髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

この手順の全体的な目標は、毛髪由来のケラチノサイトを使用してヒト人工多能性幹細胞を生成することです。これは、最初にドナーから髪の毛を分離することによって達成されます。2番目のステップは、ケラチノサイトの成長を促進するために毛をプレートダウンすることです。

次に、ケラチノサイトをin vitroで維持および増殖させます。最後のステップは、エピソームリプログラミング法を使用して、ケラチノサイトをヒト誘導多能性幹細胞に再プログラムすることです。最終的には、ヒトIPS細胞を免疫組織化学を用いて単離し、特性評価することで、多能性マーカーの発現を示すことができます。

レトロウイルス法やレンチウイルス法などの既存の方法に対するこの方法の全体的な利点は、エピソーム因子を使用することで、望ましくない導入遺伝子を回避できることです。生成された幹細胞のゲノムへの組み込みは、細胞外マトリックス溶液のバイアルを氷上で一晩解凍することから始まります。翌朝、事前に冷却したピペットチップを使用して、12ミリリットルの冷却DMF12培地に200マイクロリットルの溶液を追加します。

希釈した細胞外マトリックス溶液1ミリリットルを12の各ウェルに加えます。ウェルプレートをプレート化し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートして、ウェルをマトリックスでコーティングします。次に、髪の毛の根元に指を近づけて、髪の毛を素早くスムーズに抜くことにより、ドナーの頭から一次人間の髪の毛を収集します。

収集した各髪の毛に無傷の毛包が含まれていることを確認してください。卵胞を解剖顕微鏡の下に置き、各髪の成長段階を決定します。各個体から5〜10本の抗原毛を集めて、角質の氷を抽出します。

抗原期は、T期とは異なり、上皮の複数の層を含んでいます。毛髪サンプルを10ミリリットルの抗生物質混合物が入ったシャーレに5分間入れ、次にPBSで室温で5分間洗います。次に、滅菌鉗子で髪をつかみ、滅菌ハサミを使用して余分な毛幹を切り取り、無傷の毛包と約0.5〜1センチメートルの毛幹を持つ毛片を残します。

1つの毛片を細胞外マトリックスコーティングプレートの各ウェルに慎重に移します。滅菌鉗子を使用して、私は約100〜200マイクロリットルの血清補充をペットにしています。毛髪サンプルを含む各ウェルにミディアムドロップワイズ。

次に、プレートをインキュベーターに置き、卵胞が摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩付着するのを翌日待ちます。さらに100〜200マイクロリットルの血清補充を中程度にゆっくりと加えて、髪のサンプルを湿らせます。毛髪サンプルを毎日チェックして、毛包がプレートに正常に付着していることを確認します。

取り付けたら、さらに500マイクロリットルの培地をウェルにそっと加えます。メディアは 2 日ごとに交換します。コラーゲン入りの6枚のウォールプレートをプレコ。

キットから各ウェルまでの希釈媒体680マイクロリットルにコーティングマトリックスキットなどの前処理を使用し、続いて6.8マイクロリットルのコーティングマトリックス溶液を使用するタイプ1。プレートを軽く振って、コーティングが均一になるようにします。コーティングしたプレートを室温で30分間インキュベートしてから、ケラチノサイトをプレーティングします。

コーティング溶液を除去し、ウェルあたり500マイクロリットルの0.25%tripsinを添加して、培養中のケラチノサイトを単一細胞懸濁液に解離し、プレートを摂氏37度で2〜5分間インキュベートします。細胞がプレートから放出されたら、500マイクロリットルの血清含有培地でトリプシンを不活性化し、無菌の15ミリリットルチューブに細胞を収集します。滅菌した鉗子を使用して毛片を取り除き、細胞をペレット化してから蘇生します。

ケラチノサイト培地の存在下で、新鮮なケラチノサイト成長培地プレート40、000ケラチノサイトをコラーゲンコーティングプレートの1ウェルに懸濁します。毎日媒体を変え、文化がそれぞれに0.1%のゼラチンの解決の2ミリリットルを加えることによってゼラチンが付いているゼラチンが付いている6つの壁の版が約80%confluent Vコードであるとき細胞を継ぎなさい、よく室温で少なくとも20分間コーティングするためにゼラチンを可能にさせる。その間に、1ウェルあたり1ミリリットルの0.25%tryinを添加し、細胞を2〜5分間インキュベートすることにより、継代6以下のケラチノサイトを単一細胞懸濁液に解離します。

摂氏37度で、血清を含む培地1ミリリットルでトリプシンを不活性化し、細胞を15ミリリットルのチューブに集めます。細胞をペレット化し、ケラチノサイト培地に再懸濁します。次に、ゼラチン化された6ウェルプレートにウェルあたり100、000〜150、000個のケラチノサイトをプレートし、翌日、ゼロ日目にそれらを一晩インキュベートし、プレートをチェックして細胞が50〜60%コンフルエントであることを確認します。

添付のテキストプロトコルに記載されているように、8マイクロリットルのトランスフェクション試薬と2マイクログラムの全血漿DNAの比率を使用して、ケラチノサイト上のエピソームリプログラミングベクターのトランスフェクションを実施します。翌日、1日目にケラチノサイト培地を交換し、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質陽性細胞の割合を推定することにより、トランスフェクション効率を確認します。2日目には60〜70%のトランスフェクション効率が期待されます。

トランスフェクションを繰り返してトランスフェクション効率を90%以上に高め、次に、5ミリリットルの0.1%ゼラチンを含む10センチメートルのディッシュを少なくとも20分間事前にコード化します。Conrad Alのすべてに記載されているように、10センチメートルディッシュあたり400万個の有糸分裂不活性化フィーダー細胞をFBS培地にプレートし、細胞を3日目に5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで一晩沈殿させて付着させます。トランスフェクションしたケラチノサイトを前述のように回収し、KSR培地プレートに再懸濁します。

ウェルの1つからのケラチノサイトの90%をフィーダーセルで調製した10センチメートル皿に入れ、KSRで覆います。培地 21日目以降、ヒト誘導多能性幹細胞コロニーを手動解剖により分離します。密集しているコロニーは避け、他のコロニーから明確に分離されたコロニーのみを選択します。

手動解剖の場合は、26ゲージの針を使用して、解剖顕微鏡でコロニーを長さ約300〜600マイクロメートルの小片に切断します。1つのコロニーから新しいMEFフィーダープレートにピースを移し替えて、ヒト誘導多能性幹細胞のクローンラインを確立します。培養物が直径約1.5ミリメートルのヒト誘導多能性幹細胞コロニーで70〜80%の流暢さに達すると、細胞はAccutane、sase、またはコラゲナーゼなどの標準的な酵素パッケージング方法を使用します。

製造元の指示に従って、4つ。このプロトコルに従うと、毛髪付着後3日という早い時期にrecyの成長が観察され、増殖し続けます。ここに示されているケラチノサイトは新しいプレートに継代されており、これらの細胞は複数回の継代にわたって維持することができます。

この画像は、典型的なケラチノサイト由来のヒト誘導多能性幹細胞コロニーを示しています。32日間のリプログラミング後、ヒト誘導多能性幹細胞コロニーの中心で何らかの分化が起こることがあります。手動で選択すると、派生した細胞は通常、高い核対細胞質比と明確なコロニー境界を示します。

また、OCT four nagやTRA one 60などの多数の多能性マーカーも発現します。このビデオを見た後、髪の毛からケラチノサイトを抽出し、それらを人間が誘導したとされる幹細胞に再プログラムする方法をよく理解しているはずです。