エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

本実験の全体的な目的は、細胞を損傷させることなく非常に効率的に浸透できる試薬である、二量体蛍光tatまたはdf tatを用いて、生細胞内に高分子を導入することです。これは、まず送達剤を生成・精製し、次にDftaを用いることで達成されます。

Dftaを目的の高分子カーゴと共に、37 °Cで1時間細胞とインキュベートします。df tatは、エンドサイトーシス小胞内へのカーゴの取り込みを誘導します。小胞は初期エンドソームへと成熟し、最終的に後期エンドソーム段階に達すると、DF tatは細胞の細胞質空間にカーゴを放出させることができます。次に、dettaおよび目的のカーゴのデリバリー効率を評価するため、蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。

結果から、DF TTは高い効率で細胞内に浸入でき、観察可能な細胞毒性はないことが示されました。蛍光顕微鏡での観察により、DF tatが異なるサイズの高分子を細胞の細胞質空間に輸送できることが確認されました。既存の固体輸送法に対する本手法の主な利点は、細胞生理に観察可能な悪影響を与えることなく、高い輸送効率を実現している点にあります。さらに、単純な共インキュベーション工程のみで済むため、使用が容易です。

まず、FTA合成を開始するために、Rアミド、MBHA樹脂、およびジメチルホルムアミド（DMF）500 mgを標準的な50 mLのSPPS容器に入れ、1時間膨潤させます。反応液に気泡が生じる程度の窒素ガスを流しながら、室温で反応を行います。テキストプロトコルに記載されている各FM保護アミノ酸を1.2 mmolずつ使用し、RinkアミドMBHA樹脂上でFTAを合成します。各アミノ酸のカップリング反応において、HBTU 0.44 gとDMFに溶解したDIEA 0.51 mLを添加します。各アミノ酸のカップリング反応を4時間行い、4時間のカップリング後、次の工程に進みます。

樹脂をDMFで洗浄し、テキストプロトコルに記載されている通りにFD保護ステップを行う。FTAの線状ペプチド鎖が合成されるまでこれを繰り返す。次に、1%トリフルオロ酢酸（TFA）および2%トリイソプロピルシラン（TIS）を含むDCM溶液20 millilitersを用いて樹脂を5分間インキュベートし、MTT保護基を切り離す。

MTT保護基の除去により黄色に呈色するため、樹脂をDCMおよびDMFで洗浄しながら、黄色が見られなくなるまでこの操作を繰り返します。さらに、1%TFA/DCM溶液を樹脂に加え、MTTが除去されず溶液が透明なままであることを確認します。

次に、T-M-R-H-B-T-UとDIEAをDMFに溶解させ、この混合液を樹脂に加えます。乾燥窒素を用いて、fm保護およびアミノ酸接合後の撹拌を行い、一晩反応させます。樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させてから、樹脂からペプチドを完全に切り出します。

92.5% TFA、2.5% 水、2.5% TIS、および 2.5% エタンジチオールを含む溶液をペプチジル樹脂に加え、室温で3時間静置して、完全な脱保護および樹脂からの切り出しを行います。調製した溶液を40 milliliters のエチルエーテル中に注ぎ、冷無水エチルエーテルを用いて粗ペプチド生成物を沈殿させます。これを4 °C、4,000 Gで20〜25分間遠心分離します。

この手順を繰り返し、冷たい無水エチルエーテルで沈殿物を洗浄します。沈殿物を水に懸濁させて凍結乾燥し、得られた生成物を0.1% TFA水溶液に再懸濁します。分析用C 18カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析を行います。

各ペプチドを分析するには、流速 1 mL/min、検出波長 214 nm および 550 nm で行います。次に、ペプチド精製のため、C 18 カラムを用いてセミプレパラティブ HPLC を実施します。すべてのランにおいて、流速 4 mL/min、検出波長 214 nm および 550 nm で行います。

酸化反応を行う前に、リニアグラジエントを使用してください。製造元のプロトコルに従い、MALDIを用いてペプチドの正しさを確認してください。FTAをエアレーションしたリン酸緩衝生理食塩水に溶解します。

pHが7.0から7.5の間にあることを確認してください。ペプチド添加後、反応が完結するまで一晩反応させます。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、前述と同様に質量分析で解析します。精製したDF tatを凍結乾燥させ、200 µLの水に再懸濁して濃度を測定します。

まず、精製したDF tatの分注量を149 µLの50 mM TCEP溶液で再懸濁し、サンプルを約20分間反応させます。このステップでは、TMR fluor 4とDF tatが近接しているために起こる吸光度消光を排除するため、DF tatをモノマー形態のF tatに還元します。すべての溶液を石英製キュベットに加え、556 nmにおける吸光度を測定します。

Beer-Lambertの法則を用いて、溶液の濃度を決定します。これがftaの濃度に相当します。

FTAの濃度を2で割り、dftaの濃度を算出します。37 °C、5% CO2含有の加湿雰囲気下で、細胞を適切な培地を用いてコンフルエンシーが80〜90%になるまで培養し、200 µLのPBSで3回、次にNRL 15で1回、細胞を洗浄します。カーゴ（enhanced green fluorescent proteinなど）を含む、あるいは含まない5 µMのdf tatとともに細胞をインキュベートし、37 °Cで1時間保持して、インキュベーション後のエンドソーム漏出を誘導します。

細胞の細胞膜に結合したDF tatを除去するため、L 15培地中のヘパリンで細胞を3回洗浄します。最終ステップとして、赤色蛍光タンパク質またはRFPフィルターを用いて蛍光顕微鏡で細胞を撮影し、DF tatを可視化することで、F TATとD fttの差を評価します。HeLa細胞を各ペプチドとともにインキュベートし、それらの細胞内局在の違いを判定します。

ここに示されているように、FTAは点状に分布しています。この分布は、ペプチドがエンドソーム内部に捕捉されたままであることと一致しています。対照的に、dftaの蛍光シグナルは、細胞質および核全体に均一に分布しています。

DF tatの細胞質内分布を、複数の異なる細胞株で観察します。20倍の画像では、ディッシュ内の非常に高い割合の細胞において、細胞毒性がない状態でDF tatの細胞質分布が示されています。これは、cyt blueによる核染色で確認されます。これにより、dfta介在性のエンドソーム漏出によって大きなタンパク質が細胞の細胞質へ輸送されるか否かを判定します。正しく折りたたまれたタンパク質の輸送を検出するために、EGFPが使用されました。

EGFPは、細胞の90%以上でDF tatに見られるのと同様に、細胞質および核に緑色蛍光分布を示し、観察可能な毒性は認められませんでした。この手順を行う際は、細胞を過剰にコンフルエントにしないことが重要です。さらに、df tapを添加する前に、細胞を十分に洗浄してFPSを除去してください。