全に分散するまで残りの組織を三分化し、さらに30分間シェーカーにチューブを戻す。その後、40マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して細胞を濾過し、遠心分離によって細胞を収集する。
単離した肺細胞をフローサイトメトリーで解析するには、ペレットを室温で1分間赤血球リシスバッファーの2ミリリットルで再懸濁し、遠心分離により細胞を採取する。次いで、ペレットを5ミリリットルの新鮮なPBSで2回遠心分離し、1回の洗浄につき1%ウシ血清アルブミンを補う。第2遠心分離後、新鮮なPBSとBSAの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、フローサイトメトリーによる腫瘍細胞の定量化のために新しい40マイクロメートルの孔ストレーナーを介して細胞を濾過する。
肺は注射の2時間後に多くのGFP-LLC細胞を提示し、細胞の大半は24時間以内に肺から消失する。なお、赤色フィルター内で検出された蛍光スポットは、細胞数から除外する必要があります。肺中のGFP-LLCの数を確認するために、示されているようにフローサイトメトリック分析にローブの1つを使用することができる。
この手順を試みる間、凍結断面手順は、腫瘍細胞の正確な位置を観察するためのより正確な方法であることを覚えておくことが重要です。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本稿では、腫瘍転移の動物モデルにおいて、肺への腫瘍細胞蓄積量を定量化する方法について説明します。この手法により、遠隔臓器内への腫瘍細胞の集積を定量化することが可能となり、転移の分子メカニズムに関する知見を得ることができます。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 腫瘍学
- 細胞生物学
背景
- 腫瘍転移の理解は、がん研究において極めて重要です。
- 腫瘍細胞の蓄積量を定量化することで、重要な生物学的知見を得ることができます。
- がんの進行を研究する際、動物モデルの使用は一般的です。
- 蛍光タンパク質を発現する細胞を用いることで、追跡と定量化が容易になります。
研究目的
- 肺における腫瘍細胞の蓄積量を定量化する方法を開発する。
- 転移モデルにおける腫瘍細胞のリクルートを調査する。
- 転移の根底にある分子メカニズムの理解を深める。
使用した手法
- 非酵素性細胞解離試薬の使用。
- PBSによる細胞ペレットの遠心分離および洗浄。
- 40 µmポアのセルストレーナーによる細胞のろ過。
- 希釈した細胞懸濁液のマウス尾静脈への注入。
主な結果
- この手法により、腫瘍細胞の集積を効果的に定量化することが可能になります。
- 生体内（in vivo）での腫瘍細胞の追跡が可能であることを実証しました。
- 腫瘍細胞のリクルートメントのダイナミクスに関する知見を提供しました。
- 転移プロセスの理解に寄与しました。
結論
- この手法は、腫瘍生物学を研究するための有用なツールです。
- これにより、動物モデルにおける転移の調査能力が向上します。
- 今後の研究では、この技術を基盤として治療標的の探索が可能です。
よくある質問
産業界における重要性
このアッセイにより、遠隔臓器への腫瘍細胞の集積を定量的に評価することが可能となり、転移標的の薬剤探索におけるメカニズム的なリスク軽減を支援します。原発腫瘍からの浸潤ステップをバイパスすることで、前臨床での標的バリデーションに不可欠な間質相互作用および血管外遊出イベントに焦点を当てることができます。本手法は、抗転移化合物をin vivoで評価するための、再現性と拡張性のあるリードアウトを提供します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 遠隔臓器における転移に対するストローマ細胞の寄与に関する治療仮説を検証する。
- 実用的価値： 注射後の肺における腫瘍細胞の蓄積を定量化することにより、機能的なターゲット検証を可能にする。
- 予測的価値： 腫瘍細胞のリクルート動態に対する化合物の効果を測定することで、ポートフォリオの選別を支援する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状態： 化合物スクリーニングキャンペーンに向けて、フローサイトメトリーにより標準化された定量的出力を算出します。
- 再現性： 定義された細胞濃度と注入量を使用し、一貫した転移モデル化を保証します。
- スケーラビリティ： マルチウェル処理およびハイコンテント解析との互換性があり、ターゲットのデリスキングが可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性： 臓器特異的なコロニー形成メカニズムを研究するため、肺微小転移をモデル化します。
- トランスレーショナルな連続性： 基礎研究での発見を、抗転移剤の前臨床検証へと結びつけます。
- リスク調整後の意思決定： ラベル化された腫瘍細胞数の減少に基づき、継続か中止かの判断基準（go/no-go criteria）を決定します。
パイプラインおよびワークフローの統合
標的仮説の検証からリード最適化に至る創薬コンティニュアムにおける各段階に位置し、転移調節化合物の定量的評価を可能にします。
- ディスカバリーバイオロジー：転移ニッチにおける腫瘍-ストロマ相互作用のメカニズム解析を支援します。
- スクリーニング：転移アッセイにおけるヒット検証のための、蛍光ベースの定量的リードアウトを提供します。
- 分析：フローサイトメトリーにより、用量反応および統計解析のための計数可能な腫瘍細胞データを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ：生体内での標識細胞の播種を追跡することで、バイオマーカー戦略と整合させます。
- エンタープライズ再利用：プロジェクト横断的な転移メカニズム研究に利用可能な、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：定量的な臓器特異的リクルートメントを通じて、転移経路におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：腫瘍細胞の導入および組織処理を標準化し、ラボ間での再現性のある比較を可能にする。
- 戦略的価値：転移標的治療薬の早期リスク低減を可能にし、資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：前臨床段階の転移抑制データに基づいた、リスク調整後の開発推進の意思決定を促進する。
実施上の考慮事項
- マウスの尾静脈注射および組織解離技術に関する専門知識が必要である。
- フローサイトメトリー装置および蛍光補正コントロールに依存する。
- 研究チーム間で標準化された細胞調製プロトコルが必要である。
- 肺への過剰な蓄積による混在シグナルを避けるため、細胞投与量の最適化が必要となる。
- 肺への蓄積量の定量に限定されており、原発腫瘍の浸潤やその後の転移性増殖は捉えられない。
