Name: エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶエンドソーム溶解試薬dfTATを用いた生細胞へのタンパク質・ペプチド・細胞不浸透性小分子の送達法。蛍光顕微鏡で効率を評価し、細胞傷害なしに高効率な細胞内導入を実現する。

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>jove_content<この記事は、National Institute of General Medical Sciences、Norman Ackerman Advanced Research Program、およびRobert A. Welch Foundation（Grant A-1769）からのAward Number R01GM087227の支援を受けました。

1. SPPS：CK（TMR）TATG（fTAT）の合成注：dfTATを形成するジスルフィド結合二量体化に続いて、固相ペプチド合成によってfTATモノマーの合成：dfTATは二段階で製造されます。 <ol><li> 1時間の標準的な50 mlのSPPS容器中にジメチルホルムアミド（DMF）中のRinkアミドMBHA樹脂500mgの膨潤。 </li><li> 20％ピペリジン溶液（DMF中20％ピペリジンを10ml（0.30ミリモル）中のFmoc保護樹脂をインキュベートすることによってFmoc脱保護を行う。使用した洗浄工程で（1×5分間および1×15分）で2回脱保護工程を実行し反応の間にDMF（洗浄工程は、約150 mlのDMFの総容積で樹脂を複数回洗浄し、真空ろ過により溶媒を除去することを含みます）。 </li><li> RinkアミドMBHA樹脂にCK（TMR）RKKRRQRRRG（fTAT）を合成。使用したFmocは、アミノ酸の保護以下：Fmoc-Lys（Mtt）-OHを（N末端のみに）、のFmoc-Lysのカルボニル（Boc）を-OH、のFmoc-Glyを-OH、のFmoc-Argの（はPbf）-OH、のFmoc- GLN（Trtの）-OH、およびFmoc-Cysを（Trtの）-OH。反応を攪拌するN 2（20 PSI）を使用して反応を行います。室温で全ての反応を実行します。 <ol><li> 4時間、各アミノ酸カップリング反応を行います。各カップリングのため、のFmocアミノ酸（1.2ミリモル）、N、N、N &#39;、N&#39; -Tetramethyl- O-（1 H -benzotriazol -1-イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）（0.44グラム、1.1ミリモル保護使いますDMFに溶解）、およびジイソプロピルエチルアミン（DIEA）（0.51ミリリットル、3.0ミリモル）。 4時間のカップリングに続いて、ステップ1.2で説明したようにDMFで樹脂を洗浄し、Fmoc脱保護ステップを実行します。 </li><li>合成した：fTATの直鎖状ペプチド鎖（CKRKKRRQRRRGなしTMRリニアペプチド鎖が）まで繰り返します。 </li><li>そして、徹底的に最初にDMFを使用して、ジクロロメタン（DCM）であることを以下の樹脂を洗浄。 DMFまたはDCMの約150ミリリットルの全容量で樹脂を複数回すすぎ、真空濾過により溶媒を除去します。 </li><li> USE MALDI-TOFは、得られたペプチドは、適切な分子量を有することを確認しました。 <ol><li>水溶液とアセトニトリル50μlの0.01％TFAを50μlからなる溶液にマトリックス1mgを追加することにより、マトリックスミックスを行います。 </li><li>直鎖状ペプチド鎖の質量、使用αシアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸を確認します。粗ペプチドの分析HPLCを実行し、純粋なピークの頂点から50μLを集めます。 </li><li> MALDIプレート上にプレートに試料を調製するために：乾燥または37℃の熱板上を空気にMALDIプレート上にマトリックス溶液と場所の2μlにペプチドの8μLを追加します。 注：アルギニンは、SPPS中のカップルに困難なアミノ酸であることが知られています。成功したカップリングはKaiser試験14（例えば、ニンヒドリンテスト）を実行することによって確立されます。このテストでは、樹脂上にカップリングしていないままになることがあり遊離アミンの検出を可能にします。場合に青色が（遊離アミンの存在を示す）を検出し、結合のTEPSを繰り返します。 </li></ol></li></ol></li><li> CKのために（-NH-TMR）TATG（fTAT）、1％トリフルオロ酢酸（TFA）、2％トリイソプロピルシランからなる溶液でCKでのLysのアミノ基で（-NH-MTT）をTATGのMtt保護基を開裂DCM（TIS）。 <ol><li> MTT保護基の除去には、黄色の色が観察されなくなるまでこれを繰り返して、5分間、上記溶液20mlで樹脂をインキュベートし、イエロー色の外観をもたらすように。間に、DCM、DMFで樹脂を洗浄します。 TISは、MTTを清掃うスカベンジャーであることからさらに、一度何の黄色はMTTの存在下で、溶液中で表示されません。 </li><li>これ以上MTTが削除され、溶液は透明のままであることを保証するための樹脂に、DCM中の1％TFA（無TIS）と追加の溶液を加えます。 </li></ol></li><li> DMF中のカルボキシ（TMR）、HBTU、およびDIEA（（）MG中の樹脂の量に対して4、3.9および10等価）、この混合物を追加します。3成分を溶解樹脂に、反応を実施O / Nで攪拌を提供するために、乾燥N 2を用いました 。 </li><li> Fmocの脱保護およびアミノ酸結合後、DCMで樹脂を洗浄し、乾燥させます。樹脂からのペプチドの完全な切断のために、3のためのペプチジル樹脂を92.5％TFA、2.5％H 2 O、2.5％TIS、2.5％のエタンジチオール（EDT）（総容積= 4 ml）を含有する溶液を加え樹脂からグローバルな脱保護および切断を達成するために、室温で時間。 <ol><li> Et 2 O 40ミリリットルにステップ1.6からの溶液を排出することによって冷たい無水エチルエーテル（Et 2 Oで）を使用して、粗ペプチド産物を沈殿させ、4℃でスピンダウンし、20 4,000 XG - 25分。冷たい無水Et 2 Oで沈殿物を洗浄できるようにするには、この手順を繰り返し</li><li>水（5 mlまたは沈殿物が完全に溶解するまで）、および凍結乾燥の沈殿物を再懸濁します。その後、0.1％TFA水溶液/アセトニトリル中で得られた生成物を再懸濁します。 </li></ol></li> &lt;李は&gt;各ペプチドを分析するための分析C18カラム（5ミクロン、4×150ミリメートル）でHPLC分析を行います。 1ml /分、および214nmで検出し、550nmでの流量を使用します。 </li><li>ペプチド精製のためのC18 10×250mmカラム上の分取用HPLCを実行します。 214 nmおよび550 nmでのフロー4ミリリットル/分の速度、および検出を使用してください。すべての実行については、0.1％TFA水溶液（溶媒A）、90％アセトニトリル、9.9％の水、0.1％TFA（溶媒B）の直線勾配を使用しています。 </li><li> fTAT、予想質量：2,041.17、観察された質量：2040.66、製造業者のプロトコルに従って、MALDI-TOFによりペプチドの正確な身元を確認してください。 DEAC-K9、予想質量：1,415.59：1,412.97は、質量を観察しました。 MALDI-TOF用のα-シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸マトリックスを使用してください。 </li></ol> 2.酸化反応：dfTATジェネレーション<ol><li> 1時間（以下の反応のための少なくとも5 ml）を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、pH7.4中に通気。 </li><li> AERにfTAT（0.3ミリグラム、1.5×10 -4モル）を溶解PBSのpHを7.4（5 ml）をated。ペプチドを添加した後、7.5 - pHが7.0の間にあることを確認してください。バック7.4までのpHを - （5μlの1 M、少しずつ1）水酸化ナトリウムを追加しない場合。 </li><li>注：PBSに溶解した酸素はfTAT上のチオール基を酸化し、ジスルフィド結合を形成するように作用します。 </li><li>それが完了（HPLC分析に基づいて、100％の収率）まで反応することを可能にする反応章動O / N。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、ステップ1.9のように質量分析法（MALDI-TOF）によって分析します。期待質量：4,084.21：4,080.34は、質量を観察しました。 </li><li>凍結乾燥純粋dfTAT（0.71×10 -4 mmol）および200μlの水に再懸濁し（濃度純粋dfTAT = 356.3μM）。 </li></ol> 3. dfTAT濃度を測定<ol><li> 50 mMのTCEP溶液を149μlの精製したdfTAT（精製されたペプチドの量に応じて、通常は1マイクロリットル）のアリコートを再懸濁します。 </li><li>注：このステップではdfTATは、そのMOに還元されます原因dfTATでTMRの蛍光団（dfTATにおけるTMRの吸光係数εが減少fTATにおけるTMRのεと比較して減少している）の近接に発生した吸光度消光を排除するnomer対応fTAT。 </li><li> （分析HPLCはfTATの形成を確認するために使用することができる）、サンプルを約20分間反応させます。 </li><li>石英キュベットにすべてのソリューションを追加し、556 nmの吸光度を測定します。 </li><li>ベールの法則を用いて（A =εcl：ε= 91500 M -1 cm -1で）は 、fTATの濃度を計算dfTATの濃度を決定し、2で[fTAT]分割します。 </li></ol> 4.細胞配信実験<ol><li> 90％（例えば、8ウェルまたは24ウェルディッシュ） - 80の密集度でシャーレ内の細胞（HeLa細胞、HDF など ）をシード。 37℃で90％の密集度-適切な培地中で細胞を増殖させる80まで（例えば、DMEM、10％FBSおよびペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました）5％のCO 2を含む加湿雰囲気。 </li><li> （200μlのPBSを追加し、それを3回除去することによって）、PBSで細胞を3回（3回）洗浄します。 </li><li> （8のためによく全量を200μlのでなければならない一品）NRL-15培地中で（水中）dfTATの株式を希釈することによりdfTATの作業濃度5μMを行います。 5μMdfTATの濃度は、現在までに試験されたほとんどの細胞型で効率的な配信（皿の中に存在する細胞の90％以上で細胞質ゾルデリバリーのハイレベル）（ 図3）につながります。しかし、より低いまたはより高い濃度の浸透に高いまたは低い傾向を持つ細胞タイプのためのより適切な場合があります。 メディアに関する注：それはdfTAT中のジスルフィド結合を減らすことができるシステインを含んでいないため、NRL-15はdfTATの送達のために使用されます。しかし、我々のデータは、通常のL-15（システイン）及びDMEM両方が送達媒体として使用することができることを示しています。 L-15は、還元アミノ酸システインが、システインpresumabが含まLYは（DMEMがシスチンを用いて製剤化された）、シスチンを形成するために、培地中で酸化します。 dfTATしたがって、これらの媒体内にそのまま残り、配信はnrL15で得られたものと同じ効率で動作します。 </li><li>伴うまたは積荷なしdfTAT（5μM）（ 例えば 、EGFP（10μM））で細胞をインキュベートし、（インキュベーション時間を低減することができるが、dfTATは、典型的には、エンドソームの漏出を誘導するために、約30〜45分を必要とし、1時間37℃で維持）。 </li><li>細胞の細胞膜に結合したdfTATを削除する（3回の洗浄が推奨されている）L-15中のヘパリン（1 mg / ml）で細胞を洗浄。 </li><li>に従ってのSytoxブルー、。 例えば、細胞不透過性の核染色で細胞をインキュベートし、のSytoxグリーン（NRL-15で2μM）、細胞の細胞膜が損なわれているかどうかを判断する（生細胞ではないだろうが、死細胞を染色されます）製造業者のプロトコル。 </li><li>蛍光顕微鏡（100倍の油浸または20X対物レンズ）を用いて、画像セル。 RFPフィルタを用いた画像dfTAT（例=560±20 nmで/エム= 630±35 nm）で。 注：正常配信は（目的のタンパク質またはペプチドの送達を評価する用途に依存する）は、細胞全体dfTAT蛍光の拡散につながります。 fTAT（サイトゾルエントリ時dfTATの還元生成物）による核小体の染色が検出された蛍光が細胞内であることを指標として用いることができます。 fTATは数時間以内に低下します。この時点で、分解フラグメントの蛍光は点状として表示されます。これはdfTATが失敗した（dfTATは濃度が低すぎるで存在する場合、この現象が発生することができます）、エンドソーム内に閉じ込められたまま場合にも見られている点状分布のために混同してはなりません。 </li></ol>配信MOIの5 Controling濃度<ol><li>使用した細胞型におけるdfTATの効率的な細胞質の放出を達成するために必要な「最適な配信」の濃度を特定します。 increasinとインキュベートした細胞に蛍光顕微鏡を実行しますdfTAT gの濃度。最適dfTAT濃度はサイトゾル消去につながる最小濃度として定義されている培養物中の細胞の約100％にTMR蛍光を「拡散します」。 </li><li> （dfTATの最適な送達濃度を用いて、例えば ）dfTAT一定の濃度を維持しながら、MOIの濃度は、共インキュベーションプロトコルで使用される変化します。 1時間未満にインキュベーション時間を変更すると、MOIは、配信の量を変化させるためのオプションであってもよいです。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

これは送達効率に影響を与える可能性があるためdfTAT配信に使用される細胞は、（&gt; 90％の集密度）過度にコンフルエントであってはなりません。細胞はまた、健康でなければなりません：文化の中で死んだ細胞がdfTATは（劣化した核から例えば、DNA）を対話することができるアポトーシス断片を放出することができます。これにより、配信効率及びイメージングの質を妨害することができます。細胞はdfTATを追加する前にFBSを除去するために十分に洗浄する必要があります。 FBSにおけるBSAの存在dfTATに結合することができ、これはdfTATの送達効率を低下させることができます。しかし、過度の力として慎重に行われるべきであるウォッシュは、接着細胞を培養皿から切り離したりdfTATを用いてタンパク質/ペプチドを提供し、下部エンドサイトーシスuptake.Whenにつながるストレスの原因になることがあり、タンパク質/ペプチド原液サンプルは十分でなければなりません200μに10μlのサンプル- 5で追加して、 例えば ：インキュベーション中にNRL-15メディアの過度の希釈を避けるために集中L N...

生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不透過性小分子の送達は、多くの生物学的またはバイオテクノロジー用途（細胞イメージング、機能的アッセイ、細胞の再プログラミングなど ）1-4でしばしば望ましいです。多くの送達アプローチは、既にマイクロインジェクション、エレクトロポレーション、またはキャリア剤の使用を含め、報告されている（ 例えば 、例えば、TATのような細胞透過性ペプチド、脂質）5-7。各技術は、典型的には、特定のアプリケーションのためではなく、他人のために、これらのアプローチが適切になるかもしれない特定の長所と短所を持っています。一般的な問題は、 例えば （全人口の貧しい配信の効率化および/ ​​または8,9を配信されるどのくらいの材料の制御の欠如、毒性または有害な生理学的影響10,11、時間的制御の欠如、少数の細胞での配信ではなく、を含みます。、マイクロインジェクション）12、および複雑な化学的結合または製剤スキーム11。 S = &quot;jove_contentは&quot;&gt;最近​​、我々はこれらの制限を回避する新たな配信戦略を開発しました。この戦略は、dfTAT（二量体蛍光TAT）13という名前のペプチドに依存しています。 dfTATは周知の細胞透過性ペプチド（CPP）TATに由来します。 dfTATは、フルオロフォアのテトラメチルローダミンで標識TATの2つのジスルフィド結合したコ​​ピーが含まれています。その類似性にもかかわらず、TATおよびdfTAT活動に大きく異なります。 TATは、典型的には、エンドサイトーシスによって細胞内に内在化されます。このCPPは、しかし、大部分（蛍光顕微鏡で検査したとき、これは通常、細胞内ペプチドの点状の分布につながる）、エンドソーム内に閉じ込められたままになります。 TATのように、dfTATを効率的に細胞によってエンドサイトーシスされます。しかし、dfTATはエンドソーム内に閉じ込められたままにしません。その代わりに、それは非常に効率的な方法でエンドソーム漏れを媒介します。 dfTATのエンドソーム溶解活性は、単純なインキュベーションアッセイにより高分子を提供するために活用することができます。 ntentは &quot;&gt;次のように配信プロセスの現在の理解がある。dfTATがマクロピノサイトーシスを誘導する。その結果、dfTATとともにインキュベートした細胞は、流体相によってメディアに存在する可溶性タンパク質、ペプチド、または小分子（目的の分子、MOI）を取り上げますエンドサイトーシス（ 図1参照）。dfTATとMOIの間の相互作用が必要でない両方のエンティティトラフィック限り一緒にエンドサイトーシス経路内。dfTATはエンドサイトーシスの細胞小器官の内腔内の特定のしきい値に達すると、それはそのエンドソーム漏洩活性を発現する（分子の詳細。）完全には特性決定されて漏出性細胞小器官の内腔の内容のままであり、したがってMOIは、その後、細胞内に放出される。MOIとの接合または製剤スキームが必要とされないように、このアプローチは、したがって、非常に便利です。また、dfTATであるため、直接MOIを変更していない細胞内送達が達成されると、それはまたのMOIの機能を妨害してはならない。また、濃度をdfTATは、配信がメディアでMOIのそれとは独立して使用します。例えば、dfTAT濃度がエンドソーム漏れで再現可能な効率を保証するために、異なる実験間で一定に保つことができます。対照的に、培地中のMOIの濃度が徐々にMOIの所望のレベルを達成するために変更することができる細胞質ゾルに送達しました。 dfTATで達成高エンドソーム漏れ効率は、現在までに試験した細胞の多くと非常に無害です。エンドサイトーシス小器官は細胞の重要な構成要素であり、1つはdfTATによって媒介劇的な漏れが有害な細胞応答を伴うことであろうと予想されるので、これは驚きです。しかし、処理された細胞は、未処理の細胞と同じ速度で増殖し、そのトランスクリプトームの有意な変化は表示されません。また、配達は、細胞が失わずに許容されたり、配信プロセスから回復するかことを示し、再現性の配信効率で数分以内に繰り返すことができますエンドサイトーシスまたはエンドソーム漏れ能力。微妙な細胞応答はdfTAT配信およびこれらの応答が探求されないままであるかもしれないものの分子の詳細の間に行わ可能性があります。しかし、高効率、プロトコルの利便性、および毒性の欠如を組み合わせることで、この配信アプローチは、多くの細胞ベースのアプリケーションですぐに有用であることを証明する必要があります。本明細書に提示プロトコルは研究団体にこの技術がアクセス可能にすることを目的としています。

<table><tbody><tr><td>ヘパリン&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>CAS 9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Blue</td><td>Invitrogen</td><td>S11348</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green</td><td>Invitrogen</td><td>S7020</td><td></td></tr><tr><td>nrL15 L-15 (&ndash;) システイン</td><td>Hyclone</td><td></td><td>特注</td></tr><tr><td>Fmoc保護アミノ酸</td><td>Novabiochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dfTAT</td><td></td><td></td><td>サンプルはリクエストに応じて提供されます (連絡先:pellois@tamu.edu)</td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>37°Cに維持された加熱ステージを備えた<td>倒立型落射蛍光顕微鏡</td>オ<td>リンパス</td><td>モデルIXB1</td><td>。CおよびRolera-MGI Plus裏面照射型電子増倍電荷結合素子(EMCCD)カメラ(Qimaging)を使用。</td></tr><tr><td>37度;C加湿、5%CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペプチドシンセサイザーまたは手動ペプチド合成</td><td></td><td></td><td></td>をプリフォームするための容器</tr></tbody></table>

エンドソーム溶解試薬dftatとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Delivery of Proteins, Peptides or Cell-impermeable Small Molecules into Live Cells by Incubation with the Endosomolytic Reagent dfTAT

高分子送達戦略は、典型的には、細胞侵入経路としてエンドサイトーシス経路を利用します。しかし、エンドソーム捕捉が大幅に細胞の細胞質ゾル空間を貫通巨大分子れる効率を制限します。最近、我々は、試薬dfTAT、蛍光体テトラメチルローダミンで標識されたペプチドTATのジスルフィド結合二量体を識別することによって、この問題を回避しています。我々は、生細胞に浸透し、特に高い効率で細胞の細胞質ゾル空間に到達した原型の細胞透過性ペプチド（CPP）、TAT、dfTATの蛍光標識された二量体を生成しました。 dfTATのサイトゾル送達は初代細胞を含む複数の細胞株において達成されます。また、配達は著しく細胞の生存率、増殖または遺伝子発現に影響を​​与えません。 dfTATは、小分子、ペプチド、抗体、生物学的に活性な酵素や転写因子を提供することができます。本稿では、dfTAに関わるプロトコルを記述T合成および細胞送達。原稿は、細胞外に投与されたタンパク質の量を変化させることによって、細胞の細胞質ゾル空間に送達されるタンパク質の量を制御する方法について説明します。最後に、この新しい技術と配信の検証に必要な手順の現在の限界が議論されています。記載されているプロトコルは、細胞ベースのアッセイのためだけでなく、 細胞のex vivoで操作し、再プログラミングのために非常に有用です。

fTAT dfTATとの間の差を評価するために、HeLa細胞は、その細胞内局在の違いを決定するために、それぞれのペプチドで1時間インキュベートします。 2 CPPのの内在化は、蛍光顕微鏡を用いて評価した。 図2は fTAT（20μM）は点状の分布に局在することを示しています。この分布は、エンドソームの内部に閉じ込められたままのペプチドと一致しています。これとは対照的に、dfTAT（5μM）の蛍光シグナルは、細胞質ゾルおよび核全体に均一な分布が表示されます。 図3 dfTATの細胞質ゾル分布がCOLO 316、NIH 3T3、HaCaT細胞、を含む種々の細胞株の数で観察されていることを示していますニューロ-2A、MCH58、一次細胞ラインHDF、DRG-F11とNCL-H1299をトランスフェクトすることが難しいです。 20X画像なし細胞毒性を持つdfTATの細胞質ゾル分布（なしのSytox青核stainin皿の表示でその割合が非常に高い（&gt; 80％）を示していますG）。 dfTAT媒介エンドソーム漏れが細...

私たちは、エンドサイトーシスオルガネラをリーキーにする試薬との簡単な共インキュベーションプロトコルにより、タンパク質と細胞不透過性の小分子を培養された哺乳類細胞に送達する方法を説明します。

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

Macromolecular delivery strategies typically utilize the endocytic pathway as a route of cellular entry. However, endosomal entrapment severely limits the ...

本実験の全体的な目的は、細胞を損傷させることなく非常に効率的に浸透できる試薬である、二量体蛍光tatまたはdf tatを用いて、生細胞内に高分子を導入することです。これは、まず送達剤を生成・精製し、次にDftaを用いることで達成されます。Dftaを目的の高分子カーゴと共に、37 °Cで1時間細胞とインキュベートします。df tatは、エンドサイトーシス小胞内へのカーゴの取り込みを誘導します。小胞は初期エンドソームへと成熟し、最終的に後期エンドソーム段階に達すると、DF tatは細胞の細胞質空間にカーゴを放出させることができます。次に、dettaおよび目的のカーゴのデリバリー効率を評価するため、蛍光顕微鏡を用いて細胞をイメージングします。結果から、DF TTは高い効率で細胞内に浸入でき、観察可能な細胞毒性はないことが示されました。蛍光顕微鏡での観察により、DF tatが異なるサイズの高分子を細胞の細胞質空間に輸送できることが確認されました。既存の固体輸送法に対する本手法の主な利点は、細胞生理に観察可能な悪影響を与えることなく、高い輸送効率を実現している点にあります。さらに、単純な共インキュベーション工程のみで済むため、使用が容易です。まず、FTA合成を開始するために、Rアミド、MBHA樹脂、およびジメチルホルムアミド（DMF）500 mgを標準的な50 mLのSPPS容器に入れ、1時間膨潤させます。反応液に気泡が生じる程度の窒素ガスを流しながら、室温で反応を行います。テキストプロトコルに記載されている各FM保護アミノ酸を1.2 mmolずつ使用し、RinkアミドMBHA樹脂上でFTAを合成します。各アミノ酸のカップリング反応において、HBTU 0.44 gとDMFに溶解したDIEA 0.51 mLを添加します。各アミノ酸のカップリング反応を4時間行い、4時間のカップリング後、次の工程に進みます。樹脂をDMFで洗浄し、テキストプロトコルに記載されている通りにFD保護ステップを行う。FTAの線状ペプチド鎖が合成されるまでこれを繰り返す。次に、1%トリフルオロ酢酸（TFA）および2%トリイソプロピルシラン（TIS）を含むDCM溶液20 millilitersを用いて樹脂を5分間インキュベートし、MTT保護基を切り離す。MTT保護基の除去により黄色に呈色するため、樹脂をDCMおよびDMFで洗浄しながら、黄色が見られなくなるまでこの操作を繰り返します。さらに、1%TFA/DCM溶液を樹脂に加え、MTTが除去されず溶液が透明なままであることを確認します。次に、T-M-R-H-B-T-UとDIEAをDMFに溶解させ、この混合液を樹脂に加えます。乾燥窒素を用いて、fm保護およびアミノ酸接合後の撹拌を行い、一晩反応させます。樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させてから、樹脂からペプチドを完全に切り出します。92.5% TFA、2.5% 水、2.5% TIS、および 2.5% エタンジチオールを含む溶液をペプチジル樹脂に加え、室温で3時間静置して、完全な脱保護および樹脂からの切り出しを行います。調製した溶液を40 milliliters のエチルエーテル中に注ぎ、冷無水エチルエーテルを用いて粗ペプチド生成物を沈殿させます。これを4 °C、4,000 Gで20〜25分間遠心分離します。この手順を繰り返し、冷たい無水エチルエーテルで沈殿物を洗浄します。沈殿物を水に懸濁させて凍結乾燥し、得られた生成物を0.1% TFA水溶液に再懸濁します。分析用C 18カラムを用いて高速液体クロマトグラフィー（HPLC）分析を行います。各ペプチドを分析するには、流速 1 mL/min、検出波長 214 nm および 550 nm で行います。次に、ペプチド精製のため、C 18 カラムを用いてセミプレパラティブ HPLC を実施します。すべてのランにおいて、流速 4 mL/min、検出波長 214 nm および 550 nm で行います。酸化反応を行う前に、リニアグラジエントを使用してください。製造元のプロトコルに従い、MALDIを用いてペプチドの正しさを確認してください。FTAをエアレーションしたリン酸緩衝生理食塩水に溶解します。pHが7.0から7.5の間にあることを確認してください。ペプチド添加後、反応が完結するまで一晩反応させます。逆相HPLCを用いて生成物を精製し、前述と同様に質量分析で解析します。精製したDF tatを凍結乾燥させ、200 µLの水に再懸濁して濃度を測定します。まず、精製したDF tatの分注量を149 µLの50 mM TCEP溶液で再懸濁し、サンプルを約20分間反応させます。このステップでは、TMR fluor 4とDF tatが近接しているために起こる吸光度消光を排除するため、DF tatをモノマー形態のF tatに還元します。すべての溶液を石英製キュベットに加え、556 nmにおける吸光度を測定します。Beer-Lambertの法則を用いて、溶液の濃度を決定します。これがftaの濃度に相当します。FTAの濃度を2で割り、dftaの濃度を算出します。37 °C、5% CO2含有の加湿雰囲気下で、細胞を適切な培地を用いてコンフルエンシーが80〜90%になるまで培養し、200 µLのPBSで3回、次にNRL 15で1回、細胞を洗浄します。カーゴ（enhanced green fluorescent proteinなど）を含む、あるいは含まない5 µMのdf tatとともに細胞をインキュベートし、37 °Cで1時間保持して、インキュベーション後のエンドソーム漏出を誘導します。細胞の細胞膜に結合したDF tatを除去するため、L 15培地中のヘパリンで細胞を3回洗浄します。最終ステップとして、赤色蛍光タンパク質またはRFPフィルターを用いて蛍光顕微鏡で細胞を撮影し、DF tatを可視化することで、F TATとD fttの差を評価します。HeLa細胞を各ペプチドとともにインキュベートし、それらの細胞内局在の違いを判定します。ここに示されているように、FTAは点状に分布しています。この分布は、ペプチドがエンドソーム内部に捕捉されたままであることと一致しています。対照的に、dftaの蛍光シグナルは、細胞質および核全体に均一に分布しています。DF tatの細胞質内分布を、複数の異なる細胞株で観察します。20倍の画像では、ディッシュ内の非常に高い割合の細胞において、細胞毒性がない状態でDF tatの細胞質分布が示されています。これは、cyt blueによる核染色で確認されます。これにより、dfta介在性のエンドソーム漏出によって大きなタンパク質が細胞の細胞質へ輸送されるか否かを判定します。正しく折りたたまれたタンパク質の輸送を検出するために、EGFPが使用されました。EGFPは、細胞の90%以上でDF tatに見られるのと同様に、細胞質および核に緑色蛍光分布を示し、観察可能な毒性は認められませんでした。この手順を行う際は、細胞を過剰にコンフルエントにしないことが重要です。さらに、df tapを添加する前に、細胞を十分に洗浄してFPSを除去してください。

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学ぶエンドソーム溶解試薬dfTATを用いた生細胞へのタンパク質・ペプチド・細胞不浸透性小分子の送達法。蛍光顕微鏡で効率を評価し、細胞傷害なしに高効率な細胞内導入を実現する。

エンドソーム溶解試薬dfTATとのインキュベーションによって生細胞へのタンパク質、ペプチドまたは細胞不浸透性小分子の送達

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