Name: エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: 学ぶエバンスブルー色素を用いたゼブラフィッシュ幼生の骨格筋膜整合性評価法。筋ジストロフィー疾患モデルの解析と治療薬開発への応用を支援する技術です。

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私たちは彼の技術支援のためのトレントウォーに感謝したいです。また、病気の子供や、このプロジェクトのために惜しみない資金調達のための治療先天性筋ジストロフィー（CMD）のための病院の小児科を認めます。

寒天注入プレートの調製（時間：45分） <ol><li> E3培地で2％〜3％のアガロースを煮て、その溶液をベンチにわずかに冷却します。注：準備されている注射板の数は、必要なアガロースの量を決定します。各注入プレートは、アガロース溶液の約35ミリリットルが必要です。 </li><li>煮沸後に、所望の温度に到達するまで、アガロースが冷却する（ 例えば 、45°C）射出成形金型の製造者の指示に従って。 </li><li> 100ミリメートル皿にアガロース冷却の約35ミリリットルを注ぎます。 </li><li>溶液中に好適な射出成形金型の一方の端を置き、その後、（これは気泡の発生を減らすのに役立ちます）アガロース溶液に金型の残りの部分を置きます。 </li><li>アガロース溶液を約30分間、室温または4℃のいずれかで固化することを許可します。 </li><li>固体アガロースから金型の一方の端部を分離するために、スパチュラを使用します。ゆっくりメートルの残りの部分を削除<html>古い。 </li></ol>エバンスブルー色素（EBD）注射ミックスの調製（時間：30分） <ol><li> 1Xリンゲル液中EBDの1％の株式を行います（; 5のKCl、155 mMの塩化ナトリウムを2 mMの塩化カルシウム、1mMのMgCl 2、2 mMのの Na 2 HPO 4、10mMのHEPES、10mMのグルコース、7.2のpH）、これは室温で保存することができます。 </li><li> -20℃で1×リンゲル液およびストアに25 mg / mlの時MW万キロダルトン-デキストランフルオレセインイソチオシアネート（FITC）の原液を作ります</li><li> （ すなわち 、100μlの最終作業容量のために：FITCデキストラン株式の90μlの1％EBD10μlのミックス）FITC-デキストラン株式の原液で直接0.1％にEBDを希釈することにより、注射ミックスを調製します。 </li><li>徹底的にボルテックス注射ミックス（それがグリーンに点灯します）とアルミ箔で注入ミックスチューブをラップすることによって、直接光のうちに保ちます。 </li></ol> 3. EBD注入準備（時間：約30分） ENT &quot;&gt;注：プロトコルは3-7日後に受精（DPF）から幼虫に最適です。 <ol><li> RTへの事前暖かい注入プレート。 </li><li>金属板にマイクロマニピュレーターを配置することにより、射出装置を設定し、注入のために使用されている顕微鏡の隣に立っています。空気駆動マイクロインジェクションコントローラーの電源をオンにします。注：優先噴射システムは、ラボによって変化し、分析の結果を変更しないでください。 </li><li>バックEBDミックスの約2〜4μlの注射針を埋めます。 </li><li> EBDミックスの約5 NLに注入量を調整します。注：注入量の校正が校正方法に依存するであろう。ガス圧力がインジェクタマイクロメータを使用してボリュームを介して較正されたボーラス注入量を必要とするのに対し、ピストン駆動注射、直接指定された噴射量に設定することができます。 </li><li> 1Xリンゲル液で濡れ注入プレート、ウェルから過剰を取り除きます。 </li><li> 0.04％の3-アミノ安息香酸エチルメタンサルによる前治療の幼虫噴射の開始に先立って、幼虫を固定する1Xリンゲル液中に希釈トン（トリカイン）。注意：適切な注入が任意の残留運動では困難であるとして、幼虫が完全に動けないです確保することが重要です。 </li><li>ガラスピペットを用いて寒天注入プレートのウェルに麻酔幼虫を置きます。幼虫が完全にウェル内とその側に横たわっていることを確認してください。注：ウェル当たり幼虫数は実験者に任されています。 </li><li>幼虫をウェルに入れられた後、ウェル内の幼虫の動きを最小限に抑えるために、過剰なリンガー溶液を除去します。幼虫は脱水しないように、溶液の残量を残します。 </li></ol> EBDとゼブラフィッシュ幼虫の4心膜注射（時間：幼虫注入の数に依存し、推定1-3時間） <ol><li>注射が行われる解剖スコープの幼虫を含む注入プレートを置きます。 </li><li>含む注入ピペットの針を置きEBDは、ゼブラフィッシュの幼虫の上に混ぜます。 </li><li>位置を再注射針は、幼虫の心の近くにあり、約45°の腹側に前後軸からので、それを回転させることによって注入プレート。 </li><li>静脈が最初に背側方向に旋回している卵黄（ 図1）の前部に静脈の領域に共通の主静脈（CCV）に注射針を挿入します。注意：最大40倍までの倍率がはっきりCCVを参照することが有用であり得ます。 </li><li> EBDミックスの5 NLを注入し、EBDミックスの即時漏れを最小限にするために5-8秒の位置に注射針を保ちます。注：良い注入が心室（ 図1）で見られる色素の着色を持つことになります。 EBDミックスを中心に観察されない場合には、EBDミックスさらに5 NLを注入し、色素の取り込みを誘導するのに十分であり得ます。あるいは、胚を廃棄することができます。 注意：いくつかの状況では、心臓が鼓動を停止することがあります。このOの場合ccurs、20〜40秒間の幼虫を監視し続けます。色素が循環系を通って移動するように一般的に、心臓は鼓動を再開します。 </li><li>次の幼虫と繰り返しに移動します。 </li><li> （ 図2）注射直後に血管系におけるFITC-デキストランの存在を観察することによって成功した注入された胚を特定します。 </li></ol> 5.インキュベーションおよびEBD取り込み（時間：4-6時間） <ol><li>幼虫の所望の数が注入された後、戻り値は、100mm皿にトリカインなし1Xリンゲル液に幼虫を注射しました。 </li><li>アルミホイルで包んで料理をしてください。注：キーピングが著しく生存率が増加し、信号強度の最大の一貫性を確実に暗所で幼虫を注射しました。アルミ箔でラッピングは幼虫がインキュベーターの外にある一定の期間のために特に重要です。 </li><li>幼虫は十分EBD取り込みを確実にするために4-6時間28.5℃でインキュベートすることを許可します。 </li></オール&gt; 筋肉内EBD 6.可視化（時間：幼虫注入顕微鏡の種類の数に応じて、推定0.5〜3時間） <ol><li>画像化の前に、移動を防止するために、0.04％のトリカインで幼虫を麻酔。 </li><li> EBDの取り込みが骨格筋（ 図3）で発生しているかどうかを判断するために赤色蛍光の下にあるViewの幼虫。 </li></ol>

<ol><li>Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+Duchenne+muscular+dystrophy+%28DMD%29+for+the+pediatricians+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Pediatr+%28Phila%22%5BJournal%5D)">Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community.</a> Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).</li>
<li>Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swimming+into+prominence%3A+the+zebrafish+as+a+valuable+tool+for+studying+human+myopathies+and+muscular+dystrophies%29%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies).</a> FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).</li>
<li>Lancet, , 381-845 (2013).</li>
<li>Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dystrophin+glycoprotein+complex%3A+signaling+strength+and+integrity+for+the+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma.</a> Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).</li>
<li>Campbell, K. P., Kahl, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+dystrophin+and+an+integral+membrane+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein.</a> Nature. 338, 259-262 (1989).</li>
<li>Cohn, R. D., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of muscular dystrophies.</a> Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).</li>
<li>Yoshida, M., Ozawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycoprotein+complex+anchoring+dystrophin+to+sarcolemma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma.</a> J Biochem. 108, 748-752 (1990).</li>
<li>Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+muscular+dystrophy+show+different+patterns+of+sarcolemmal+disruption%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption.</a> J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).</li>
<li>Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+dystrophic+muscle+fibers+in+mdx+mouse+by+vital+staining+with+Evans+blue%3A+evidence+of+apoptosis+in+dystrophin-deficient+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle.</a> J Biochem. 118, 959-964 (1995).</li>
<li>Bassett, D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+zebrafish+model+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Pharmacol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy.</a> Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+dag1+mutant%3A+a+novel+genetic+model+for+dystroglycanopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies.</a> Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).</li>
<li>Kawahara, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+muscle+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Modeling human muscle disease in zebrafish.</a> Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).</li>
<li>Cavanna, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+genetic+mapping+of+the+mouse+mdx+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus.</a> Genomics. 3, 337-341 (1988).</li>
<li>Bassett, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130, 5851-5860 (2003).</li>
<li>Horstick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stac3+is+a+component+of+the+excitation-contraction+coupling+machinery+and+mutated+in+Native+American+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy.</a> Nat Commun. 4, (1952).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+deletion+of+lysine+7+expands+the+clinical%2C+histopathological+and+genetic+spectrum+of+TPM2-related+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies.</a> Brain. 136, 508-521 (2013).</li>
<li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neb%3A+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135, 1115-1127 (2012).</li>
<li>Detrich, H. W., Westerfield 3rd,, M,, Zon, L. I. Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).</li>
<li>Whitfield, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+development+of+the+zebrafish+inner+ear+and+lateral%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral.</a> , 123-241 (1996).</li>
<li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).</li>
<li>Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+Scn1a+zebrafish+mutant+identifies+clemizole+as+a+potential+Dravet+syndrome+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment.</a> Nat Commun. 4, (2013).</li>
<li>Waugh, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoxetine+prevents+dystrophic+changes+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 Forthcoming.</li>
<li>Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryonic+and+larval+zebrafish+skeletal+myofibers+from+dissociated+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations.</a> J Vis Exp. 50259, (2013).</li>
<li>Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+skeletal+muscle+defects+in+larval+zebrafish+by+birefringence+and+touch-evoke+escape+response+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays.</a> J Vis Exp. 50925, (2013).</li>
<li>Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evans+Blue+Dye+as+an+in+vivo.+marker+of+myofibre+damage%3A+optimising+parameters+for+detecting+initial+myofibre+membrane+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability.</a> J Anat. 200, 69-79 (2002).</li>
<li>Guyon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+isolation+and+characterization+of+a+splicing+mutant+of+zebrafish+dystrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin.</a> Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).</li>
<li>Santoriello, C., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hooked%21+Modeling+human+disease+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Hooked! Modeling human disease in zebrafish.</a> J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).</li>
<li>Majczenko, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Mutation+of+CCDC78+in+a+Unique+Congenital+Myopathy+with+Prominent+Internal+Nuclei+and+Atypical+Cores%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum%22%5BJournal%5D)">Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores.</a> Am J Hum. , (2012).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Evans+blue+dye+to+compare+limb+muscles+in+exercised+young+and+old+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice.</a> Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).</li>
<li>Hall, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+alpha2-deficient+congenital+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).</li>
</ol>

著者は全く競合する金融利害や関心のある他の競合を持っていません。

ゼブラフィッシュは、神経筋疾患2,29の研究のための強力なツールとして浮上しています。現在までに、ゼブラフィッシュ系は、新たな筋疾患を引き起こす突然変異16,17,30を検証する新規な発症機序を解明18、及び潜在的に新しい治療薬12,24を識別するために使用されています。これらの集団的努力は、人間の神経筋疾患をモデル化するためにゼブラフィッシュの有用性を確立しています。しかし、ゼブラフィッシュおよび哺乳動物モデルで作られた進歩にもかかわらず、神経筋条件の広いスペクトル内の患者のための限られた治療の選択肢があります。そのため、高い需要が壊滅的な疾患のこのグループの治療法の開発のために存在します。治療のためのこの要求を並列接続すると、新しい動物モデルおよび推定治療戦略を検証するための継続的な実験技術革新だけでなく、厳密な分析のための対応が必要です。 EBDの分析は、一般的にマウスモデルで使用されています組織や脳、心臓、骨格筋27,31における細胞損傷を研究。最も顕著なのは、EBDは、筋膜の不安定性の深刻度を示し、8を損傷するために様々な筋ジストロフィーのサブタイプのマウスモデルにおいて広く使用されています。筋膜損傷を明らかにするEBDの使用は、ヒトの疾患状態9に動物モデルの類似性を確立支援するパラメータです。マウスではEBDの電力は、開発し、神経筋疾患のゼブラフィッシュのモデルにEBDを適用するために、私たち自身を含むいくつかの研究室が、リードしてきました。原因EBD分析の適用に、この技術は積極的にヒトの疾患状態11,15,22,24,32にゼブラフィッシュモデルを裏付けるために実施されています。損傷した筋肉の膜との幼虫は、筋線維内EBD取り込み、したがって、赤色の蛍光を持つことになります。蛍光は、繊維間の空間内に観察されたが、個々の筋線維内でTにおける基底膜から脱着繊維の有益かもしれません膜損傷の彼が不在、有用な診断の詳細を提供します。 EBD分析は、動物モデルの検証を超えた潜在的な用途を有しています。私たちの研究室からの努力は、最近EBD分析は、潜在的に新規の治療薬24を検証するのに有益であることを実証しました。潜在的な治療処置が軽減または関連する治療作用8を意味することができます神経筋疾患モデルにおけるEBD取り込みを廃止するかどうかの確認。このタイプの分析は、治療薬の機構（単数または複数）を確立する助けとEBD解析の適用を拡大することができます。 多くの技術と同様に、EBD解析は、実験計画と実践の間に観察するには、いくつかの注意点を持っています。例えば、それは、経年組織の肥厚にCCVを識別するために挑戦することができます。加えて、実験的な数を減少させ、幼虫の多数プリパレーションする必要性を増大させる、心膜注入前との間に調製物中の幼虫を損傷することは容易です。損傷した筋肉はEBDを取ることができますようにまた、取り扱いおよび注入中の幼虫に行っ物理的な損傷は、偽陽性になる可能性があります。これらの障害のいくつかを克服するために、我々は、注入の前、その後の分析に成功した直後に、色素注入と幼虫の簡単かつ信頼性のある同定を可能にするこのビデオ資料に共射出戦略を記載しています。前の筋線維によるその取り込みを血管系内のEBDの確認を可能にすることによって成功した注射用の共射出コントロールFITCデキストラン。筋線維に回収されていない場合EBD蛍光は、数時間後に幼虫に非常にびまん性になるように、これは特に有用である可能性があります。このように、検出するのが困難であることができます。また、CCVが欠落し、卵黄または体腔にEBDを注入して、インキュベーション後、胚を制御するために同様の拡散赤色蛍光で、まだ損傷した筋線維による取り込み可能性の減少をもたらすことができます。まとめると、これらの洞窟ATSはEBD注入が一貫して信頼性の高い結果を得るためには忍耐と練習が必要示唆しています。 すべてでは、我々は、ゼブラフィッシュの幼虫にEBD分析を実行するための実用的かつ簡単な方法を説明します。現在までに、モデル系としてゼブラフィッシュの使用は、特にヒト疾患モデルとして、急速に拡大しています。この拡張は、ゼブラフィッシュシステムの現在の利点を改良実験技術の継続的な開発と変更に部分的に起因しています。 EBD注入技術は、ゼブラフィッシュ筋疾患モデルの検証と研究のための研究者の兵器庫に追加し、強力なツールを提供します。この技術の継続的な実施と修正は、新規治療戦略だけでなく、疾患を引き起こすメカニズムを解明するのに役立つ可能性を秘めています。

筋ジストロフィーは、特定の組織病理学的特徴1,2を持つ、一般的で不均一なヒトの筋肉疾患のグループを構成しています。 この壊滅的な疾患のグループに関連する症状には、筋力低下、筋変性、運動性の喪失、早期死亡などがある1,3。 筋ジストロフィーの主な病態メカニズムは、筋連球を安定化させるタンパク質の喪失、膜貫通複合体のアンカー、および膜を横切る細胞シグナル伝達を媒介するタンパク質の喪失です4-6。 例えば、ジストロフィン-糖タンパク質複合体の主要な足場タンパク質であるタンパク質ジストロフィンが完全に失われると、デュシェンヌ型筋ジストロフィー7では筋膜が不安定化します。 ほとんどの筋ジストロフィーは、細胞外マトリックスとサルコレム細胞骨格との間のリンクに関与するタンパク質の突然変異に起因するという事実のために、細胞レベルでの一般的な観察はサクロレンマル完全性の喪失である8,9。 筋ジストロフィーに関連する主要な病態メカニズムのこの理解は、動物モデルシステム2,10-15を用いた長年の研究の産物です。 しかし、この分野の進歩にもかかわらず、ジストロフィーのサブタイプの範囲の治療または管理のための治療選択肢はまだ限られています。 この実行可能な治療法の限界は、いくつかの重要な要因によるものです:1)遺伝子治療戦略の難しさ、2)de-novo疾患症例の高頻度とそれに対応する翻訳可能な動物モデルの欠如、および3)明確で再現性のある結果測定による推定治療薬の生理学的結果をテストするための厳密な戦略の欠如。
>jove_content<これらの制限のいくつかを克服するために、私たち自身を含む多くの研究室が、ヒトの神経筋疾患をモデル化し研究するためのシステムとしてゼブラフィッシュを採用しています2。今日まで、ゼブラフィッシュは疾患研究において貴重なツールであることが証明されています。 ゼブラフィッシュモデルは、突然変異16,17を引き起こす新規のヒト疾患を特定し、検証し、特徴付けられていない疾患を引き起こすメカニズム17,18を解明し、新しい治療戦略12,19を特定するために使用されています。 これらの進歩は、部分的には、ゼブラフィッシュシステムの標準的な強み、例えば、その光学的明瞭さ、遺伝子操作の容易さ、大量に繁殖する能力などによってなされた20。 ゼブラフィッシュはさらに、新規治療薬の同定のための貴重な方法である大規模な薬物スクリーニング21に修正可能であることが証明されています22-24。 筋疾患の研究に関しては、これらの強みは、解離25を介して単一のゼブラフィッシュ骨格筋線維を分離する能力と、複屈折26と呼ばれる光学現象を使用して生体内で筋線維組織を調べる能力によって補完され、巨視的な筋肉の完全性を迅速に決定することを可能にする。 これらの利用可能なユーティリティに関係なく、調査を進めるためには、さらなるツール開発が継続的に必要とされています。
私たちや他の人々は、ゼブラフィッシュモデルでのEBD注入と分析のためのプロトコルを採用しました。 EBDは、損傷した細胞、変性細胞、またはアポトーシス細胞に取り込まれ、蛍光27で可視化される重要な細胞透過性色素です。 今日まで、EBD分析は、骨格筋および心臓疾患のマウスモデルにおける筋膜完全性を分析するために広く使用されてきた8,9,27。 しかし、哺乳類の調製物では、採取した筋肉は通常、分析前に面倒な切片化または解剖を必要とします。 ゼブラフィッシュでは、生きた動物と無傷の動物を用いて、大量に直接分析が可能です。 このビデオ記事では、ゼブラフィッシュジストロフィー変異株sapje15,28におけるEBD取り込みの代表的な画像とともに、生きたゼブラフィッシュの幼生にEBD注入と分析を行う方法論を示します。 さらに、EBD 調製物の定量化を高めることができる同時注入戦略を提示します。

<table><tbody><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート-デキストランMW 10,000</td>シ<td>グマ</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>エバンスブルーダイ</td><td>シグマ</td><td>E2129</td><td></td></tr>エ<tr><td>チル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩</td><td>シグマ</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>100ミリメートルシャーディッシュ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875712</td><td>インジェクションモールドベース</td></tr><tr><td>薄肉ガラスキャピラリー</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW100F-4</td><td>注射針</td></tr><tr><td>用 アガロース</td><td>バイオショップ</td><td>AGA001</td><td>射出成形金型</td></tr><tr><td>マイクロインジェクション金型</td><td>適応科学ツール</td><td>TU-1</td><td>射出成形金型</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>バイオショップ</td><td>SOD001</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>バイオショップ</td><td>POC888</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>シグマ</td><td>M2670</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性一水和物</td><td>シグマ</td><td>S9638</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H4034</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>バイオベーシック</td><td>GB0219</td><td>リンゲル液</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>シグマ</td><td>C1061</td><td>リンゲル液</td></tr></tbody></table>

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

ゼブラフィッシュモデルは、神経筋障害の研究のための新しいシステムです。 神経筋疾患の研究では、筋膜の完全性が重要な疾患決定要因です。 今日までに、多くの神経筋の状態が異常な膜の完全性を伴う変性筋線維を示しています。これは、筋ジストロフィーで最も一般的に観察されます。 Evans Blue Dye(EBD)は、変性、損傷、またはアポトーシス細胞に急速に取り込まれる重要な細胞透過性色素です。対照的に、それは無傷の膜を有する細胞によって取り込まれない。 EBD注射は、神経筋疾患のマウスモデルで筋肉の完全性を確認するために一般的に使用されます。 ただし、このようなEBD実験では、分析前に筋肉の解剖および/または切片化が必要です。 対照的に、ゼブラフィッシュのEBD摂取は、生きた無傷の調製物で可視化されます。 ここでは、生きたゼブラフィッシュでEBD注入と分析を行うためのシンプルでわかりやすい方法論を示します。 さらに、EBD分析の有効性を高めるための共注入戦略を実証します。 全体として、このビデオ記事では、神経筋疾患のゼブラフィッシュモデルでEBD注射と特性評価を行うための概要を説明します。

EBD注入ミックスは3 DPFでsapjeホモ接合変異体および野生型同胞のCCVに注入しました。 （ 図1B）は、心臓チャンバを充填注射は、次に緑色蛍光（ 図2）の下に血管系にFITCデキストランを可視化することによって成功した注射のために分析しました。 4時間のインキュベーション期間の後、EBD取り込みは蛍光顕微鏡を用いて体節のレベルで調べました。 sapjeホモ接合変異体は筋肉膜15（ 図3B）への損傷を示す、EBD取り込みを示した野生型の兄弟は、目に見える筋線維（ 図3A）内にはEBD蛍光を示さありませんでした。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig1.jpg" /> 図1.ジェクトEBD注入ミックスゼブラフィッシュエンブリーの総主静脈（CCV）へO。 （A）非注入胚。矢印は、CCV注入のための理想的な場所を示します。 （B）CCVに成功した注射。染料は、心腔（矢印）に入り、血管系を通って圧送され始めます。失敗したCCV注入は胚（矢印）の卵黄嚢に入る色素の一部または全てになります（C）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig2.jpg" /> 図2.胚は、直ちに注入前EBD取り込みに以下の血管系全体に緑色蛍光下のFITC-デキストランの分布を観察することによって成功した注射用ソートすることができます。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53183/53183fig3.jpg" /> 図3：EBDは、損傷した膜を有する繊維によって取り込まれる（A）野生型兄弟が筋線維にはEBD蛍光を示さありません。 （B）は、複数の筋線維（矢印）内EBD蛍光とSapje ​​ホモ接合変異体。すべての幼虫がEBD注入ミックスを注射し、3 DPFで4時間のインキュベーション期間後に分析しました。兄弟および変異体は、CCVの注入前に筋線維脱離することにより選別した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53183/53183fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

この研究では、ゼブラフィッシュの幼生に対してEvans Blue Dye(EBD)分析を行う簡単な方法について説明します。 この技術は、骨格筋の完全性の特性評価と筋ジストロフィーのゼブラフィッシュモデルの描写のための強力なツールであり、新しい治療法の開発に貴重な方法です。

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Evans Blue DyeおよびFitzy Dextrinを用いた共通心静脈注射の全体的な目的は、生存しているゼブラフィッシュの骨格筋膜の完全性を観察し、筋ジストロフィーの様々なサブタイプに関連する疾患誘発メカニズムの特性評価を支援することである。Evans Blue Dyeの注射は、筋ジストロフィーの動物モデルを特性評価する際に、疾患の病理に寄与する生物学的メカニズムの解明に役立ち、また、疾患治療のための潜在的な治療メカニズムの理解にも寄与することができる。この手法の主な利点は、生存しているゼブラフィッシュを用いて実施および分析が可能であることである。さらに、Fitz Dextrinを同時に注入することで、注入が成功したかどうかの品質管理が可能となり、厳密性と定量性が向上します。この手法の意義は、筋疾患のゼブラフィッシュモデルの妥当性確認における有用性にあります。また、筋ジストロフィーなどの特定の変異がどのように筋疾患の表現型につながるかという理解を深めることにもなり、これは治療法や治癒策を見出すために不可欠です。アガー注入プレートを調製するには、E3培地で2〜3%のアガーを沸騰させ、溶液をベンチ上でわずかに冷却させます。冷却したアガーを、100mmディッシュに約35mLずつ注ぎます。次に、好みの注入用モールドの一端を溶液に入れ、その後、モールドの残りの部分をアガー溶液の上に置きます。アガロ溶液を室温または4°Cで約30分間静置し、凝固させます。次に、スパチュラを用いてモールドの一端を固まったアガロから切り離し、ゆっくりと残りのモールドを取り除きます。1×リンガー液を用いて、1%のエヴァンズブルー染料（EBD）ストック溶液を作製します。次に、Fitz-Dextrinのストック溶液を1xリンガー液で調製し、-20 °Cで保存します。注入混合液を作成するには、Fitz-Dextrinストック溶液にEBDを直接加えて0.1%に希釈します。注入混合液を十分にボルテックスし、注入前にチューブをアルミホイルで包み、直射日光を避けて保管してください。注入プレートを室温まで予熱しておきます。マイクロマニピュレーターを金属プレート上に配置し、注入顕微鏡の横に設置します。エア駆動式マイクロインジェクションコントローラーの電源を入れます。次に、約2〜4 µLのEBDミックスを用いて、注入針をバックフィルします。次に、約5 nLのEBDミックスを用いて注入量を校正します。その後、1xリンガー溶液を使用して注入プレートを湿らせ、ウェルから余分な溶液を取り除きます。ガラスピペットで注入する前に、1xリンガー溶液で希釈した0.04%トリカインを用いて、幼魚を完全に不動化させる前処理を行います。麻酔をかけた幼魚を、側臥位で完全にウェルに収まるように、オーガー注入プレートのウェルに配置します。ウェル内での仔魚の動きを最小限に抑えるため、過剰なtrica溶液を除去しますが、脱水を防ぐのに十分な量は残しておきます。仔魚が入った注入プレートを解剖顕微鏡に載せ、EBDを含む注入用ピペットの針を配置します。心臓付近で、前後軸から約45度の位置にあるゼブラフィッシュ仔魚の上で混合します。注入針を、卵黄の前方付近で静脈が背側に曲がり始める共通主静脈（common cardinal vein; CCV）に挿入します。次に、5 nLのEBDミックスを注入し、注入針を5〜8秒間そのまま保持します。EBDミックスの即時の漏出を最小限に抑えるため、適切に注入されると心室に染料が確認されます。必要に応じてこの操作を繰り返してください。注入成功後、心臓にEB DMXが確認できない場合、胚の血管系にFitz Dextrinが蓄積します（ここに示す通り）。目的の数の幼魚に注入した後、生存率を高めシグナル強度を維持するため、tricaを含まない1x ringer溶液を入れた100 mmディッシュに幼魚を戻します。ディッシュはアルミホイルで包んで保管してください。EBDを効率的に取り込ませるため、幼魚を28.5 °Cで4～6時間インキュベートします。筋肉内のEBDを可視化するには、0.04% tricaを用いて幼魚を麻酔し、赤色蛍光下で観察します。Sapiaホモ接合体変異体および野生型兄弟個体の3D PFにおいて、心腔を満たすようにCCVへEBDを注入しました（ここに示す通り）。その後、緑色蛍光下で血管内のfitzy dextranを可視化することにより、色素灌流が成功したかを確認しました。4時間のインキュベーション期間後、この図に示すように、ソマイトレベルでEBDの取り込みを検討しました。野生型の兄弟個体では、可視化されたどの筋線維内にもEBDの蛍光は見られませんでしたが、sapiaホモ接合型変異体ではEBDの取り込みが認められ、筋膜の損傷が示されました。ゼブラフィッシュの共通前主静脈へのエバンスブルー染料の注入に習熟すれば、注入する幼魚の数に応じて、30〜60分以内に完了させることができます。さらに、習熟度を確保するために、1日で実験結果を得ることが可能です。一貫性のある解釈可能な結果を得るには、心静脈を慎重に狙うことが重要であるという点を忘れないでください。これは困難な作業であり、本手順に従って練習を重ねることが必要になると思われます。筋ジストロフィーに伴う膜損傷の原因となる分子メカニズムを解明するために、化学的および遺伝学的スクリーニングなどの他の手法を実施することができます。これらの実験は、開発後、筋肉疾患に対する新しい治療戦略の確立に役立ちます。本手法は、筋肉疾患研究分野の研究者が、筋ジストロフィーのゼブラフィッシュモデルにおいて膜の完全性を探索するための道を切り開きました。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ幼魚の総前主静脈にエバンズブルー染料を注入する方法を十分に理解することができます。また、筋線維内にエバンズブルー染料が存在することを確認し、膜損傷のある筋線維を特定する方法についても理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ゼブラフィッシュは、骨格筋のヒト障害をモデル化するための新たなシステムである。私たちは、胚および幼虫のゼブラフィッシュから骨格筋筋線維を隔離するために迅速かつ効率的な方法が記載されている。この方法は、単一の骨格筋線維の形態、タンパク質の細胞内局在、および筋生理学の研究に適した高密度の線維調製物が得られる。...

解離調製物から胚および幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋線維の分析

力の測定は、開発、傷害、疾病、治療または化学毒性による筋機能の変化を示すために使用することができる。このビデオでは、我々は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋の最大収縮時の力を測定する方法を示しています。...

ゼブラフィッシュ幼生における筋機能を評価するために、収縮時の力測定

ゼブラフィッシュは、筋ジストロフィー、先天性ミオパチー、および関連する神経筋疾患をモデル化するための確立された強力なツールとなっています。複屈折と触覚誘発逃走行動は、ゼブラフィッシュ胚の早期発生における筋肉の混乱と運動障害の程度を決定するために使用される2つの一般的な非侵襲的アッセイです。...

複屈折およびタッチ呼び起こすエスケープ応答アッセイによる幼虫のゼブラフィッシュ骨格筋の欠陥の分析

骨格筋は歩行のために不可欠であり、団体「メインタンパク質店です。 C.エレガンス内の筋肉の健康の測定について説明する。筋肉の構造と機能の将来の変更は、ローカライズされたGFPおよびカチオン染料を使用して評価される。...

筋肉の細胞内コンパートメントを評価するための方法 C。エレガンス

ゼブラフィッシュは、筋肉の機能と病気を研究するための優れたモデルです。初期胚形成期には、ゼブラフィッシュは規則的な筋肉収縮を開始し、リズミカルな遊泳行動を生み出し、筋肉が乱れると遊泳行動が変化します。ここでは、筋肉機能の尺度として水泳パフォーマンスを調べるための、タッチ誘発反応と運動アッセイについて説明します。...

ゼブラフィッシュで筋肉のパフォーマンスと機能を評価するためにタッチ誘発応答と歩行アッセイを使用して

有限要素解析は、荷重がかかった構造物の機械的性能を調査するためによく使用されるツールです。ここでは、ゼブラフィッシュの顎の生体力学のモデリングにその使用を適用します。...

ゼブラフィッシュジョーバイオメカニクスを調査するために有限要素モデルの構築

このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。...

テストの子孫によるゼブラフィッシュ致死の骨格変異の浸透度をシフト

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。...

ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

ここでは、アリザリンレッド染色を使用して、酢酸鉛曝露がゼブラフィッシュ幼虫の骨量変化を引き起こすことを示しました。この染色法は、他の有害毒物によって誘発されるゼブラフィッシュ幼虫の喪失における骨量減少の調査に適合させることができる。...

アリザリンレッド染色を使用してゼブラフィッシュ幼虫の化学的に誘発された骨量減少を検出

光学的透明度は、ゼブラフィッシュの細胞生物学的および生理学的研究にとって大きな利点です。骨格筋および隣接組織の成長が全身の成長とどのように統合されるかについての新しい洞察を可能にする、個々の動物の細胞増殖を測定するための堅牢な方法が説明されています。...

電気的活動の変化を受けた個々の生きたゼブラフィッシュの骨格筋成長のリアルタイムおよび反復測定

このプロトコルは、成体ゼブラフィッシュにおけるいくつかの尾側筋腫の深刻な損傷を誘発するための凍結損傷モデルについて説明しています。この方法は、非哺乳類脊椎動物の重度の組織喪失後の骨格筋再生を研究するための新しいアプローチを提供します。...

ゼブラフィッシュ成体における尾柄の骨格筋再生研究のための凍結損傷モデル

学ぶエバンスブルー色素を用いたゼブラフィッシュ幼生の骨格筋膜整合性評価法。筋ジストロフィー疾患モデルの解析と治療薬開発への応用を支援する技術です。

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

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