相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

本実験の全体的な目的は、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡を用いて、生存し水和状態にある細胞の細胞質膜における上皮成長因子受容体（EGFR）の分布と化学量論を可視化することである。まず、中央のウィンドウ領域に50 nmの薄い窒化シリコン膜が張られたマイクロチップ上で、cos sevenなどのEGFR発現細胞を培養する。次に、受容体に結合してEGFRの構造変化を誘発し、二量体化および活性化をもたらすビオチン化上皮成長因子を細胞にインキュベートする。

次に、受容体を固定するために細胞を固定し、EGF活性化受容体に結合するストリップ済みのHagen結合量子ドットとともにインキュベートして、細胞をイメージングします。最後に、グルタルアルデヒドを用いて二度目の固定を行い、ストリップ済みのHagen結合量子ドットをEGFRと架橋させ、電子顕微鏡観察のためにサンプルを安定化させます。その結果、蛍光量子ドットイメージングによる赤色蛍光の発光と、走査透過電子顕微鏡によるEGFRの分布および化学量論的状態またはクラスター化が示されます。

この手法は、完全細胞における膜受容体のストックジオメトリおよび分布に関する独自の情報を提供し、正常細胞およびがん細胞における上皮成長因子受容体の活性化に関する知見を得るために利用できます。また、イオンチャネルなどの他の膜受容体の研究にも適用可能です。まず、化学薬品用フード内で作業を開始します。窒化ケイ素膜マイクロチップの最初の調製ステップにおいて、プロトコルに従ってアセトンに浸漬した後、マイクロチップをエタノールの入ったビーカーに直接移し、2分間待ちます。その後、チップをエタノールから取り出し、クリーンルーム用ティッシュの上に置きます。

チップが乾燥したら、あらかじめペトリ皿に置いてあったガラススライドの上にチップを移します。次に、皿にカバーをかけます。続いて、マイクロチップを載せたガラススライドをプラズマクリーナーに入れます。

窒化シリコン膜の表面を親水化するため、5分間の標準洗浄プログラムを実行します。その後、ラミナーフローフード内で、ガラスからマイクロチップを移します。クリーンルーム用ティッシュの上に滑らせてから、poly L lysine溶液（PLL）を満たした24ウェルプレートのウェルに入れ、5分間インキュベートします。

次に、マイクロチップを1つずつ、HPLCグレードの水が入った2番目のウェルに移し、さらに別の水のウェルで洗浄します。最後に、マイクロチップを個別にDMを満たした96ウェルプレートのウェルに入れ、COS 7細胞のサブカルチャーを用いて二酸化炭素インキュベーター内にプレートを設置します。濃度が約5 × 10⁵の単分散細胞懸濁液を調製します。

1mLあたり5×10⁵個の細胞を用意します。96ウェルプレート内の各マイクロチップに細胞懸濁液を1滴ずつ加え、倒立顕微鏡下で室温にて5分間インキュベートします。150×400 µmの視野あたり約20〜30個の細胞密度になるよう、マイクロチップの観察領域を調整します。

細胞が十分に接着したら、マイクロチップの細胞側を上にして、dmを含む新しいウェルへ注意深く移します。十分な数の細胞が接着していることを確認し、細胞側を上にしたまま、無血清dmmを含む新しいウェルへとマイクロチップを移します。その後、次ステップに向けて、マイクロチップを二酸化炭素インキュベーター内にて37 °Cで数時間から一晩インキュベートします。

96ウェルプレートを用いて、各ウェルに必要な溶液を満たし、マイクロチップ1枚につき1行または1列を割り当てます。マイクロチップを新鮮なB-S-A-G-E-L-P-B-Sが入ったウェルに入れ、37 °Cで5分間インキュベートして洗浄します。その後、マイクロチップを300 nMのEGFビオチン溶液に移し、さらに3分間インキュベーターに戻します。これにより、細胞によるEGF標識EGFRのエンドサイトーシスが始まります。

PBSを用いてマイクロチップを3回素早く洗浄します。次に、0.1 Mのcateバッファー（CB）でサンプルを洗浄します。続いて、マイクロチップを3% PFAに移し、10分間インキュベートします。

CBで1回、PBSで3回洗浄した後、チップをG-L-Y-P-B-Sに移し、2分間インキュベートします。次に、PBSで2回洗浄します。その後、マイクロチップを10 nMのS-T-R-Q-Dに10分間浸し、B-S-A-P-B-Sで4回洗浄します。

次に、室温のB-S-A-P-B-Sをあらかじめ満たした底面ガラス製35 millimeterディッシュにマイクロチップを1つ浸し、DICおよび蛍光顕微鏡で細胞を観察します。QD 6 55で標識された細胞の概要画像には、40 x 空中対物レンズを使用してください。量子ドットを340から380 nanometersで励起し、420 nanometers以上の波長で放出させるフィルターキューブを使用してください。

サンプルの損傷を防ぐため、光強度は最小限に抑えます。QDの蛍光点滅（ブリンキング）に伴うすべての信号を捉えられるよう、露光時間を300ミリ秒以上に設定してください。光強度を最小限に抑えつつ、目に見えるノイズのない明るい画像が得られるように、光強度と増幅率を調整します。イメージング後、マイクロチップをB-S-A-P-B-Sを含む96ウェルプレートに戻します。

cbで1回すすいだ後、2%グルタラールデヒドに転送し、さらに10分間インキュベートします。洗浄し、B-S-A-P-B-Sを用いてマイクロチップを3回洗浄します。マイクロチップごとに、B-S-A-P-B-Sをあらかじめ充填した新しい96ウェルプレートのウェルに保存します。4つのウェルが並ぶ1列に、HPLCグレードの水を満たします。

テキストのプロトコルに従ってESEMをセットアップした後、冷却コンテナから96ウェルプレートを取り出し、開いたESEMステージの近くに配置して、pre-COOL ESEM STEMステージにサンプルをロードします。その横にクリーンルーム用ティッシュを用意してください。HPLCグレードの水で満たされたウェルにマイクロチップを1秒間ずつ4回浸し、迅速に洗浄します。

マイクロチップの背面をティッシュで軽く拭き取り、3 µLの冷却済みHPLCグレード水が入った予冷ステージに設置します。サンプルの表面を濡らし、ステージにサンプルを固定してください。次に、サンプルの近くのステージ上に3 µLの水滴をさらに3滴滴下し、試料室を閉じます。

テキストプロトコルに従い、目的の細胞を特定した後、その細胞のSTEM概観画像を記録し、細胞境界が見える細胞の周辺領域に移動して50,000倍に拡大します。個々のQDを示す画像を記録し、ピクセル滞在時間は20〜30マイクロ秒に設定します。ここに示しているのは、完全な水和状態のCOS 7細胞においてQD 655で標識された膜結合型EGFRです。こちらのDIC画像は細胞の膜トポグラフィーを示しており、対応する蛍光画像は、EGFビオチンを3分間インキュベートした後の細胞表面全体におけるEGFRの分布を示しています。

これらの低倍率ESEM STEM画像では、細胞から隣接する細胞に向かって伸びる糸状仮足などの微細構造や、細胞の薄い領域内部のいくつかの構造が明らかになっています。核を含む細胞中央の厚い領域は、使用したエネルギーの電子では試料を透過できないため、白く表示されています。高解像度。

周辺部のより薄い領域のESEM STEM画像では、画像を対角線上に横切る膜のひだの上にQDラベルが確認できます。この膜構造には、周囲の膜領域よりもEGFR密度が高い箇所が数か所あり、2つのラベルが近接していました。距離が20 nanometersおよび24 nanometersである2つの例を矢印で示しています。

これらのラベルのペアは、EGF Fersに属するものと解釈されます。この画像は、EGFRの密度と蛍光信号が低い領域で記録されました。それにもかかわらず、ここでは二量体として存在するEGFRも見出され、10個または11個のEEGからなる2つのクラスターが存在していました。

習熟すれば、試料調製は2時間以内に完了でき、電子顕微鏡で一般的に用いられる手法よりも大幅に高速です。その後のessem STEMイメージングでは、半日で最大100枚の高解像度画像を取得することが可能です。