エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

Evans Blue DyeおよびFitzy Dextrinを用いた共通心静脈注射の全体的な目的は、生存しているゼブラフィッシュの骨格筋膜の完全性を観察し、筋ジストロフィーの様々なサブタイプに関連する疾患誘発メカニズムの特性評価を支援することである。Evans Blue Dyeの注射は、筋ジストロフィーの動物モデルを特性評価する際に、疾患の病理に寄与する生物学的メカニズムの解明に役立ち、また、疾患治療のための潜在的な治療メカニズムの理解にも寄与することができる。この手法の主な利点は、生存しているゼブラフィッシュを用いて実施および分析が可能であることである。

さらに、Fitz Dextrinを同時に注入することで、注入が成功したかどうかの品質管理が可能となり、厳密性と定量性が向上します。この手法の意義は、筋疾患のゼブラフィッシュモデルの妥当性確認における有用性にあります。また、筋ジストロフィーなどの特定の変異がどのように筋疾患の表現型につながるかという理解を深めることにもなり、これは治療法や治癒策を見出すために不可欠です。

アガー注入プレートを調製するには、E3培地で2〜3%のアガーを沸騰させ、溶液をベンチ上でわずかに冷却させます。冷却したアガーを、100mmディッシュに約35mLずつ注ぎます。次に、好みの注入用モールドの一端を溶液に入れ、その後、モールドの残りの部分をアガー溶液の上に置きます。

アガロ溶液を室温または4°Cで約30分間静置し、凝固させます。次に、スパチュラを用いてモールドの一端を固まったアガロから切り離し、ゆっくりと残りのモールドを取り除きます。1×リンガー液を用いて、1%のエヴァンズブルー染料（EBD）ストック溶液を作製します。

次に、Fitz-Dextrinのストック溶液を1xリンガー液で調製し、-20 °Cで保存します。注入混合液を作成するには、Fitz-Dextrinストック溶液にEBDを直接加えて0.1%に希釈します。注入混合液を十分にボルテックスし、注入前にチューブをアルミホイルで包み、直射日光を避けて保管してください。注入プレートを室温まで予熱しておきます。

マイクロマニピュレーターを金属プレート上に配置し、注入顕微鏡の横に設置します。エア駆動式マイクロインジェクションコントローラーの電源を入れます。次に、約2〜4 µLのEBDミックスを用いて、注入針をバックフィルします。

次に、約5 nLのEBDミックスを用いて注入量を校正します。その後、1xリンガー溶液を使用して注入プレートを湿らせ、ウェルから余分な溶液を取り除きます。ガラスピペットで注入する前に、1xリンガー溶液で希釈した0.04%トリカインを用いて、幼魚を完全に不動化させる前処理を行います。麻酔をかけた幼魚を、側臥位で完全にウェルに収まるように、オーガー注入プレートのウェルに配置します。

ウェル内での仔魚の動きを最小限に抑えるため、過剰なtrica溶液を除去しますが、脱水を防ぐのに十分な量は残しておきます。仔魚が入った注入プレートを解剖顕微鏡に載せ、EBDを含む注入用ピペットの針を配置します。心臓付近で、前後軸から約45度の位置にあるゼブラフィッシュ仔魚の上で混合します。

注入針を、卵黄の前方付近で静脈が背側に曲がり始める共通主静脈（common cardinal vein; CCV）に挿入します。次に、5 nLのEBDミックスを注入し、注入針を5〜8秒間そのまま保持します。EBDミックスの即時の漏出を最小限に抑えるため、適切に注入されると心室に染料が確認されます。必要に応じてこの操作を繰り返してください。

注入成功後、心臓にEB DMXが確認できない場合、胚の血管系にFitz Dextrinが蓄積します（ここに示す通り）。目的の数の幼魚に注入した後、生存率を高めシグナル強度を維持するため、tricaを含まない1x ringer溶液を入れた100 mmディッシュに幼魚を戻します。ディッシュはアルミホイルで包んで保管してください。

EBDを効率的に取り込ませるため、幼魚を28.5 °Cで4～6時間インキュベートします。筋肉内のEBDを可視化するには、0.04% tricaを用いて幼魚を麻酔し、赤色蛍光下で観察します。Sapiaホモ接合体変異体および野生型兄弟個体の3D PFにおいて、心腔を満たすようにCCVへEBDを注入しました（ここに示す通り）。その後、緑色蛍光下で血管内のfitzy dextranを可視化することにより、色素灌流が成功したかを確認しました。

4時間のインキュベーション期間後、この図に示すように、ソマイトレベルでEBDの取り込みを検討しました。野生型の兄弟個体では、可視化されたどの筋線維内にもEBDの蛍光は見られませんでしたが、sapiaホモ接合型変異体ではEBDの取り込みが認められ、筋膜の損傷が示されました。ゼブラフィッシュの共通前主静脈へのエバンスブルー染料の注入に習熟すれば、注入する幼魚の数に応じて、30〜60分以内に完了させることができます。

さらに、習熟度を確保するために、1日で実験結果を得ることが可能です。一貫性のある解釈可能な結果を得るには、心静脈を慎重に狙うことが重要であるという点を忘れないでください。これは困難な作業であり、本手順に従って練習を重ねることが必要になると思われます。

筋ジストロフィーに伴う膜損傷の原因となる分子メカニズムを解明するために、化学的および遺伝学的スクリーニングなどの他の手法を実施することができます。これらの実験は、開発後、筋肉疾患に対する新しい治療戦略の確立に役立ちます。本手法は、筋肉疾患研究分野の研究者が、筋ジストロフィーのゼブラフィッシュモデルにおいて膜の完全性を探索するための道を切り開きました。

このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ幼魚の総前主静脈にエバンズブルー染料を注入する方法を十分に理解することができます。また、筋線維内にエバンズブルー染料が存在することを確認し、膜損傷のある筋線維を特定する方法についても理解することができます。