前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

この原稿は、循環腫瘍細胞(CTC)から前立腺癌患者由来異種移植片(PDX)を生成するために使用される方法を詳述しています。CTCからのPDXモデルの生成は、前立腺がんを研究するための代替実験モデルを提供します。最も一般的に診断される腫瘍であり、男性の癌による死亡原因として多い。

次のプロトコルの全体的な目標は、前立腺癌を生成することです。患者は循環腫瘍細胞から異種移植を導き出しました。これは、最初に進行性前立腺がんの患者から末梢血を採取することによって達成されます。

第2のステップとして、血液単核細胞コンパートメントが単離され、これには循環腫瘍細胞が含まれています。次に、単核細胞をCD45ZI抗体で染色し、フローサイトメトリーを用いて循環腫瘍細胞を選択するために、次いで、細胞を免疫不全マウスに注入する。結果は、前立腺癌患者の末梢血からフローサイトメトリーによって単離された循環腫瘍細胞の注射に基づく前立腺癌異種移植片の生成を示しています。

この方法は、前立腺がんの分子特性評価と新しいバイオマーカーの開発に使用できる新しい実験モデルを生成することにより、前立腺がん分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。手順を実証するのは、研究所の学生であるウィリアムズと、ここマウントサイナイの腫瘍学部の研究者であるオマダが、転移性前立腺がんの選択された患者から全血を採取し始めます。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、全血をハンクのバランス塩溶液とともに50ミリリットルのポリスチレンコニカルチューブに移します。

1対1の比率で、混合物を静かにピペットで動かして均質化します。次に、空の50ミリリットルのポリスチレンコニカルチューブに15ミリリットルのFIコールパック溶液を追加します。希釈した全血20ミリリットルを、溶液の上の最低設定を使用して、明確な最上層を形成するために静かにピペットで移します。

次に、チューブを400Gで30分間遠心分離します。室温では、遠心分離機の減速を最低設定にして、分離後の溶液の混合を防ぎます。遠心分離後、血漿最上層と分離溶液の間に挟まれた末梢血単核細胞と循環腫瘍細胞の細い白い灰色の縞模様を特定します。

チューブの底で、白い灰色のストライプから細胞を慎重に収集し、それらを50ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。プラスチック製のトランスファーピペットを使用して、ハンクのピペットを追加します。単離された細胞に塩溶液をバランスを取り、総容量10ミリリットルにします。

混合物を再び400Gで室温で10分間遠心分離します。細胞を洗浄するためには、上清を取り除き、この洗浄を繰り返します。もう一度一歩踏み出します。

2回目の洗浄後、上清を捨てます。残りのペレットを5ミリリットルの赤血球溶解緩衝液に懸濁し、溶液を室温で5分間インキュベートします。次に、サンプルを室温で400 Gsで3分間遠心分離し、上清を廃棄して溶解バッファーを除去します。

最後に、染色前に10%ウシ胎児血清を添加したPBS1ミリリットルにペレットを再懸濁します。ヘモ、サイトメーター、または自動セルカウンターで標準的なトライアンブルー排除法を使用して、生細胞の数を定量化します。次に、細胞をPBSで10%FBSで1ミリリットルあたり100万細胞に希釈し、氷上に1時間置きます。

非特異的結合をブロックするには、細胞懸濁液を2つの別々のチューブに分配します。コントロールチューブ内のコントロールセル用のチューブとCD 45染色細胞用のチューブを1つラベルします。IgGを1〜250の希釈で1つのKappa Ziを1ミリリットルあたり10ナノグラムの最終濃度まで追加します。

CD 45染色チューブ内。CD 45 ZI標識一次抗体を同濃度の10ナノグラム/ミリリットルで添加し、細胞懸濁液を氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞を400Gで摂氏4度で3分間遠心分離し、スナットを廃棄します。

各ペレットを10%FBSを添加した滅菌PBSに懸濁し、続いて400Gで摂氏4度で3分間遠心分離することにより、細胞を2回洗浄します。resusを洗浄した後、1ミリリットルあたり10マイクログラムのダッピーステインを含むPBSの1ミリリットル溶液に細胞を懸濁します。35マイクロメートルのストレーナキャップを介して最終溶液を12ミリメートル×75ミリメートルのポリスチレンチューブにろ過し、細胞の塊や破片を排除します。

次いで、CD45陽性細胞および死細胞を蛍光活性化細胞ソーティングを用いて懸濁液から除外し、添付のテキストプロトコルに記載されているようにそれらを除去する。選別した前立腺腫瘍細胞懸濁液を細胞外マトリックスタンパク質と1対1の比率で混合し、混合物を氷の上に置きます。次に、施設のガイドラインに従って、8〜10週齢の男性の免疫不全の口に麻酔をかけます 1分間の酸素1リットルに5%吸入イソフッ素を使用します。

マウスの角膜とつま先の反射の喪失をチェックして、適切な麻酔を確保します。250ゲージの針と1ミリリットルの注射器を使用して、細胞懸濁液の250マイクロリットルを引き出します。次いで、皮下結節性密度の成長のためにマウス注射部位の触診を毎週実施することにより、細胞外マトリックス細胞懸濁液の全容積をマウスモニター腫瘍の両上腹部に皮下

このプロトコールで使用されるネガティブセレクション法に基づいて、DAPI染色を使用して死細胞を除外する必要があります。ここに示すように、残りの生存細胞からのCD45陰性細胞の割合は可変であり、患者の腫瘍量に依存するが、CD45陽性細胞から容易に分離される。適切なゲーティングを使用すると、前立腺腫瘍細胞懸濁液の移植後、マウスの両側に皮下結節密度が見えるようになります。

各結節密度は異種移植片の成長を表しており、マウスの背側筋組織から突き出ており、テクスチャーが硬いため、健康な組織とは異なるものとして評価できます。循環腫瘍細胞から生成された患者由来の異種移植モデルは、ヘマット、トインおよびエオシン染色によって見られるようにヒト前立腺腫瘍を再現し、アンドロゲン受容体および前立腺特異的膜抗原などの前立腺特異的細胞マーカーに対する免疫組織化学によって異種移植片を生成した後。遺伝子発現プロファイリングやタンパク質発現プロファイリングなどの他のプロトコルは、前立腺がんの侵攻性に寄与する細胞および分子メカニズムを調査するために行うことができます。