新生児母子分離のマウスモデルにおけるPerigenital感度と前立腺肥満細胞の活性化の評価

次の実験の全体的な目標は、新生児の母体分離を受けたオスのC 57黒色6匹マウスの前立腺内の生殖器周囲の機械的感受性と肥満細胞の活性化を測定することにより、泌尿生殖器系に対する幼少期のストレスの影響を判断することです。これは、最初にC 57ブラック6マウスの子犬に新生児の母体分離を行い、20日間連続して幼少期のストレスを誘発することによって達成されます。2番目のステップは、一連のフォンフレモノフィラメントを生殖器周囲領域に適用することにより、生殖器周囲の機械的感度を測定することです。

次に、酸性化トルイジンブルー染色をマウス前立腺のクライオスタット切片で行います。肥満細胞の活性化を定量化するため。結果は、新生児の母体分離が生殖器周囲の機械的感受性と人工マスト細胞の活性化を増加させることを示しています 私たちの行動および組織学的分析に基づいて。

この手法の主な利点は、実験的自己免疫性前立腺炎などの既存の方法よりも優れているため、発症初期にストレス曝露が組み込まれており、慢性前立腺炎の患者で観察されるのと同様に、後年の症状を引き起こします。この方法は、幼少期のストレスが行動に与える影響など、慢性骨盤痛領域における重要な質問に答えるのに役立ち、痛みの状態の変化の組織学的証拠を提供します。この方法は慢性前立腺炎への洞察を提供することができますが、間質性膀胱炎、痛みを伴う膀胱症候群、外陰痛、線維筋痛症、片頭痛などの他の機能性疼痛症候群にも適用できます。

それは、不安やうつ病などの他の一般的な心理的併存疾患にも適用できます 出生の翌日、ホームケージからダムを取り外し、きれいな二次容器に入れます。清潔な手袋をはめた手で一握りの寝具をこすり、ホームケージの香りを維持してから、ホームケージの寝具の深さを1〜2センチメートルの清潔で適切にラベル付けされた2リットルのガラススピーカーに移します。さらに、ホームケージに存在する追加の濃縮寝具材料の約半分で、ネストレットやクリンクルペーパーなど、次にガラススピーカーに個別に、1つの同腹仔からのすべての子犬を準備したビーカーに入れ、すぐにビーカーを摂氏33度、湿度50%に180分間置きます。

分離された孵化期間中に、ダムを二次コンテナから取り外し、彼女をホームケージに戻します。ホームケージをビバリウム内の適切なハウジング位置に戻します。分離期間の終わりに、ホームケージを回収してダムを取り外し、彼女をきれいな二次容器に入れます。

次に、インキュベーターからビーカーを取り外し、清潔な手袋をはめた手の間に一握りの寝具を落とし、子犬を扱いながらホームケージの香りを維持します。子犬をビーカーからホームケージに個別にそっと移動させ、ビーカーに残っているエンリッチメントと寝具をホームケージに戻します。すべての子犬が戻されたら、ダムを二次コンテナからホームケージに移動し、ビバリウム内の適切な住居の場所に戻します。

新生児の母体分離を受ける各同腹仔について、出生後21日目まで毎日この手順全体を繰り返します。次に、子犬を離乳させ、実験期間中、対照マウスと同じ条件で飼育します。高さ55センチメートルの高架金網トップテーブルの下に吸収性アンダーパッドを配置して、試験エリアを準備します。

テーブルは、研究者がマウスを驚かせることなく下側から近づくことができるように、十分なスペースを提供する必要があります。最大12匹の8週齢のマウスを、金網テーブルの上部にある透明な穴あきプラスチックチャンバーの下に個別に配置します。マウスが逃げるのを防ぐために、チャンバーの上部に重いものを置きます。

3点22グラムのフォンフレームモノフィラメントのベースを持ち、引っ込められたモノフィラメントを露出させます。モノフィラメントが垂直に向くようにプローブを配置します。マウスが警戒しているとき、動かず、その体重は後足の間に均等に分散されます。

陰嚢の左側または右側に塗布し、フィラメントにわずかな曲がりが観察されるまで正中線を避けます。モノフィラメントを10秒間、または動物が活発なジャーク、ジャンプ、舐め、モノフィラメントに向けた噛む行動などの肯定的な反応を示すまで、モノフィラメントを所定の位置に保持します。マウスが動かず、10秒間のモノフィラメント適用中に肯定的な反応を示さない場合は、同じサイズのフィラメントを使用するすべてのマウスで陰性反応テストを記録し、次に適切なモノフィラメントに切り替えます。

必要に応じて、次に大きいモノフィラメントまたは小さいモノフィラメントを使用して各マウスのテストを続けます。最初の肯定的な反応が観察された後、解剖し、次にクライオ切片、9週齢マウスの前立腺組織を7ミクロンの厚さのクライオ切片に固定します。次に、100ミリリットルの70%エタノールに1グラムのトルイジンブルーOを加えて1%トルイジンブルーストック溶液を調製し、混合物を溶液になるまでボルテックスします。

ストック溶液を室温で最大3週間保存します。別のビーカーで、攪拌板の上に置いた100ミリリットルの水に1グラムの塩化ナトリウムを加えます。12モルの塩酸を使用して、pH範囲が0.5〜1.0になるまで塩溶液のpHを調整します。

次に、8ミリリットルのウディネブルーストック溶液と32ミリリットルの酸性1%塩化ナトリウム溶液を組み合わせて、0.25%酸性のトインブルーワーキング溶液を準備します。オディーンブルーストック溶液が完全に組み込まれるように上下にパイプでつなぎ、渦を使用して、スライドの各バッチに新鮮な作業溶液を準備します。組織切片を、組織を完全に沈めるのに十分な量のPBSを含む50ミリリットルの円錐管に約1秒間スライドを個別に浸すことにより、組織切片を洗浄します。

スライドをペーパータオルで風乾させます。次に、0.25%トルイジンブルーの作業溶液が十分に含まれているガラス製のスタンディングジャーにスライドして、組織切片が完全に水没することを確認します。スライドを15 RPMに設定されたプラットフォームロッカーで10〜15分間インキュベー

次に、スライドをPBSに約1秒間浸して、余分な背の高いウディーンブルーを洗い流し、スライドをスライドボックスに入れてスライドが横になるようにします。排水を可能にするため。スライドを37°Cのオーブンで最低2時間、または室温で一晩乾燥させます。

乾いたら、スライドを95%エタノールに約1秒間浸し、切片を完全に乾かします。組織が紫色よりも青く乾くまで、この手順を1〜10回繰り返します。次に、スライドを100%エタノールに約1秒間浸し、切片を完全に乾かします。

この手順を1〜10回繰り返して、組織が濃い青から中程度の青になり、紫色にはなりません。最後に、スライドを100%キシレンで3分間インキュベートして染色を固定します。スライドを乾燥させてから覆い、グリセロールPPSまたはキシレンベースの永久封入剤を滑り

余分なメディアを排出し、完成したスライドを室温で保管します。8週齢の新生児の母体分離であるフォンフレームモノフィラメントの段階的なシリーズでテストしたところ、マウスはナイーブなマウスと比較して、生殖器周囲の機械的アロディニアを示しました。これは、肯定的な行動反応を誘発した機械的離脱閾値の大幅な減少として証明されています。

慢性前立腺炎の追加の証拠を見ることができます 慢性骨盤痛症候群 組織学的に示されているのは、マスト細胞内に収容されたトリプターゼ顆粒を観察するために酸性化されたoトルイジンブルーで染色された前立腺組織のクライオスタット切片です。新生児分離マウスの前立腺切片では、脱顆粒性肥満細胞の有意な高い割合が観察されました。ナイーブマウスと比較した場合 新生児の母体分離を行う際には、母親による子犬の拒絶を避けるために、ホームケージの香りを維持することを覚えておくことが重要です。

オープンフィールドテストや2つの選択式リキッドプリファレンスなどの他の方法を使用して、併存する気分障害の行動証拠を評価できます。このビデオを見た後、新生児の母体分離後の慢性前立腺炎とマウスの行動的および組織学的証拠として、生殖器周囲の機械的感受性と前立腺肥満細胞の活性化を評価する方法を十分に理解しているはずです。