Name: 髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: 学ぶ 髪由来ケラチノサイトを用いた統合フリーのヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）生成法。エピソームベクターによる再プログラミングで、ゲノムへの組み込みリスクを回避し、再生医療や疾患モデリングへの応用が期待されます。

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著者は、技術サポートを提供してくださったHarene Ranjithakumaran氏とStacey Jackson氏に感謝します。この研究は、National Health and Medical Research Council(R.C.B. Wong, A. Pébay)、University of Melbourne(R.C.B. Wong)、Retina Australia(R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay)、およびOphthalmic Research Institute of Australia(R.C.B. Wong, S.S.C. Hung, A. Pébay)からの助成金によって部分的に支援されました。オーストラリア研究評議会フューチャーフェローシップ(A.ペベイ、FT140100047)、クランボーン財団フェローシップ(RCBウォン);国立衛生研究所(R.C.B. Wong, S.S.C. Hung)からの学内資金とビクトリア州政府からの運用インフラ支援。

個人からの人間の毛髪サンプルの収集は、ホスト機関における人間研究倫理委員会の倫理的な承認を必要とし、機関のガイドラインに準拠して行う必要があります。 撥弦楽器髪からケラチノサイトの1の単離<ol><li>アイスO / Nで（ すなわち、マトリゲル）雪解け細胞外マトリックス（ECM）ソリューションを提供します。 </li><li>予備冷却したピペットチップを使用して、冷却されたDMEM / F12培地12 mlに200μlのECMソリューションを追加します。コー​​ト希ECM溶液1 mlの12ウェルプレートの各ウェルに。 37℃でコーティングしたプレートO / Nをインキュベートします。使用前に予め温めておいたDMEM / F12培地でコーティングされたプレートを洗浄します。 </li><li>髪の根元に近い指を置き、1迅速かつ滑らかな動きで髪を摘採して、個々の頭から一次ヒトの毛髪を収集します。各収集髪はそのまま毛包が含まれていることを確認し、毛アンの成長期を決定するためにチェック解剖顕微鏡（ 図1）を DER。 <ol><li>ケラチノサイトを抽出するために、各個体から5-10成長期毛を収集します。プロセスは、ケラチノサイトの正常な誘導を確保するために、できるだけ早く毛を摘み取ら。 注： 図1は、成長サイクルの異なる段階にある毛の形態を示しています。成長期毛をORSとして知られている髪の長さを、周囲の上皮の目に見える外側の層と、成長段階にあります。一方、休止期の毛は休止期にある毛を表し、可視ORSはありませんが、休止期の膨らみとして知られている毛の根元を覆う細胞の明確なボールを持っています。 </li></ol></li><li>室温で5分間洗浄するために抗生物質ミックスの10ミリリットルを含むペトリ皿に毛髪サンプルを置きます。 </li><li>毛幹の1センチメートル - 滅菌ハサミとピンセットを使用して、無傷の毛包と約0.5とヘア断片を残し、過剰な毛をカット。 </li><li>慎重TRAピンセットを用いてECMコーティングされたプレートの各ウェルに1ヘア断片nsfer。 </li><li>毛髪試料に - （200μL〜100）を1mlピペットを用いて、ノックアウト血清代替（KSR）培地の約3滴を追加します。 注：添付ファイルとそれに続くケラチノサイト成長を可能にするために、プレートの表面に密着して毛髪断片を保管してください。この段階で過度のメディアを追加すると、髪の断片を浮遊させ、成功した髪の添付ファイルの可能性を減少させることができます。 </li><li> 5％CO 2で37℃インキュベーターで毛髪サンプルをインキュベートし、毛包は、O / Nを添付することができます。湿った毛髪サンプルを維持するために - （200μL〜100）は、次の日に、静かにKSR媒体の他の3滴を追加します。 </li><li>毛包が正常に取り付けられていることを確認するために毎日の毛髪試料を観察します。一般的に毛包の付着は、1-3日以内に明らかです。細かい毛が高い持っているように太い毛は、通常、微細な毛に比べて取り付けが容易です添付ファイルのプロセスを妨害するフロートする傾向。 <ol><li>髪をコーティングしたプレートに取り付けられた後、ウェルにKSR培地500μlを添加します。毛髪サンプルがしっかりと取り付けられていない可能性がありますようにメディアを追加するときに細心の注意を払ってください。この点から、2日おきにメディアを変更します。 注：ケラチノサイト増殖物は3-7日（ 図2A-B）後の毛髪断片のORS領域から見えるはずです。ケラチノサイトは、次のセクションで説明するように細胞を継代14日前までに成長することを可能にします。 </li></ol></li></ol> 2.メンテナンスとケラチノサイトの継代<ol><li>プレコートコーティングマトリックスキットを使用して、6ウェルプレート。コー​​ティングのマトリックス溶液6.8μlを、続いて、キットの各ウェルに希釈媒体の680μlを添加します。プレート上にコーティングマトリックス溶液の均一な分布を確実にするためにプレートを振ります。 </li><li>コー​​ティングされたプレートを室温で30分間インキュベートすることができます。削除しますケラチノサイトのメッキコーティング前Matrixソリューション。 </li><li> 37℃で2〜5分間、ウェル当たり0.25％トリプシン500μlので単一細胞懸濁液にケラチノサイトを解離します。血清（ 例えば、ウシ胎児血清（FBS）培地）を含む培地500μlにトリプシンを不活性化し、滅菌15mlチューブに集めます。滅菌ピンセットを用いて毛の断片を削除します。 </li><li>血球計数器を用いて採取した細胞の数を決定します。 </li><li>遠心分離機200×gで3分間の細胞。 PBSを繰り返し、遠心分離で細胞を洗浄します。 PBSを吸引し、新鮮なケラチノサイト培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>ダウン4×10 4ケラチノサイトケラチノサイト培地の存在下でECMコーティングされたプレートの1ウェルにプレート。 5％CO 2（ 図2C）を用いて37℃のインキュベーター内でケラチノサイトをしてください。文化があるときに、メディア毎日通路の細胞を変更〜80％コンフルエント、WHIchがケラチノサイトの通過数と増殖率に応じて約2-7日かかる場合があります。由来ケラチノサイトは、標準的なスロー凍結凍結保存方法16を使用して十分な凍結ストックを生成するように拡張されるべきです。 注：記載の培養条件は、典型的な敷石状の形態（ 図2C）と角化細胞の均一な集団の拡大をサポートしています。時折、いくつかの分化した大規模かつフラットな形態のケラチノサイト、および複製能力を失っているが、文化の中で観察することができます。以前17に記載されているように、ケラチノサイトの特徴付けは、サイトケラチン14に対する抗体を用いて免疫染色することにより行うことができます。確立されたケラチノサイト細胞株はまた、市販のキットを使用して1~3継代後マイコプラズマについて試験されるべきです。 </li></ol>エピソームベクターを使用したケラチノサイトからhiPSCsの3世代<ol><li> 6ウェルプレートでプレコート0.1％のゼラチン（2ミリリットル/ウェル）。室温で少なくとも20分間コートにゼラチンを許可します。 </li><li>再プログラミング実験のために、遅くとも通路6よりもケラチノサイトを使用しないで解離は、37℃で2〜5分間、ウェル当たり0.25％トリプシン1mlで単一細胞懸濁液にケラチノサイト。血清（ 例えば、FBS培地）を含む培地1mlのトリプシンを不活性化し、15mlチューブに集めます。 </li><li>ケラチノサイト培地中で200×gで再懸濁した細胞で3分間遠心分離した細胞。板ゼラチン化プレートO / Nでウェル当たり1×10 5 -1.5×10 5ケラチノサイト。 </li><li>次の日（0日目）に、細胞が50〜60％コンフルエントであることを確認するためにプレートをチェックしてください。 注：ケラチノサイトが、彼らはトランスフェクション後によく成長しない可能性があり〜50％コンフルエント未満である場合。 </li><li> 0日目に、2μgの全プラスミドDNAに8μlのトランスフェクション試薬の比を用いて、ケラチノサイトのエピソームリプログラミングベクターのトランスフェクションを行います。<ol><li> 4プラスミド（pCXLE-EGFP、pCXLE-hOct3 / 4-shP53F、pCXLE-HSK、pCXLE-HUL）のそれぞれについて、0.5μgのを取り、低血清培地（ 例えば、OPTI-MEM）100μlに希釈します。 注：プラスミドpCXLE-EGFPは、ケラチノサイトにおけるトランスフェクション効率をモニターするために使用され、成功した再プログラミングのために必要とされません。 </li><li>希釈したDNAへのトランスフェクション試薬の8μlを添加します。チューブをフリックすることにより混合します。 DNA反応混合物は室温で15分間邪魔されずに休ませることができます。 </li><li>新鮮な培地とケラチノサイト培地を交換してください。 </li><li>ゆっくりケラチノサイト培養物にDNA反応ミックスを添加し、4時間、5％CO 2、37℃のインキュベーター中でインキュベートします。 注：それは彼らが低生存トランスフェクション後に示すように、ケラチノサイトに長期のトランスフェクションのO / Nを実行することは推奨されません。 </li><li> 4時間後、トランスフェクションした後、新鮮な培地でケラチノサイト培地を交換してください。 </li></ol></li><li> 1日目（1日後、トランスフェクション）、ケラチノサイト培地を変更し、蛍光顕微鏡下でのeGFP陽性細胞の割合を推定することにより、トランスフェクション効率を確認してください。典型的には&gt; 60〜70％のトランスフェクション効率は、このプロトコルを使用して、初代ケラチノサイトで観察されます。 </li><li>ステップ3.5で説明したように2日目に、トランスフェクションを繰り返します。二つの連続した​​トランスフェクションは、典型的には&gt; 90％のトランスフェクション効率を達成します。ケラチノサイトの培養は、通常、第二のトランスフェクションの終了までにコンフルエンスに達しました。 <ol><li>各再プログラミング反応のために、マウス胚性線維芽細胞（MEF）フィーダーの10cmの皿を準備します。以前に18を説明したように、有糸分裂不活性化MEFフィーダーを準備します。 </li><li>少なくとも20分間、0.1％ゼラチンを5 mlのプレコート10cmディッシュ。 FBS培地中で10cmディッシュあたりプレート4×10 6有糸分裂的に不活性化MEF。細胞は、5％CO 2で37℃のインキュベーターでO / Nを解決し、添付することができます。 </li></ol></li><li> 3日目に、HARステップ3.2および3.3に記載されているように、0.25％トリプシンでケラチノサイトを権利が確定します。 KSR培地中のケラチノサイトを再懸濁し、KSR培地で10センチメートルMEFフィーダー皿に6ウェルプレートの1ウェルからケラチノサイトの90％をプレート。 </li><li>以降4日目から、毎日KSR培地を変更します。 <ol><li>あるいは、18日目の後に、一日おきに培地を交換してください。 注： - 21ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）の似ている定義された境界を有するhiPSCコロニーは14日目から出現する一方、非再プログラムケラチノサイトは、増殖しなくなります。 </li></ol></li><li>以降21日目からの手動切開によりhiPSCコロニーを分離します。密接に一緒にクラスタ化されたhiPSCコロニーを避けるだけ明らかに他のものから分離されたhiPSCコロニーを選択します。 注：hiPSCコロニーは早く取り出すことができますが、定義された境界を有するコロニーは、小さなコロニーサイズ指定された以前の時点では明らかではないかもしれません。再プログラミング効率はデフの間で異なる場合がありますerent患者の角化細胞、およびそのような継代数またはケラチノサイトの増殖速度などの他の要因によって影響されます。 <ol><li> hiPSCコロニーのマニュアル解剖について、解剖顕微鏡下でhiPSCコロニーを切断するために26G針を使用しています。長さが600ミクロン - 約300小片にhiPSCコロニーをカットします。 hiPSCsのクローン株を確立するために、新しいMEFフィーダープレート（2.5×10 4 MEF / cm 2）を1にhiPSCコロニーから作品を転送します。最初に、文化は12ウェルプレートまたは器官培養皿の1つのウェル内の各hiPSCクローン株は、その後、6ウェルプレートフォーマットに展開します。 </li><li> MEFフィーダー上KSR培地中hiPSCsの確立クローン系を維持します。 hiPSCコロニーと80％の密集度、直径〜1.5ミリメートル、製造者の指示に従って、標準的な酵素継代方法（のAccutase、ディスパーゼまたはコラゲナーゼIV）を使用して、通路hiPSCs - 文化たら70に到達します。 </li></ol></li><li>確立されたhiPSCラインを特徴づけますSは多能性と、in vitroおよび / ​​またはin vivo 13,19 で三胚葉の細胞の代表に分化する能力を確認することができます。また、日常的にテストは、それらが病原体を含まないであることを確認するために、市販のキットを用いて、マイコプラズマのためのhiPSCラインを確立しました。日常核型分析またはアレイベースのコピー数変動（CNV）解析によりhiPSCラインのゲノムの安定性を監視します。 </li></ol>

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</ol>

著者には利益相反はありません。

患者特有のhiPSCsの生成は、in vitroでの病気の細胞型において病因を研究するためのユニークなアプローチを提供し、また、疾患の表現型を救出することができる新規分子を同定するための薬物スクリーニングのためのプラットフォームを提供します。 hiPSCsを使用して、この疾患のモデリングアプローチは、QT延長症候群、ハンチントン病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症22を含む様々な疾患のための有望な結果をもたらしました。いくつかの取り組みはすでにアメリカ、ヨーロッパ、オーストラリア、中国、韓国と日本23,24でコンソーシアムを含む患者固有hiPSCsの大規模なライブラリーを確立するために進行中です。 ここで、毛髪由来ケラチノサイトからhiPSCsを確立するためのプロトコルは、疾患特異的hiPSCsの大規模ライブラリーの構築を容易にし、高速追跡する可能性を有する、記載されています。このプロトコルは、2つの利点があります。まず、エピソームをこのプロトコルで利用されるシステムは、6つの再プログラミング因子のカクテルを使用し...

ヒト誘導多能性幹細胞（hiPSCs）の発見は、患者特異的幹細胞1-3の生成のための実行可能な方法を提供し、再生医療の分野に革命をもたらしました。 hiPSCsは正常線維芽細胞4,5を含む種々の体細胞タイプ、造血細胞6,7、尿8およびケラチノサイト9,10からの腎上皮細胞から生成されています。これまで、皮膚線維芽細胞および造血細胞は、患者固有のiPS細胞を生成するための最も一般的に使用される細胞の供給源を表します。おそらく、これは、皮膚生検及び採血ルーチン医療処置および多くの国で確立された患者の血液または皮膚サンプルの大規模なバイオバンクであるという事実によるものです。 侵襲的な抽出方法を必要とする血液細胞および皮膚線維芽細胞とは対照的に、ケラチノサイトはhiPSCの生成のために容易にアクセスできる細胞型を表します。 KeratinocytESは、皮膚の外側表皮バリアを形成し、また、爪及び髪11に見出されるケラチン豊富な上皮細胞です。特に、ケラチノサイトは毛包、内毛根鞘（IRS）細胞（12、 図1）と一緒に毛幹をカバーし、外部の細胞膜の外毛根鞘（ORS）に記載されています。ヘアコレクションは医療関係者の支援を必要としない簡単な手順であるように、患者が収集し、大幅hiPSCの世代のための患者サンプルの収集を容易にするであろう実験室に自分の毛髪サンプルを送信するための機会を提供しています。表皮角化細胞はまた、hiPSCの生成9,13のための出発細胞としてのケラチノサイトを使用する利点に加えて、線維芽細胞と比較してより高い初期化の効率と高速再プログラミング速度を持っています。さらに、hiPSCsはまた毛包内の他の細胞集団を使用して生成することができ、毛包14,15の基部に位置毛乳頭細胞を含みます。 毛由来の細胞を用いてiPS細胞の発生以前の報告は、多くの場合、レトロウイルスまたはレンチウイルスベースの再プログラミング法9,14,15を利用します。しかし、これらのウイルスの方法は、再プログラミング中に外国の導入遺伝子の望ましくないゲノム組込みをご紹介します。対照的に、エピソームベクターの使用は、統合フリー性IPSC 4を生成するために実行可能な、非ウイルス性の再プログラミング方法を示しています。我々は以前に効率的にエピソームベクター13を使用してhiPSCsにケラチノサイトを再プログラムするための簡単な、費用対効果および非ウイルス法を開発しました。ここでは、hiPSCsを生成するためのケラチノサイトおよびその後の再プログラミングの撥髪、拡張やメンテナンスからケラチノサイトの導出を含むケラチノサイト由来hiPSCsの生成のための詳細なプロトコルを提供します。

<table><tbody><tr><td>抗生物質ミックス:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 ng/ml 抗真菌薬アムホテリシン B</td><td>Σ</td><td>A2942-20ml</td><td>抗生物質ミックスはPBSで構成されています。&nbsp;</td></tr><tr><td>1X ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PBS (-)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充 (KSR) 培地:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>KSR培地は、使用前にStericup(Millipore、#SCGPU05RE)を使用してろ過されます。bFGFは、使用前に培地に新鮮に添加されます。</td></tr><tr><td>20% ノックアウト血清補充 (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 with glutamax</td><td>Invitrogen</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>1&times;MEM非必須アミノ酸</td><td>Invitrogen</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;0.5倍;ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;0.1 mM &β;-メルカプトエタノール</td><td>Invitrogen</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;bFGF (10 ng/ml, 新鮮添加)</td><td>Millipore</td><td>GF003</td><td></td></tr><tr><td>ケラチノサイト培地:&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;EpiLifeと60&nbsp;&マイクロ;M カルシウム</td><td>Invitrogen</td><td>M-EPI-500-CA</td><td></td></tr><tr><td>1回;ヒトケラチノサイト増殖サプリメント(HKGS)</td><td>Invitrogen</td><td>S-001-5</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)培地:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>FBS培地は、Stericup(Millipore、#SCGPU05RE)を使用してろ過してから使用します。</td></tr><tr><td>10%ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>0.5x ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>細胞外マトリックス (ECM):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング&nbsp;</td><td>354234</td><td>Aliquot Matrigel 在庫と-80°Cの保管。C次メーカーの指示。マトリゲルのストック濃度はバッチごとにわずかに異なります(~9mg/ml)。200&microの使用をお勧めします。l 12ウェルプレートをコーティングするためのマトリゲル(~150&micro;g/well).&nbsp;</td></tr><tr><td>コーティングマトリックスキット&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R-011-K</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド:&nbsp;</td><td></td><td></td><td>pCXLE-eGFPはトランスフェクション効率のモニタリングにのみ使用され、リプログラミングには必要ないことに注意してください。</td></tr><tr><td>⇒&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;pCXLE-eGFP</td><td>Addgene</td><td>27082</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;pCXLE-hOct3/4-shP53F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td></td></tr><tr><td>-&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬 Fugene HD</td><td>Promega</td><td>E231B</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン (豚の皮から)</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td>蒸留水で0.1%ゼラチンを作ります。使用前にオートクレーブを打つ&nbsp;</td></tr><tr><td>減少した血清培地:OPTI-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ml</td><td></td></tr><tr><td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー</td><td></td><td></td><td>MEFは、前述したようにマイトマイシンC治療または照射により不活化することができる16。</td></tr><tr><td>26G ニードル</td><td>テルモ</td><td>NN2613R</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート (組織培養処理)</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12 ウェルプレート (組織培養処理)</td><td>BD Biosciences</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>10 cm ディッシュ (組織培養処理)</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105-041</td><td>10 mg/mL</td></tr> <tr><td>で使用コラゲナーゼIV</td><td>Invitrogen</td><td>17104-019</td> 1 <td>mg/ml</td></tr><tr><td>で使用 TRA-160 抗体</td><td>ミリポア</td><td>MAB4360</td><td>5 μ で使用;g/ml</td></tr><tr><td>OCT4 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-5279</td><td>5 & micro で使用。g/ml</td></tr><tr><td>NANOG抗体</td><td>R&Dシステム</td><td>AF1997</td><td>10 & マイクロで使用。g/ml</td></tr><tr><td>MycoAlert 検出キット</td><td>ロンザ</td><td>LT07-418</td><td></td></tr></tbody></table>

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

最近のリプログラミングの進歩により、体細胞をヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)に変えることができます。患者特異的なiPS細胞を用いた疾患モデリングにより、発症の根本的なメカニズムの研究が可能になり、治療の選択肢を改善するためのin vitro薬物スクリーニングや遺伝子治療の開発のためのプラットフォームも提供されます。近年、iPS細胞に関する論文が>7000件ほど増えていることからも、再生医療におけるhiPS細胞の有望な可能性が明らかです。皮膚線維芽細胞、造血細胞、表皮ケラチノサイトなど、異なる系統のさまざまな細胞タイプがhiPSCの生成に使用されています。皮膚生検と採血は、hiPSCを生成するための体細胞の供給源として多くの研究室で日常的に行われていますが、毛髪ケラチノサイトの収集とその後の誘導はあまり一般的ではありません。毛髪由来ケラチノサイトは、患者から細胞サンプルを採取するための非侵襲的なアプローチです。ここでは、抜毛した毛髪からケラチノサイトを誘導するための簡単な非侵襲的方法の概要を説明します。また、エピソームベクターを用いたインテグレーションフリーのhiPSCを作製するためのケラチノサイトのメンテナンスとその後のリプログラミングについても説明します。

成長期（成長期）、退行期（退行期）および休止期（休止期）20,21：髪は成長サイクルの3つの異なる段階を通過します。成長期毛包上皮の複数の層を含んでいます。これらの層は、ORS、IRSと毛幹（ 図1）を含みます。成長期の毛は最終的ORSと毛幹分化の終了のアポトーシスによってマークされて退行期への移行受けます。最後に、アポトーシスが停止し、休止期の毛包が休止期特性20,21の膨らみと静止なり休止期、退行期の毛に遷移。 図1は、休止期の毛および成長期毛の形態を示しています。当社は通常、ケラチノサイト誘導のため成長期毛を利用します。このプロトコルに続いて、ケラチノサイト増殖物は早くも3日間ヘアアタッチメント（ 図2A）の後に観察することができるとpしていきますroliferate（ 図2B）。我々の経験では、いくつかの成長期毛は、ケラチノサイト成長を観察するために添付したり、失敗に失敗することがあります。成功...

この原稿は、抜毛された髪の毛からのヒトケラチノサイトの誘導と維持、およびその後のエピソームベクターによる統合フリーのヒト人工多能性幹細胞（hiPSCs）の生成のための段階的な手順を提供します。

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

本手順の目的は、毛髪由来の角化細胞を用いてヒト人工多能性幹細胞を作製することです。まず、ドナーから毛髪を単離します。次に、角化細胞の増殖を促進させるために、毛髪をプレートに播種します。次に、ケラチノサイトをin vitroで維持および増殖させます。最終ステップでは、エピソーマルリプログラミング法を用いて、ケラチノサイトをヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）へとリプログラミングします。最終的に、ヒトiPS細胞を単離し、免疫組織化学を用いて多能性マーカーの発現を確認することで特性解析を行います。レトロウイルスやレンチウイルス法などの既存の手法と比較して、本手法の全体的な利点は、エピソーマル因子を用いることで、幹細胞のゲノムへの不必要な外来遺伝子の組み込みを回避できる点にある。まず、細胞外マトリックス溶液のバイアルを氷上で一晩かけて解凍する。翌朝、あらかじめ冷却したピペットチップを使用して、溶液 200 µL を、冷却した 12 mL の DM F 12 培地に加える。希釈した細胞外マトリックス溶液を12ウェルプレートの各ウェルに1 mLずつ加え、37 °Cで一晩インキュベートしてウェルをマトリックスでコーティングします。次に、ドナーの頭部から、指を毛根の近くに置き、素早くスムーズな動作で毛を抜くことで、ヒト原毛を採取します。採取した各毛髪に完全な毛包が含まれているか確認します。解剖顕微鏡下で毛包を観察し、各毛髪の成長期を判定します。ケラチン氷を抽出するため、各個体から5〜10本の抗原毛を採取します。抗原相は、T相とは異なり、多層の上皮を含んでいます。毛髪サンプルを10 millilitersの抗生物質混合液を含むペトリ皿に5分間浸し、その後、室温でPBSを用いて5分間洗浄します。次に、滅菌鉗子で毛髪を保持し、滅菌鋏を使用して余分な毛幹を切り落とし、完全な毛包と約0.5から1センチメートルの毛幹を持つ毛髪断片を残します。細胞外マトリックスでコートしたプレートの各ウェルに、毛髪断片を1つずつ慎重に転送します。滅菌済みピンセットを用いて、毛髪サンプルが入った各ウェルに、約 100 to 200 µL の血清代替培地を滴下します。その後、プレートをインキュベーターに入れ、37 °C、5% 二酸化炭素の条件下で一晩おいて、毛包を接着させます。翌日、毛髪サンプルを湿潤状態に保つため、さらに100～200 µLの血清代替培地を滴下してゆっくりと加えます。毎日毛髪サンプルを確認し、毛包がプレートに正常に接着しているかを確認してください。細胞が付着した後、ウェルにさらに500 µLの培地を穏やかに加えます。培地交換は2日ごとに行います。6ウェルプレートをコラーゲンでコーティングしておきます。コーティングマトリックスキットなどの前処理を用い、各ウェルにキットの希釈液 680 µL を加え、続いてコーティングマトリックス溶液 6.8 µL を加えます。プレートを静かに揺らし、均一にコーティングされるようにします。ケラチノサイトを播種する前に、コーティングしたプレートを室温で 30 分間インキュベートします。コーティング溶液を除去し、各ウェルに0.25%トリプシンを500 µL添加して培養中の角化細胞を単一細胞懸濁液に解離させ、プレートを37 °Cで2～5分間インキュベートします。細胞がプレートから剥離したら、血清含有培地500 µLでトリプシンを不活化し、滅菌済みの15 mLチューブに細胞を回収します。滅菌済みのピンセットを用いて毛髪断片を除去し、細胞をペレット化してから再懸濁します。それらを新鮮な角化細胞増殖培地に懸濁させ、角化細胞培地を用いて、コラーゲンコートしたプレートの1ウェルに40,000個の角化細胞を播種します。培地を毎日交換し、培養細胞が約80%コンフルエントになった時点で継代します。0.1%ゼラチン溶液を各ウェルに2 mLずつ加え、6ウェルプレートをゼラチンでコートし、室温で少なくとも20分間放置します。その間に、継代数が6回以下の角化細胞に、1ウェルあたり1 mLの0.25%トリプシンを加えて2〜5分間インキュベートし、単一細胞懸濁液にします。37 °Cにて、血清を含む培地1 mLを加えてトリプシンを不活性化し、細胞を15 mLチューブに回収します。細胞をペレット化し、ケラチノサイト培地で再懸濁します。次に、ゼラチンコートした6ウェルプレートの各ウェルに100,000～150,000個のケラチノサイトを播種し、一晩インキュベートします。翌日（0日目）にプレートを確認し、細胞のコンフルエンスが50～60%であることを確認します。付属のテキストプロトコルに従い、トランスフェクション試薬 8 µL に対し、全プラスミドDNA 2 µg の比率で、ケラチノサイトにエピソーム再プログラミングベクターをトランスフェクションします。翌日（1日目）にケラチノサイトの培地を交換し、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光タンパク質（GFP）陽性細胞の割合を推定して、トランスフェクション効率を確認します。2日目には 60 ～ 70% のトランスフェクション効率が見込まれます。導入効率を90%以上に高めるために、トランスフェクションを繰り返します。次に、10 cmディッシュに0.1%ゼラチン5 mLを加え、20分以上プリコートします。Conrad Alらによる記述に従い、FBS培地を用いて、10 cmディッシュあたり400万個の有糸分裂不活性化フィーダー細胞を播種し、3日目に37 °C、5% CO₂のインキュベーター内で一晩静置して細胞を接着させます。前述の手順でトランスフェクションしたケラチノサイトを回収し、KSR培地に再懸濁して播種します。1つのウェルから角化細胞の90%を、フィーダー細胞を用いて準備した10 cmディッシュに移し、KSRで被覆します。培地を用いて、21日目以降にヒト人工多能性幹細胞コロニーを手動で切り出して分離します。互いに密集しているコロニーは避け、他のコロニーから明確に分離しているもののみを選択してください。手動での分離には、解剖顕微鏡下で26ゲージの針を用い、コロニーを長さ約300〜600 µmの小さな断片に切り分けます。1つのコロニーから切り分けた断片を新しいMEFフィーダープレートに移し、ヒト人工多能性幹細胞のクローン株を樹立させます。培養が70〜80%コンフルエントに達し、ヒト人工多能性幹細胞のコロニーの直径が約1.5 mmになったら、Accutane、sase、またはコラゲナーゼなどの標準的な酵素的パッセージ法を用いて細胞を継代します。4つ目は、製造元の指示に従ってください。本プロトコルに従うと、毛髪接着後早ければ3日で再増殖が観察され、その後も増殖し続けます。ここで示した角化細胞は新しいプレートに継継されており、これらの細胞は複数回の継代が可能です。この画像は、角化細胞由来のヒト人工多能性幹細胞コロニーの典型的な例を示しています。リプログラミングから32日後、ヒト人工多能性幹細胞コロニーの中心部で一部に分化が生じることがあります。手動でピックアップすると、誘導された細胞は通常、高い核細胞質比を示し、明確なコロニー境界を形成します。また、これらはOCT4やTRA-1-60などの多くの多能性マーカーを発現しています。このビデオを視聴することで、毛髪から角化細胞を抽出し、それらをヒト人工多能性幹細胞へとリプログラミングする方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は、人的要因Oct4は、レトロウイルスベクター、Nanogの、そしてLin28のレンチウイルスを介した配信を用いてヒトの体細胞から誘導多能性幹細胞の生成のためのプロトコルを示す。多分化能は、形態と胚性幹（ES）細胞特異的マーカーの存在によって確認された。...

StemgentヒトTFのレンチセットでヒト線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成

以下のプロトコルは、完全なノックアウト血清代替のフィーダーフリー培地（KSR -...

完全ノックアウト血清代替フィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のフィーダーフリー適応、文化と継

このプロトコルはノックアウトSRの凍結保存培地でヒトiPS細胞をcryopreserving、完全ノックアウトSRフィーダーフリー（KSR -...

完全ノックアウト血清代替のフィーダーを含まない培地を用いてヒトiPS細胞のCryopreservingおよびリカバリ

この記事では、人間の毛包からの神経堤幹細胞の単離および培養のための堅牢なプロトコルを提案する。...

人間の毛包から神経堤幹細胞の単離および培養

誘導多能性幹細胞（iPS細胞）が臨床応用および基礎研究のための患者特有の組織のソースを表します。ここでは、非組み込みエピソームプラスミドを用いてウイルスを含まないiPS細胞に凍結バフィーコートから得たヒト末梢血単核細胞（PBMNCs）を再プログラムするために詳細なプロトコルを提示します。...

非統合ソームプラスミドを用いて凍結軟膜から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

ヒトに誘導された多能性幹（hiPS）細胞の強力な誘導は、真皮線維芽細胞の非組込みセンダイウイルス（SeV）ベクター媒介性再プログラミングを使用することによって達成された。 hiPS細胞の維持およびクローン増殖は、組換えヒトラミニン521（LN-521）マトリックスおよびEssential E8（E8）培地を用いた異種非含有および化学的に規定された培養条件を用いて行った。...

ラミニン521マトリックスを用いたヒト誘導多能性幹細胞の統合された誘導

これらのケラチノ サイトと線維芽細胞を用いた誘導多能性幹細胞由来ケラチノ サイトと線維芽細胞を区別し、3 D 肌 organoid を生成する方法を示すプロトコルを提案します。このプロトコルには、ヒト化マウス...

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

プロトコルを提案ここで各体節の誘導体 (筋節、椎板、皮膚分節、syndetome)...

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

細胞リプログラミングでは、多能性細胞状態を調節し維持する主要遺伝子の導入が必要です。記載されたプロトコルは、ウイルス/統合方法なしでヒト皮膚線維芽細胞からの誘導多能性幹細胞(iPSC)コロニーの形成を可能にするが、非修飾RNA(NM-RNA)を免疫回避因子と組み合わせて細胞防御機構を低下させる。...

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。...

気液界面培養システムを用いたヒト人工多能性幹細胞由来平面毛髪皮膚オルガノイドの作製

学ぶ 髪由来ケラチノサイトを用いた統合フリーのヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）生成法。エピソームベクターによる再プログラミングで、ゲノムへの組み込みリスクを回避し、再生医療や疾患モデリングへの応用が期待されます。

髪の由来ケラチノサイトを使用した統合フリーヒト誘導多能性幹細胞の生成

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