エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

Evans Blue DyeとFitzy Dextrinの一般的な枢機卿静脈注射の全体的な目標は、生きたゼブラフィッシュの骨格筋膜の完全性を観察して、筋ジストロフィーのさまざまなサブタイプに関連する病気の原因メカニズムを特徴付けるのを助けることです。Evanの青色色素注入は、筋ジストロフィーの動物モデルを特徴付ける際に、疾患の病理に寄与する生物学的メカニズムを明らかにするのに役立ち、疾患治療の潜在的な治療メカニズムの理解にも貢献できます。この手法の主な利点は、生きたゼブラフィッシュを使用して実行および分析できることです。

さらに、Fitz Dextrinの同時注入は、注入を成功させるための品質管理を示しており、厳密性と定量性が向上します。この手法の意味するところは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルの検証における有用性に関連しています。また、特定の変異が筋ジストロフィーなどの筋疾患の表現型にどのようにつながるかについての理解を深めるとともに、これは治療法や治療法を見つけるために重要です。

寒天注入プレートを調製するには、E 3培地で2〜3%のアロスを沸騰させ、溶液をベンチでわずかに冷まします。冷やしたアグロスを各100ミリ皿に約35ミリリットル注ぎます。次に、お好みの射出成形金型の一端を溶液に入れてから、金型の残りの部分をアグロ溶液の上に置きます。

アグロ溶液を室温または摂氏4度で約30分間固化させます。次に、へらを使用して金型の一方の端を固体のアグロスから分離し、金型の残りの部分をゆっくりと取り出します。Evan's Blue DyeまたはEBDを1 x リンガー溶液に1%ストックします。

次に、Fitzy Dextrinの原液を1 x リンガー溶液に調製し、マイナス20°Cで保存します。インジェクションミックスを作るには、EBDをフィッツデキストリンストック溶液で直接0.1%に希釈し、インジェクションミックスを完全にボルテックスし、注入前にアルミホイルを使用してチューブを包み、直射日光を避けてください。注入プレートを室温に予温します。

マイクロマニピュレーターを金属板に並べ、注射顕微鏡の隣に立ちます。空気駆動のマイクロインジェクションコントローラーをオンにします。次に、約2〜4マイクロリットルのEBD混合物で、注射針を埋め戻します。

次に、約5ナノリットルのEBD混合物で注入量を較正します。次に、1 x リンガー溶液を使用して注入プレートを濡らし、ウェルから余分な溶液を取り除き、ガラスピペットで注入する前に、1 x リンガー溶液で希釈した 0.04% トリカで幼虫を前処理して幼虫を完全に固定します。麻酔をかけた幼虫をオーガー注入プレートのウェルに入れ、幼虫が横たわっているウェルに完全に収まるようにします。

井戸内の幼虫の動きを最小限に抑えるために余分なトリカ溶液を取り除きますが、脱水症状を防ぐために十分に残します。幼虫の注入プレートを解剖スコープに置き、EBDを含む注入ピペット針を配置します。ゼブラフィッシュの幼生を心臓の近く、前後軸から約45度の位置で混ぜます。

注射針を、静脈が最初に背側に曲がる卵黄の前部近くの総枢機卿静脈またはCCVに挿入します。次に、5ナノリットルのEBD混合物を注入し、注射針を5〜8秒間所定の位置に保ちます。EBDミックスの即時の漏れを最小限に抑えるために、良好な注入は心腔に色素を示し、それを繰り返すことができます。

注射が成功した直後にEB DMXが心臓に見られない場合、ここに示すように、胚は血管系にフィッツデキストリンを蓄積します。必要な数の幼虫を注入した後、幼虫を100ミリメートル皿のトリカを含まない1xリンガー溶液に戻して、生存率を高め、信号強度を維持します。皿をアルミホイルで包んで保管してください。

幼虫を摂氏28.5度で4〜6時間インキュベートして、効率的なEBD取り込みを確保します。筋肉のEBDを視覚化するには、0.04%トリカを使用して幼虫を麻酔してから、赤い蛍光下で幼虫を観察します。EBDは、ここに示すように心腔を満たす3D PF注射でサピア均質変異体および野生型兄弟のCCVに注入され、その後、緑色蛍光下で血管系内の適合したデキストリンを視覚化することにより、ダイ灌流の成功について分析されました。

4時間のインキュベーション期間の後、EBDの取り込みをこの図に示すように、スーダニレベルで調べました。野生型の兄弟は、目に見える筋線維内でEBD蛍光を示さなかったが、サピアホモ接合変異体はEBDの取り込みを示し、筋肉膜の損傷を示した。ゼブラフィッシュの一般的な枢機卿静脈にエバンスブルー染料を注入すると、注入する幼虫の数にもよりますが、30〜60分以内に幼虫を完成させることができます。

さらに、実験結果は1日で取得できます 習熟度を確保するために。一貫性のある解釈可能な結果を生み出すためには、慎重に枢機卿静脈を目指すことを忘れないことが重要です。これは難しい場合があり、この手順に従って練習が必要になる可能性があります。

筋ジストロフィーに関連する膜損傷の原因となる分子メカニズムを決定するために、化学的および遺伝的スクリーニングなどの他の方法を実行することができます。これらの実験は、筋肉疾患の発症後の新しい治療戦略を確立するのに役立ちます。この技術は、筋ジストロフィーのゼブラフィッシュモデルにおける膜の完全性を探求するための、筋疾患研究の分野の研究者への道を開きました。

このビデオを見た後、ゼブラフィッシュの幼生の一般的な枢機卿静脈にエバンの青い染料を注入する方法を完全に理解しているはずです。また、繊維内にエバンの青色染料が存在するために膜が損傷している筋繊維を特定する方法も理解する必要があります。