Name: 相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ相関顕微鏡を用いて、無傷のCOS7細胞における上皮成長因子受容体（EGFR）の分布と化学量論を可視化する方法。蛍光量子ドットと走査透過電子顕微鏡で単一分子レベルの受容体ダイマーとクラスタリングを解析し、細胞シグナル伝達とがん研究に貢献します。

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INMを通じて支援してくれたE.Arzt氏、ESEMを支援してくれたM.Koch氏、そしてマイクロチップを提供してくれたDENS Solutionsに感謝します。研究の一部はライプニッツコンペティション2013の支援を受けています。

<ol><li>Dukes, M. J., Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+fluorescence+microscopy+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum-dot-labeled+proteins+in+whole+cells+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Correlative fluorescence microscopy and scanning transmission electron microscopy of quantum-dot-labeled proteins in whole cells in liquid.</a> ACS Nano. 4, 4110-4116 (2010).</li>
<li>Nishiyama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atmospheric+scanning+electron+microscope+observes+cells+and+tissues+in+open+medium+through+silicon+nitride+film%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Atmospheric scanning electron microscope observes cells and tissues in open medium through silicon nitride film.</a> J. Struct. Biol. 169, 438-449 (2010).</li>
<li>Kinoshita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-electron+microscopy+of+primary+cell+cultures+from+genetically+modified+animals+in+liquid+by+atmospheric+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Immuno-electron microscopy of primary cell cultures from genetically modified animals in liquid by atmospheric scanning electron microscopy.</a> Microsc. Microanal. 20, 469-483 (2014).</li>
<li>Jonge, N., Peckys, D. B., Kremers, G. J., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+whole+cells+in+liquid+with+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of whole cells in liquid with nanometer resolution.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 2159-2164 (2009).</li>
<li>Peckys, D. B., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+Scanning+Transmission+Electron+Microscopy%3A+Imaging+Protein+Complexes+in+their+Native+Environment+in+Whole+Eukaryotic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy: Imaging Protein Complexes in their Native Environment in Whole Eukaryotic Cells.</a> Microsc. Microanal. 20, 189-198 (2014).</li>
<li>Peckys, D. B., Baudoin, J. P., Eder, M., Werner, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+subunit+locations+determined+in+hydrated+cells+with+environmental+scanning+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor subunit locations determined in hydrated cells with environmental scanning electron microscopy.</a> Sci. Rep. 3, 2621-2626 (2013).</li>
<li>Peckys, D. B., Korf, U., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+variations+of+HER2+dimerization+in+breast+cancer+cells+discovered+by+correlative+fluorescence-+and+liquid+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Local variations of HER2 dimerization in breast cancer cells discovered by correlative fluorescence- and liquid electron microscopy.</a> Science Advances. under revision, (2015).</li>
<li>Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlated+light+and+electron+microscopic+imaging+of+multiple+endogenous+proteins+using+Quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using Quantum dots.</a> Nat. Meth. 2, 743-749 (2005).</li>
<li>Herbst, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+epidermal+growth+factor+receptor+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.Radiat.+Oncol.+Biol.+Phys%22%5BJournal%5D)">Review of epidermal growth factor receptor biology.</a> Int. J.Radiat. Oncol. Biol. Phys. 59, S21-S26 (2004).</li>
<li>Normanno, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+%28EGFR%29+signaling+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling in cancer.</a> Gene. 366, 2-16 (2006).</li>
<li>Hofman, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGF+induces+coalescence+of+different+lipid+rafts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">EGF induces coalescence of different lipid rafts.</a> J. Cell Sci. 121, 2519-2528 (2008).</li>
<li>Irwin, M. E., Mueller, K. L., Bohin, N., Ge, Y., Boerner, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+raft+localization+of+EGFR+alters+the+response+of+cancer+cells+to+the+EGFR+tyrosine+kinase+inhibitor+gefitinib%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lipid raft localization of EGFR alters the response of cancer cells to the EGFR tyrosine kinase inhibitor gefitinib.</a> J. Cell Physiol. 226, 2316-2328 (2011).</li>
<li>Lillemeier, B. F., Pfeiffer, J. R., Surviladze, Z., Wilson, B. S., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane-associated+proteins+are+clustered+into+islands+attached+to+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane-associated proteins are clustered into islands attached to the cytoskeleton.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 103, 18992-18997 (2006).</li>
<li>Mayawala, K., Vlachos, D. G., Edwards, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneities+in+EGF+receptor+density+at+the+cell+surface+can+lead+to+concave+up+scatchard+plot+of+EGF+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Heterogeneities in EGF receptor density at the cell surface can lead to concave up scatchard plot of EGF binding.</a> FEBS Lett. 579, 3043-3047 (2005).</li>
<li>Valley, C. C., Lidke, K. A., Lidke, D. S. The spatiotemporal organization of ErbB receptors: insights from microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aValley%2C+CC+%22Cold+Spring+Harb.+Perspect.+Biol%22">Cold Spring Harb. Perspect. Biol</a>. 6, (2014).</li>
<li>Peckys, D. B., Bandmann, V., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+fluorescence-+and+scanning+transmission+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative fluorescence- and scanning transmission electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Meth. Cell Biol. 124, 305-322 (2014).</li>
<li>Peckys, D. B., Dukes, M. J., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+fluorescence+and+electron+microscopy+of+quantum+dot+labeled+proteins+on+whole+cells+in+liquid%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Correlative fluorescence and electron microscopy of quantum dot labeled proteins on whole cells in liquid.</a> Methods Mol. Biol. 1117, 527-540 (2014).</li>
<li>Ring, E. A., Peckys, D. B., Dukes, M. J., Baudoin, J. P., de Jonge, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silicon+nitride+windows+for+electron+microscopy+of+whole+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Silicon nitride windows for electron microscopy of whole cells.</a> J. Microsc. 243, 273-283 (2011).</li>
<li>Bogner, A., Thollet, G., Basset, D., Jouneau, P. H., Gauthier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wet+STEM%3A+A+new+development+in+environmental+SEM+for+imaging+nano-objects+included+in+a+liquid+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Wet STEM: A new development in environmental SEM for imaging nano-objects included in a liquid phase.</a> Ultramicroscopy. 104, 290-301 (2005).</li>
<li>Chung, I., Akita, R., Vandlen, R., Toomre, D., Schlessinger, J., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+control+of+EGF+receptor+activation+by+reversible+dimerization+on+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial control of EGF receptor activation by reversible dimerization on living cells.</a> Nature. 464, 783-787 (2010).</li>
<li>Stoyan, D., Stoyan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+pair+correlation+functions+of+planar+cluster+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Biom.+J%22%5BJournal%5D)">Estimating pair correlation functions of planar cluster processes.</a> Biom. J. 38, 259-271 (1996).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tumor-targeted+fluorescence+imaging+using+near-infrared+non-cadmium+quantum+dots%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo tumor-targeted fluorescence imaging using near-infrared non-cadmium quantum dots.</a> Bioconjug. Chem. 21, 604-609 (2010).</li>
<li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat. Meth. 6, 21-23 (2009).</li>
<li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+protein+FRET%3A+the+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem. Sci. 32, 407-414 (2007).</li>
<li>Warren, C. M., Landgraf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+ERBB+receptors%3A+Multiple+layers+of+diversity+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Signal%22%5BJournal%5D)">Signaling through ERBB receptors: Multiple layers of diversity and control.</a> Cell. Signal. 18, 923-933 (2006).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Mol. Cell. Proteomics. 12, 1563-1571 (2013).</li>
<li>Hoenger, A., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+macromolecular+organization+of+cells+by+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the macromolecular organization of cells by electron tomography.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 89-96 (2009).</li>
<li>Zhang, J., Leiderman, K., Pfeiffer, J. R., Wilson, B. S., Oliver, J. M., Steinberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+topography+of+membrane+receptors+and+signaling+molecules+from+spatial+patterns+obtained+using+nanometer-scale+electron-dense+probes+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Characterizing the topography of membrane receptors and signaling molecules from spatial patterns obtained using nanometer-scale electron-dense probes and electron microscopy.</a> Micron. 37, 14-34 (2006).</li>
<li>Pinto da Silva, P., Kan, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-fracture%3A+a+method+for+high+resolution+labeling+of+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Label-fracture: a method for high resolution labeling of cell surfaces.</a> J. Cell Biol. 99, 1156-1161 (1984).</li>
<li>Bergersen, L. H., Storm-Mathisen, J., Gundersen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunogold+quantification+of+amino+acids+and+proteins+in+complex+subcellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunogold quantification of amino acids and proteins in complex subcellular compartments.</a> Nat. Protoc. 3, 144-152 (2008).</li>
<li>Orlov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+immunogold+labelling+of+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22II.+Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Live cell immunogold labelling of RNA polymerase.</a> II. Sci. Rep. 5, 8324(2015).</li>
<li>Fiala, G. J., Kaschek, D., Blumenthal, B., Reth, M., Timmer, J., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clustering+of+the+B+cell+antigen+receptor+demonstrated+by+mathematically+extended+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pre-clustering of the B cell antigen receptor demonstrated by mathematically extended electron microscopy.</a> Front. Immunol. 4, 427(2013).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

全細胞におけるこのようなEGFRなどの膜タンパク質の空間分布と化学量論を、学ぶこと、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。これは、直接情報がセルまたはセル15の間の差異におけるタンパク質の局在化について失われるために一般的に使用される生化学的方法を用いて、細胞内レベルでのモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を研究するために挑戦しています。その化学量論は、個々の、無傷細胞4-7のコンテキスト内で研究することができるように、ここに記載の標識及び顕微鏡検査方法は、数ナノメートルの長さスケールでのタンパク質複合体の可視化を可能にします。その解像度はタンパク質複合体に従事した分子を区別するのに不十分であるため、これは（超解像度）光学顕微鏡23では不可能です。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）は、&lt;アンサンブル平均化技術であります&gt; 24 SUP、必ずしもエネルギー移動25の短距離の結果として二量体およびより高次のクラスタを検出しません。近接ライゲーションアッセイ26は、実際の距離を測定しないため、高タンパク質濃度での細胞領域との間を区別することができない、必然的に類似のタンパク質濃度での細胞の領域から、偶然によって検出された近接の数につながるが、タンパク質を含みますかラベルの間に明確な距離を示す複合体。タンパク質複合体の成分を可視化するために必要な高解像度透過型電子顕微鏡（TEM）によって達成されます。しかし、細胞全体の従来のTEMは、原形質膜27、または形質膜リッピングを通してスライス又は膜のランダムに形成された小片の結果28,29を切り離す薄いサンプル/セクションの要件によって制限されます。細胞膜は、このように欠如につながる、全体として撮像されていません可能性が極めて重要な細胞のコンテキスト情報。 細胞におけるタンパク質の化学量論の研究のための他の実験的な課題は、印加されるタンパク質標識から生じます。一般的に使用される免疫標識は、受容体と標識との間の一対一の化学量論は、唯一の一価のプローブを用いて達成され得ることが困難に耐えます。これは、一次および二次抗体が必要とされている場合ではありません。タンパク質の化学量論についての情報を得るためには、プローブは、受容体上のエピトープに固有に結合し、蛍光プローブまたは他の側の高原子番号のナノ粒子のための1つの結合部位を有することが要求されます。近隣の単一タンパク質、ホモ二量体、またはより大きなクラスタ間の差別は、少なくともではないEGFRファミリーの受容体について、現実的ではありませんように、第二に、抗体標識で達成可能な精度は、その大きなサイズ30〜30ナノメートルのアカウントに制限されています。はるかに小さい特定のラベルは、文献およびCAで知られていますnは細胞内標識の31に対しても適用されるが、これらは一般的に使用されていません。全ラベル（EGF-ビオチン - ストレプトアビジンQD）の長さは、EGFRと同様の寸法のものであり、二量体を検出することができるように十分に小さいです。また、記載される二段階標識手順は、標識誘導される受容体のクラスタリングを回避します。 我々の方法は、標識されたタンパク質の蛍光顕微鏡よりもはるかに多く、非常に困難ではないではありません。ステップ数が合算とのいずれかの手順に誤りが実験で完全な故障につながる可能性があるのでしかし、実験では、細心の注意を払って行う必要があります。マイクロチップの取り扱いをお勧めしますTEMグリッドが、いくつかの訓練の空のチップの取り扱いよりも面倒ではありません。全体の水和細胞のESEM-STEMは、おそらく最も困難な側面であり、量子ドットを視覚化するために、必要に応じて3ナノメートルの周りの解像度に到達するために、少なくとも熟練したオペレータと実践の数日を必要とします。放射線ダム調査対象の試料の年齢はリスクを提示します。圧力及び温度は、慎重に水層を維持するために監視されるべきです。また、水の層の厚さは、セル間で変化してもよいです。他の場所で6記載のように、試料上の気体電子検出器を用いて水層の存在を監視することが望ましいです。細胞領域のみが損傷を避けるために一度か二度画像化されるべきです。 この方法の主要な制限は、超微細構造に関する高解像度情報が存在しないことです。他の技術は、例えば、クライオTEMのために、タンパク質の構造、および細胞の超微細構造15を研究するために必要とされます。第二に、タイムラプス顕微鏡で生細胞内のタンパク質の複数の動的相互作用を研究することは、放射線損傷のアカウントでは不可能である、と最先端の光学顕微鏡23を必要とします 。現在、私たちの方法は、L以来、二量体の絶対的なレベルを決定することはできませんabeling効率は不明であるが、我々は将来的にこのようなデータを追加する予定です。これは、二量体が存在しているかどう伝えるためにもかかわらず可能です。文献からは15％程度であっても標識効率は十分な統計的有意性32との二量体を検出するのに十分であることが知られています。 これは、特異的抗体のビオチニル化Fab断片を介して、それらのリガンドを介して他の膜結合型受容体を研究するために容易に可能であるか、または記載される二段階標識化プロトコルを使用して、他の小さなリンカーを介して、7。すでにQDの2つの異なる色（サイズ）を使用することができ、金ナノ粒子標識前ワーク 6に使用したことが実証されているので、同じ実験内の複数のタンパク質種を標識することが可能と思われます。複数のタンパク質種の化学量論の研究のための重要な課題は、尊敬に得られる相対的化学量論の正規化の両種または少なくとも類似の標識効率を確保していますラベリング効率をアイブ。しかし、この研究で使用される2つの異なるQDは、（ 図2および図4を参照）標識効率に大差がないようです。量子ドットとの二段階標識、および蛍光相関顕微鏡およびESEM-STEMを含む記載された方法は、全細胞の無傷の原形質膜に膜タンパク質の複雑な相互作用を研究するための実行可能な方法を提供します。

新しいアプローチは、STEM 1-3、または相関蛍光顕微鏡およびSTEM 4-7を用いて、液体の状態で標識したタンパク質を用いて画像全体の細胞に、最近導入されました。この方法は、全細胞の無傷の原形質膜における単一分子レベルでそれらの化学量論を含む膜タンパク質およびタンパク質複合体の空間分布を研究することが可能です。ここでは、蛍光量子ドット（QD）8、および相関光顕微鏡およびESEM-STEMと受容体タンパク質の二段階特異的な標識を含むプロトコルを記述します。例として、EGFR、タンパク質キナーゼスーパーファミリーに属する膜タンパク質を研究しました。リガンドが結合すると、受容体が活性化し、その後、別の活性化したEGFRとの二量体を形成し;後続のシグナルカスケードは、細胞増殖9を駆動します 。異常なEGFR発現または活性につながる変異は癌10の多くの種類の中で中心的な役割を果たしています。 StudyinG全細胞におけるこの膜受容体の空間的配置は、その機能と11-14その変化の可能性に関する重要なコンテキスト情報を提供します。しかし、それは直接biochemical-または従来の顕微鏡法15で（サブ）細胞レベルでのEGFRモノマー、ダイマー、およびクラスタの分布を調べるために困難なまま。我々の方法は、複合体中のタンパク質の位置を決定することができるように、数ナノメートルの空間分解能でのEGFRを可視化することが可能です。最も重要なのは、化学量論的分布に関する得られた情報は、無傷の細胞内タンパク質の天然の状況に関するものです。 ラベルと受容体との間の短い距離を達成するために、EGFRを直接QDにビオチン - ストレプトアビジン結合を用いて、そのリガンドEGFを介して標識しました。このラベルは、蛍光 - および電子顕微鏡の両方を検出することができます。私たちは、COS7細胞の相関イメージングでは、このラベルを使用しています以前1,16,17マイクロ流体チャンバ内に封入された液体。しかし、QDあたりストレプトアビジン分子の複数のアカウントで、このラベルは、低標識効率というより高価な実験につながる、受容体のクラスター化を誘導することができる、それは調査中のタンパク質の化学量論に結論することはできません。ラベル誘導される受容体のクラスタリングは一つだけのストレプトアビジン量子ドット（STR-QD）が結合されたビオチン化EGFを含むプローブで得られ、ここで提示二段階標識化手順を使用することによって完全に回避することができます。細胞は、まず、ビオチン化EGFと共にインキュベートし、次いで固定されています。固定工程は、タンパク質のプロセスは（固定の速度に依存）が停止された時点を決定します。 STR-QDは、標識プロトコルの2番目のステップで、その後に適用されます。タンパク質が固定されるとタンパク質の動的な膜の動きが阻害されるため、クラスタリングは行われません。である。また、STR-QDソリューション、実験の最も高価な成分は、最適化された低濃度で適用することができ、そして標識のこの第二段階は、時間重要ではない、 すなわち、QDは、数分内に結合することができます。 細胞全体に分布するようにEGFRの化学量論を研究するために、細胞試料は、シリコンマイクロチップ18上に作製しました。二段階QD標識、および蛍光顕微鏡画像の記録を適用した後、細胞を、純水でリンスし、そしてESEM-STEM 19を使用して水和状態で撮像されました。結果として得られる相関画像は、水和した細胞の彼らの自然な文脈での細胞のEGFR分布、および化学量論に関する情報を提供します。同様の方法は、最近の研究7乳癌細胞におけるHER2タンパク質を研究するために使用しました。

<table><tbody><tr><td>倒立型蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>AF6000 + DMI6000B</td><td></td></tr><tr><td>ESEM</td><td>FEI Company</td><td>Quanta 400 FEG</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (1x) + GlutaMax + グルコース + ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (1x) - 塩化カルシウム - 塩化マグネシウム</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清、Performance Plus (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>セルストリッパー・</td><td>メディアテック株式会社</td><td>25-056 Cl</td><td></td></tr><tr><td>水、HPLC Sigma-Aldrich 用 chromasolv Plus</td><td></td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>PBS Roti-Stock 10x PBS</td><td>Carl Roth</td><td>1058.1</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、Rotisolv HPLC グレード</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>アルブミンフラクション V、ビオチンフリー (BSA)</td><td>Carl Roth</td><td>O163.2</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン、冷水魚の皮</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7041-500G</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>カール ロス</td><td>T873.1</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>分子プローブ</td><td>E3477</td><td>ビオチン-XX コンジュゲート (ビオチン EGF)</td></tr><tr><td>テラホウ酸ナトリウム十水和物</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>S9640-500G</td><td></td></tr><tr><td>ホウ</td>酸 <td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B6768-500G</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 655 ストレプトアビジン複合体</td><td>分子プローブ</td><td></td><td></td>Q10121MP</tr><tr><td>Qdot 800 ストレプトアビジン結合</td><td>分子プローブ</td><td>Q10173MP</td><td></td></tr><tr><td>シリコンマイクロチップ、厚さ 50 nm の窒化ケイ素膜、寸法 50 μm x 0.40 mm</td><td>DENSソリューション</td><td>カスタムメイド</td><td></td></tr></tbody></table>

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

Studying the Stoichiometry of Epidermal Growth Factor Receptor in Intact Cells using Correlative Microscopy

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体（EGFR）のラベル付けを説明し、その後の相関蛍光顕微鏡および水和状態における全細胞の環境制御型走査電子顕微鏡（ESEM）。蛍光量子ドット（QD）は、受容体の標識誘発性クラスタリングを回避しながら、効率的かつ特異的なタンパク質標識を提供し、二段階標識化プロトコルを介してEGFRに結合させました。蛍光顕微鏡は、EGFRの細胞位置の概観画像を提供しました。走査型透過電子顕微鏡（STEM）検出器は、ナノスケールの分解能でQDのラベルを検出するために使用しました。結果として得られる相関画像は、水和した無傷の細胞の自然な文脈での単一分子レベルでの細胞のEGFR分布、および化学量論のデータを提供します。 ESEM-STEM像は、モノマーとして、ホモ二量体として、そして小さなクラスターに存在するように受容体を明らかにしました。二つの異なる量子ドットを用いた標識、すなわち、一つは655 nmで発光すると800に類似した特性の結果を明らかにしました。

図1及び2は、無傷の 、完全に水和したCOS-7細胞中で可視化QD655標識し、膜に結合したEGFRの代表的な画像を示します。 図1のAでDIC画像は、細胞の膜地形の印象を与え、 図1Bに対応する蛍光画像は、EGFビオチンのインキュベーションの3分後にEGFRの分布を示している。 図1AおよびBは、それぞれ 2から一緒に縫合されています40Xエア目的で記録された画像。 EGFはEGFRの細胞表面全体にわたって分布している活性化されます。ほとんどの細胞では、蛍光のわずかな増強（ 図1B）は、EGFR 20の局所的に増大した発生したことを示す、セル端部で見られます。同様のプロトコルを用いて行った対照実験（データは示されていない）特定のEGFR標識を検証しました。これらのコントロールが含ま：CEの以前のインキュベーションなし1）対照用標識EGF-ビオチンとLLS、 すなわち、STR-QDを持つ唯一のインキュベーション、および非ビオチン化EGFおよびSTR-量子ドットと2）のインキュベーション。 四角形でマークされた三つのセルは、さらに、ESEM-STEMで調査しました。 図1Cに示されているESEM-STEM像- Eは 、これらの細胞の低倍率の概要を示しています。これらの透過画像は、窒化シリコン（SiN）覗き窓を有するシリコンマイクロチップ上に配置されたセルの上に存在する水の薄い層を有する水和状態で全細胞を反映します。顕微鏡の真空チャンバは、水蒸気を含有し、試料温度と圧力との間のバランスは、細胞上の液体の薄層を維持するように調整しました。個々の細胞は、容易にSiN膜ウィンドウにその形状および位置のために認識することができます。低倍率ESEM-STEM像は、糸状仮足、隣接セルに向かってセル端から延びる、およびいくつかの構造などの微細構造を明らかにする薄いセル領域の内側。サンプルを通る伝送が使用されるエネルギー（30keVの）の電子に対しては不可能であるため、核を含む厚い中央の細胞領域が白く見えます。 高解像度のESEM-STEM像が薄く、周辺領域に記録されました。薄い液体層内の細胞の薄い領域中のナノ粒子のESEM-STEM用の空間分解能は、3ナノメートルに達するために、以前の研究6で決定しました。 図2（a）に示す 4つの高解像度画像- Dは図1Cに小さな長方形の位置で記録した- E.を使用倍率は明るく、弾丸形状のロッドに現れる、個々の量子ドットを識別するのに十分であった、個別にバインドされた各EGFR。 QD655は6×14 nmの2の典型的な寸法を有します。 矩形領域に対応する図2Aは、（Figuのセルに表示されています1C RE）膜上のQDラベルが画像を横切る斜め倍を示しています。この膜構造は、周囲の膜の領域よりも高いEGFR密度を有します。いくつかの場所では、2つのラベルが近接にありました。 20および24ナノメートルの距離の2つの例が矢じりで示されています。ラベルのこれらのペアは、EGFR二量体に属するものとして解釈される。 図2Bは 、EGFRの単量体および二量体も同様に見ることができ、細胞（ 図1D、左の長方形）の端から例を示します。 図2C（図1C、右の矩形）低い蛍光信号、 すなわち、下のEGFR密度の領域から記録しました。それにもかかわらず、EGFRも同様に二量体で、ここで発見されました。また、10または11のEGFRの二つのクラスタが存在していた（楕円を参照）。 図2Dは ​​、いくつかの単量体に加えて、5-6のEGFRなどの小さいクラスターを有する膜倍（ 図1E）の他の例を示していますそして、二量体。 このデータから得られる情報の種類の一例として、対相関関数21 G（x）は、図2中のすべてのラベルの位置について決定した。この分析は、このプロトコルの一部ではないことに注意し、手順を説明しました他の場所で6,7。 G（x）は、基準粒子から一定の半径方向の距離xの中に発見される粒子の可能性の尺度です。 G（x）= 1ランダムな分布を示し、大きい値は、クラスタリングの証拠です。 210ラベルの合計の位置が自動的に図2A-Dの4つの画像で検出された、およびg（x）は5nmのビンサイズ及び10nmの帯域幅を有する平滑化フィルタを用いて計算しました。 G（x）の曲線（ 図3）は、25nmの好ましい中心QDの距離を示しています。 EGFRには、このようにランダムに配向していないが、それらの大部分は、この好ましい距離で存在します。 approximatから電子分子モデル6（ 図3挿入図）私たちは、QDおよびEGF結合ポケットの中心間距離は〜14nmであり、EGFRにダイマーに取り付けられた2つの量子ドット間の中心間の距離に達すると推定しています（この値は、リンカーの柔軟性のために、数ナノメートルだけ変化する可能性がある）〜27nmであること。好適なラベル距離は方法の精度内でのEGFR二量体の予想ラベル距離とこのように一致しています。 G（x）の曲線は、データと一致したクラスタの存在を示す、最大300nmの距離を統一よりも大きいです。この分析は、EGFRの化学量論は、提案手法を用いて研究できることを示しています。 図4は 、標識は、EGF-QD800で行い、63X油浸対物レンズは、蛍光画像のために使用したことを除いて、図2と同様の結果を示しています。このデータは、これらの典型的な結果も発見されたときことを確認しますEGFRの標識は近い赤色スペクトルで発光する量子ドットを用いて行われている。 図4（a）は、代表的な細胞の蛍光画像である、 図4Bは、ESEM-STEMの概要モードと図4Cの同じセルが記録15万倍の倍率の画像であることを示していますセルの上位膜の境界で（ 図4Bの四角形を参照）。 図2AおよびDを図のように 、画像は、膜倍にQDで標識されたEGFRをキャプチャして、モノマー、ダイマー、およびクラスタ化された受容体を示しています。 〜5nmの彼らの小さいコアサイズ22と一致し、電子密度の高い量子ドットのコアは655 nmで発光する量子ドットのコアよりもやや小さく、丸く表示されていることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig1.jpg" /> 図1.相関DIC、蛍光およびEGF-QD655のESEM-STEMは、完全に水和したCOS-7細胞に、EGFRをラベル </st原形質膜の地形的な印象を与えるのSiN膜のウィンドウ領域上で増殖した細胞の&gt;（A）DIC画像を栄。 （B）（破線の長方形でマーク）中央に位置するのSiN膜ウィンドウ上の細胞を示す蛍光画像。 （C - E）三ESEM-STEM低倍率の画像A、B内の四角形でマークされた細胞から。これらの細胞概観画像が記録され、その後、高解像度画像の正確な位置を決定するのに役立ちます。 （ 図2A-Dに示されている）4つの高解像度画像の位置は、白い長方形のマークが付いています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig2.jpg" /> <stroNG&gt;図2.高解像度ESEM-STEM像は、膜結合のEGFRを描いた。 図1（b）にマークされた領域の75,000Xの倍率で（A）顕微鏡写真。多くのモノマーは、表示されます。いくつかの二量体は矢頭で示しています。 （B）、左の50,000X倍率で取得（C）画像、 図1Cにマークされ、それぞれの権利、膜の領域。 EGFRのクラスタは概説されています。 （D）図1Dにマークされた場所に50,000X倍率で記録した画像は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig2large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53186/53186fig3.jpg" /> 図3対相関関数g（x）の半径方向距離の関数がインターパルティについて決定xと<html>図2A-Dに検出されたすべての210のラベルのCLEの距離は25 nmでのピークは、Ag（x）は1に偶然を示し=なる中心QD距離は、ランダムより発生する非常に高い可能性を有することを示します。破線はラ​​ンダム分布の目表すG（x）のためのガイドです。挿入図は、ビオチンを介して結合した結合されたEGFおよびストレプトアビジンコーティングされた量子ドットとのEGFR二量体のおよその分子モデルを示します。 1stpのCPKモデルから得られたストレプトアビジン、EGFとEGFRのモデル（ストレプトアビジン）、1EGF（EGF）、1NQL、2JWA、1M17、1IVOと2GS6（EGFR）の構造のJmolバージョンで作成されたRCSBプロテインプロテインデータバンク、中12.2.15。 RCSBリガンドExplorerバージョン1.0に描かれたビオチンモデルである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> /53186/53186fig4.jpg &quot;/&gt; 図4.代表的なCOS-7細胞は、EGF-QD800で標識し、蛍光相関とESEM-STEMで撮像した。（A）蛍光画像、（B）低倍率の概要ESEM-STEM像。 （C）150,000X倍率でBにおける矩形の位置で記録された高解像度の画像。 、モノマー、ダイマー、およびクラスタのEGFRは、EGF-QD655での標識に似て検出されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53186/53186fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体(EGFR)の標識と、その後の水和状態の全細胞の相関光顕微鏡と電子顕微鏡法について説明しています。ラベルには蛍光量子ドットが含まれていました。このプロトコルは、EGFRの化学量論を単一分子レベルで研究するために使用できます。

This protocol describes the labeling of epidermal growth factor receptor (EGFR) on COS7 fibroblast cells, and subsequent correlative fluorescence ...

本実験の全体的な目的は、蛍光顕微鏡および電子顕微鏡を用いて、生存し水和状態にある細胞の細胞質膜における上皮成長因子受容体（EGFR）の分布と化学量論を可視化することである。まず、中央のウィンドウ領域に50 nmの薄い窒化シリコン膜が張られたマイクロチップ上で、cos sevenなどのEGFR発現細胞を培養する。次に、受容体に結合してEGFRの構造変化を誘発し、二量体化および活性化をもたらすビオチン化上皮成長因子を細胞にインキュベートする。次に、受容体を固定するために細胞を固定し、EGF活性化受容体に結合するストリップ済みのHagen結合量子ドットとともにインキュベートして、細胞をイメージングします。最後に、グルタルアルデヒドを用いて二度目の固定を行い、ストリップ済みのHagen結合量子ドットをEGFRと架橋させ、電子顕微鏡観察のためにサンプルを安定化させます。その結果、蛍光量子ドットイメージングによる赤色蛍光の発光と、走査透過電子顕微鏡によるEGFRの分布および化学量論的状態またはクラスター化が示されます。この手法は、完全細胞における膜受容体のストックジオメトリおよび分布に関する独自の情報を提供し、正常細胞およびがん細胞における上皮成長因子受容体の活性化に関する知見を得るために利用できます。また、イオンチャネルなどの他の膜受容体の研究にも適用可能です。まず、化学薬品用フード内で作業を開始します。窒化ケイ素膜マイクロチップの最初の調製ステップにおいて、プロトコルに従ってアセトンに浸漬した後、マイクロチップをエタノールの入ったビーカーに直接移し、2分間待ちます。その後、チップをエタノールから取り出し、クリーンルーム用ティッシュの上に置きます。チップが乾燥したら、あらかじめペトリ皿に置いてあったガラススライドの上にチップを移します。次に、皿にカバーをかけます。続いて、マイクロチップを載せたガラススライドをプラズマクリーナーに入れます。窒化シリコン膜の表面を親水化するため、5分間の標準洗浄プログラムを実行します。その後、ラミナーフローフード内で、ガラスからマイクロチップを移します。クリーンルーム用ティッシュの上に滑らせてから、poly L lysine溶液（PLL）を満たした24ウェルプレートのウェルに入れ、5分間インキュベートします。次に、マイクロチップを1つずつ、HPLCグレードの水が入った2番目のウェルに移し、さらに別の水のウェルで洗浄します。最後に、マイクロチップを個別にDMを満たした96ウェルプレートのウェルに入れ、COS 7細胞のサブカルチャーを用いて二酸化炭素インキュベーター内にプレートを設置します。濃度が約5 × 10⁵の単分散細胞懸濁液を調製します。1mLあたり5×10⁵個の細胞を用意します。96ウェルプレート内の各マイクロチップに細胞懸濁液を1滴ずつ加え、倒立顕微鏡下で室温にて5分間インキュベートします。150×400 µmの視野あたり約20〜30個の細胞密度になるよう、マイクロチップの観察領域を調整します。細胞が十分に接着したら、マイクロチップの細胞側を上にして、dmを含む新しいウェルへ注意深く移します。十分な数の細胞が接着していることを確認し、細胞側を上にしたまま、無血清dmmを含む新しいウェルへとマイクロチップを移します。その後、次ステップに向けて、マイクロチップを二酸化炭素インキュベーター内にて37 °Cで数時間から一晩インキュベートします。96ウェルプレートを用いて、各ウェルに必要な溶液を満たし、マイクロチップ1枚につき1行または1列を割り当てます。マイクロチップを新鮮なB-S-A-G-E-L-P-B-Sが入ったウェルに入れ、37 °Cで5分間インキュベートして洗浄します。その後、マイクロチップを300 nMのEGFビオチン溶液に移し、さらに3分間インキュベーターに戻します。これにより、細胞によるEGF標識EGFRのエンドサイトーシスが始まります。PBSを用いてマイクロチップを3回素早く洗浄します。次に、0.1 Mのcateバッファー（CB）でサンプルを洗浄します。続いて、マイクロチップを3% PFAに移し、10分間インキュベートします。CBで1回、PBSで3回洗浄した後、チップをG-L-Y-P-B-Sに移し、2分間インキュベートします。次に、PBSで2回洗浄します。その後、マイクロチップを10 nMのS-T-R-Q-Dに10分間浸し、B-S-A-P-B-Sで4回洗浄します。次に、室温のB-S-A-P-B-Sをあらかじめ満たした底面ガラス製35 millimeterディッシュにマイクロチップを1つ浸し、DICおよび蛍光顕微鏡で細胞を観察します。QD 6 55で標識された細胞の概要画像には、40 x 空中対物レンズを使用してください。量子ドットを340から380 nanometersで励起し、420 nanometers以上の波長で放出させるフィルターキューブを使用してください。サンプルの損傷を防ぐため、光強度は最小限に抑えます。QDの蛍光点滅（ブリンキング）に伴うすべての信号を捉えられるよう、露光時間を300ミリ秒以上に設定してください。光強度を最小限に抑えつつ、目に見えるノイズのない明るい画像が得られるように、光強度と増幅率を調整します。イメージング後、マイクロチップをB-S-A-P-B-Sを含む96ウェルプレートに戻します。cbで1回すすいだ後、2%グルタラールデヒドに転送し、さらに10分間インキュベートします。洗浄し、B-S-A-P-B-Sを用いてマイクロチップを3回洗浄します。マイクロチップごとに、B-S-A-P-B-Sをあらかじめ充填した新しい96ウェルプレートのウェルに保存します。4つのウェルが並ぶ1列に、HPLCグレードの水を満たします。テキストのプロトコルに従ってESEMをセットアップした後、冷却コンテナから96ウェルプレートを取り出し、開いたESEMステージの近くに配置して、pre-COOL ESEM STEMステージにサンプルをロードします。その横にクリーンルーム用ティッシュを用意してください。HPLCグレードの水で満たされたウェルにマイクロチップを1秒間ずつ4回浸し、迅速に洗浄します。マイクロチップの背面をティッシュで軽く拭き取り、3 µLの冷却済みHPLCグレード水が入った予冷ステージに設置します。サンプルの表面を濡らし、ステージにサンプルを固定してください。次に、サンプルの近くのステージ上に3 µLの水滴をさらに3滴滴下し、試料室を閉じます。テキストプロトコルに従い、目的の細胞を特定した後、その細胞のSTEM概観画像を記録し、細胞境界が見える細胞の周辺領域に移動して50,000倍に拡大します。個々のQDを示す画像を記録し、ピクセル滞在時間は20〜30マイクロ秒に設定します。ここに示しているのは、完全な水和状態のCOS 7細胞においてQD 655で標識された膜結合型EGFRです。こちらのDIC画像は細胞の膜トポグラフィーを示しており、対応する蛍光画像は、EGFビオチンを3分間インキュベートした後の細胞表面全体におけるEGFRの分布を示しています。これらの低倍率ESEM STEM画像では、細胞から隣接する細胞に向かって伸びる糸状仮足などの微細構造や、細胞の薄い領域内部のいくつかの構造が明らかになっています。核を含む細胞中央の厚い領域は、使用したエネルギーの電子では試料を透過できないため、白く表示されています。高解像度。周辺部のより薄い領域のESEM STEM画像では、画像を対角線上に横切る膜のひだの上にQDラベルが確認できます。この膜構造には、周囲の膜領域よりもEGFR密度が高い箇所が数か所あり、2つのラベルが近接していました。距離が20 nanometersおよび24 nanometersである2つの例を矢印で示しています。これらのラベルのペアは、EGF Fersに属するものと解釈されます。この画像は、EGFRの密度と蛍光信号が低い領域で記録されました。それにもかかわらず、ここでは二量体として存在するEGFRも見出され、10個または11個のEEGからなる2つのクラスターが存在していました。習熟すれば、試料調製は2時間以内に完了でき、電子顕微鏡で一般的に用いられる手法よりも大幅に高速です。その後のessem STEMイメージングでは、半日で最大100枚の高解像度画像を取得することが可能です。

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