Name: ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 学ぶラットを用いた出生前低酸素性虚血と羊膜内炎症による未熟児脳症モデルの構築法。この手法は感染と低酸素の両方の子宮内障害を再現し、神経学的欠損を引き起こす機序を解明する。

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著者はダンFirl、クリス・コルベットとジェシーデンソン、博士に感謝しています。資金は、ニューメキシコ大学のLJに、SRにNIH NINDS R01 NS060765によってLJにP30 CoBREパイロットプログラムと子の健康署名プログラムを用意しました。

両方のボストン小児病院、ニューメキシコ州健康科学センターの大学の制度管理使用委員会は、すべての実験手順を承認しました。 注：前の手順を開始する、シール、すべての手術器具および外科用ドレープを滅菌し、オートクレーブ。さらに、0.125％のbipivucaineおよび0.1mg / kgのブプレノルフィンを含む滅菌バイアルで術後の薬を準備します。また無菌リポポリサッカライド（LPS）溶液を調製：0.04 mg / mlのLPS（0111：B4）エバンスブルー色素を希釈含む滅菌生理食塩水中のを。 1.麻酔<ol><li>胎生18日（E18）3％イソフルランバランス70％の窒素と酸素30％の混合物を妊娠スプラーグドーリーラットに麻酔を誘導します。 </li><li>誘導チャンバーからラットを削除し、37℃に設定したドレープ手術用循環水の毛布の上にラット仰向けに置きます。ノーズコーンに麻酔を移し、isofluraを減らします2％のNEレベル。 </li><li>静かに角膜の乾燥を防ぐために、それぞれの眼に眼軟膏を適用します。手順の間に継​​続的に温度、呼吸数及び動物の心拍数を監視します。母体の生理は手順を通して安定のままであるべきです。 </li></ol> 2.外科準備とスクラブ<ol><li>小動物のバリカンを使用すると、下腹部にすべての毛を削除します。乳首をニッキングまたはライブ生まれた仔の将来の介護のために刺激を与えることができるかみそりの発疹の発生を回避するために注意して矩形のパターンで剃ります。 </li><li>滅菌綿棒でポビドンヨードおよび70％エタノールのスクラブのアプリケーションを交互に腹部の皮膚を準備します。ポビドンヨードおよび70％エタノールを交互に3回、それぞれに適用されるようにスクラブを繰り返します。乾燥してみましょう。 </li><li>つま先ピンチ反射の不在を経て、麻酔の深さを確認してください。痛みに反射し、刺激の非存在下では、1％にイソフルランレベルを下げます。 </li><li>無菌手術用タオルを使用して、動物をドレープ。彼らは子宮角への血流を妨げない一方で吸収洗浄流体の量を最大化するように、適切な角度でドレープを配置するように注意してください。 </li></ol> 3.腹部開腹<ol><li>メスを用いて調製腹部の皮膚の3センチ正中切開を行います。ぶっきらぼうにはさみで腹部の筋膜からスキン層を分析。鉗子および外科はさみを使用して、腹部の筋膜層を昇格し、腹膜腔へのアクセスを得るために、無血管白線の切開を行います。 </li><li>切開部の外側に手術用ガーゼを置き、滅菌生理食塩水で湿らせてから掃き入れます。腹部に鈍い鉗子や外圧を使用して、ゆっくりと腹腔から子宮角を除去し、湿らせたガーゼの上に配置します。 </li><li>慎重にもつれを回避し、腸にお問い合わせください。個々の羊膜嚢の間の唯一の筋肉組織を接触させることにより、ピンセットを用いて胎児を配置します。公開と鈍的切開を使用して、4子宮動脈を分離します。 注：ケアは、子宮動脈を分析するために取られなければなりません。周囲の組織と血管自体は非常にデリケートです。母体の血管への損傷は出血し、重症例では、胎児と母体の死を引き起こす可能性があります。 </li></ol> 4.配置瘤のクリップ<ol><li>各子宮動脈のラット30のG動脈瘤クリップを配置します。個々の胎盤を含む子宮血管の近位および遠位のパルス、および黒ずみなどの血流の停止を確認してください。ガーゼで露光角と全体外科分野をカバーし、滅菌生理食塩水で灌漑。灌漑ごとに約10分で湿ったフィールドを維持するように注意してください。 </li><li> 60分後、ガーゼを除去し、フィールドを灌漑。子宮角と血管が十分に成功したクリップを除去するために湿らせていることを確認します。静かに鉗子を使用して、各動脈瘤クリップを削除します。容器に外傷を起こさないように注意してください、とのmaint除去中AIN組織の整合性。 </li><li>徹底的羊膜嚢からガーゼの任意の浮遊スレッドを削除するように注意しながら、子宮角とフィールドを灌漑。 </li></ol>羊水嚢の中のリポ多糖の5インジェクション<ol><li>各個々の羊膜嚢の基部には、ちょうど、胎盤プレートの前方羊水の中に希釈したエバンスブルー色素とLPS（4μgの/ SAC）の100μLを注入します。注射のための最適な位置に各羊膜嚢を安定させ、回転させる鈍鉗子を使用してください。エバンスブルー色素を希釈し、適切な注射器の配置および注入を確認するのに有用である造影剤です。 注：羊膜内注射のための付属の8ミリメートル31 G針でのみを使用し、超微細0.3ミリリットルのインスリン注射器。大きなゲージの針を使用すると、慢性羊水損失、胎児死亡や妊娠の再吸収になります。注射器の取り外し時に羊水の漏れ少量のmitigすることができます羊膜嚢に直接圧力によってated。一部のラット胎児は、羊水過少の程度を許容することができます。しかし、大きなゲージの針で穿刺から急性羊水損失、または慢性液漏れが生じる偶発穿刺、胎児の損失の深刻なケースでは、結果、近隣の妊娠の喪失。 </li><li>ホーンは、滅菌生理食塩水で3回子宮を灌漑。 </li></ol> 6.開腹を閉じます<ol><li>鉗子を使用して、慎重に腹腔に子宮角を返します。羊膜嚢と正中切開、再おおよその実行3-0絹縫合糸を使用してmusculofascial層エッジ間の十分なスペースを確保。筋肉の切開を閉じながら羊膜嚢の配置に注意してください。嚢にまたはを介して縫合しないように注意してください。 </li><li>スキン層を閉じ、実行中の3-0絹​​縫合糸を使用して、スキン層を再近似します。 注：開腹を可能にするために、連続縫合の2層に閉じる必要があります皮膚や妊娠の増加に伴う筋肉の拡張のため。連続縫合糸は均等に分散創傷テンションを可能にします。多重ノットが刺激性で、簡単に麻酔から回復時にラットによって噛むことができるように結節縫合はあまり望まれています。外科用ステープルは、所望されていません。外科的な結び目の尾が非常に短い（&lt;3 mm）をカットする必要があります。 </li><li> 26 G針を使用して、0.125％ブピバカインを皮下巻き付けエッジの1ミリリットルを注入。首のうなじにブプレノルフィンを皮下/ kgで0.1 mgの1用量を投与します。 </li><li>イソフルランし、必要に応じてタオルドライしたラットの電源をオフにします。きれいなホームケージに置き、麻酔からの回復を監視します。ラットは低体温にならないことを確認してください。 </li></ol> 7.術後の回復とケア<ol><li>子犬が生まれされるまで（約E22またはE23）毎日、その後、ラットを72時間毎に8-12時間を監視し。ブプレノルフィンq8-12時間/ 72時間の追加の用量を投与またはIACUCによって決定されるようprnを。 </li><li>痛み、不快感、膣出血または手術部位からの出血の兆候がラットを監視します。縫合および切開を点検し、ラットが途中で彼らの縫合糸を咀嚼または削除されないように注意してください。非常に珍しいが、その縫合糸を侵害したラットは、創傷裂開のリスクがあります。 注：時々ラットは寝具や非食品の過剰な量を摂取することが、ブプレノルフィン投与の副作用として、パイカと呼ばれます。非常に珍しいが、ラットはパイカと潜在的な後続の腸閉塞のために監視する必要があります。 </li></ol> 8.組織処理および凍結切片化<ol><li>生後脳のヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）染色のために準備するために、生後2日目（P2）に自分のホームケージから子犬を削除します。手術用ハサミを使用すると、仔ラットを刎ねるとそっと頭蓋骨から脳を削除します。 </li><li>リン酸緩衝生理食塩水で4％パラホルムアルデヒドの7ミリリットルを含む15ミリリットルコニカルチューブに修正脳をドロップ（PBS）。 4℃で脳を置き、72時間固定します。 </li><li> 72時間後、30％スクロースを含む滅菌PBS溶液に脳を転送する（w / v）の、4℃に戻します。 注：脳はショ糖溶液中にドロップすると、彼らはクライオスタットに区分される準備ができています。 </li><li>急速に脳を凍結し、凍結した冠状断面を取得するためのクライオスタット乳棒でマウントします。 20μmの凍結した冠状切片を切断し、スライド上にマウントします。確認のセクションでは、連続的に収集されます。 </li><li>スライドを室温で一晩乾燥することができます。ストアを-20℃でスライドします。 </li></ol> 9.ヘマトキシリン​​＆エオシン染色<ol><li>スライドが凍結切片をマウントし、室温に戻してください。 注：新鮮なすべてのソリューションを準備します。 </li><li> 2時間50°Cまでのスライドウォーマーセットの上に置いてスライドします。 </li><li>転送は、染色ラックにスライドさせます。ディップは、二重蒸留脱イオン水（のddH 2 O）で10倍をスライド。 </li><li> 5分間、100％のヘマトキシリン​​でスライドをインキュベートします。チタン私は、ヘマトキシリン​​で紫色の染色の程度に応じて最適化することができます。 </li><li>ディップは、タップ、H 2 Oで4倍をスライドし、1分間きれいな水道H 2 O中に放置します。 </li><li>ディップ（250 mlの70％エタノール+ 1mlを濃塩酸）酸アルコールで15倍をスライド。 </li><li>ディップは、タップ、H 2 Oで4倍をスライドし、1分間きれいな水道H 2 O中に放置します。 </li><li> 2分間、1％の炭酸リチウムでインキュベートします。 </li><li>ディップは、タップ、H 2 Oで4倍をスライドし、1分間きれいな水道H 2 O中に放置します。 </li><li> 1分間、95％エタノール中でインキュベートします。 </li><li>ディップスライドを100％エオシンで7倍。エオシンでディップの数がピンクの染色の度合いに応じて変更することができます。 </li><li>ディップスライドを95％エタノール中で5倍。 </li><li> 95％のエタノールの新鮮な変化ディップスライド5倍。 </li><li> 1分間100％エタノール中でスライドをインキュベートします。 </li><li> 1分間100％エタノールの新たな変化でスライドをインキュベートします。 </li><li> 15分間、100％キシレンでスライドをインキュベートします。 注：キシレンのステップと封入は、ドラフト内で行う必要があります。 </li><li> 15分間のキシレンの新鮮な変化でスライドをインキュベートします。 </li><li>パーマウントでカバースリップし、ドラフト内で乾燥させてください。 </li><li>画像は、光学顕微鏡でスライドします。 </li></ol>

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<li>Uchida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Ureaplasma+parvum+lipoprotein+multiple+banded+antigen+on+pregnancy+outcome+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of Ureaplasma parvum lipoprotein multiple banded antigen on pregnancy outcome in mice.</a> J Reprod Immunol. 100, 118-127 Forthcoming.</li>
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著者らは、開示することは何もありません。

未熟児の脳症が原因傷害のメカニズムを重複病因、神経発達の時間経過、人間の脳のネットワーク形成の複雑さの複雑な相互作用の動物でモデル化することは困難であり、中枢神経系の多様な表現型は、ヒト早産児でマニフェスト侮辱します。 EOPは、特定の細胞型の脆弱性に関連している（ すなわち 、未成熟オリゴデンドロサイト）21だけでなく、多様な発生調節経路（ すなわちサブプレート、膜輸送体および受容体サブユニット）12,13,22。動物モデルはできるだけ人間の状態を複製しかし、重要な進展がなされ得ます。ここでは、モデルに灰色と白質の損傷と回復の両方のその後の評価を可能にする、早産児で観察されたCNS損傷のメカニズムの異質性を組み込んだ出生前侮辱を開発しました。ヒトでは、昇順細菌感染は、羊膜とprecipitaを弱めます前期破水をTE。さらに、胎盤灌流欠損は、胎盤のインタフェースを強調し、胎盤の恒常性を乱します。このように、胎盤underperfusionは子宮内感染のCNS損傷を化合物。紛れもなく、それは二重子宮を持っているとして、げっ歯類で絨毛羊膜炎の前に細菌感染を昇順の...

37週の推定妊娠期間1前にアメリカで生まれた乳児の12％以上では、未熟児の周産期脳損傷（PBI）は、永久的な障害の重要な原因です。未熟児からPBI、未熟児とも呼ばれる脳症（EOP）は、全体の中枢神経系（CNS）に影響を与えます。 CNS損傷は、多くの場合、 子宮内で開始し、絨毛羊膜炎や、低酸素症および敗血症などの合併症を含む出生後の出産前のプロセスによって悪化します。全身侮辱からPBIは、神経発達を変化させ、感情的な規制、メモリと実行機能1,2に影響を与え 、脳性麻痺、てんかん、認知遅延及び多数の神経精神障害につながります。多くの進歩がなされているが、限られた理解は、早産からCNS損傷の細胞および分子結果が早産で生まれている子供の神経学的後遺症の多くに変換する方法のまま。知識後肢の欠如リアルタイムのCNS損傷の重症度の診断や新興介入の通知投与者。また、この脆弱性の患者集団のための年齢に適切な治療戦略は、とらえどころのないまま。 子宮内炎症は、極端な未熟児では非常に一般的であり、3複雑な胎児母体の胎盤炎症カスケードを伴います。子宮内感染はしばしば無症状です。急性炎症、または組織学的絨毛羊膜炎と一致特定の胎盤所見は、胎児の炎症反応の主要な決定であり、早産3-5に関連した脳損傷と一致しています。実際、胎児の炎症反応は、早産からの長期転帰改善のための明確な臨床的意義を持っています。妊娠期間（SGA）のために小さいまたは感染を経験する人幼児は、神経学的欠損3,4に対して非常に脆弱です。絨毛羊膜炎は、一般的な病理診断以下の早産で<sup&gt; 6,7、および組織学的検査は、非常に早産4児の胎盤の70％に炎症の徴候を明らかにしています。さらに、絨毛羊膜炎は、2年8で認知機能障害と関連しています。非常に早産で生まれた乳児の胎盤における母体の血管underperfusionの証拠はまた、子供の頃9に脳性麻痺と関連しています。絨毛羊膜炎および胎盤灌流欠損の相乗影響はよく年齢10,11の2年間で、この患者集団における異常な神経学的転帰の非常に高いリスクによって示されています。 病原体によって誘発される炎症に関連する人間の全身胎盤灌流欠陥や絨毛羊膜炎を模倣するために、我々はラットで羊膜内リポ多糖（LPS）と組み合わせ出生前過渡全身低酸素虚血（TSHI）のモデルを開発しました。私たちの目標は、子宮内炎症が含まれるように、単独でラット12-16でTSHIの我々のモデルを適応させることでした早産に関連するCNS損傷の前臨床モデル化を容易にします。 TSHIだけではオリゴデンドログリア系細胞、皮質ニューロンの永続的な損失を明らかにした、出生前脳損傷16と一致してけがの段階的なパターンにつながる進行性の虚血性の間隔で、細胞死を増加させ、およびプロ炎症性サイトカインのレベルの上昇。彼らは17-19を老化としてこのモデルの虚血性の構成要素への変更は、メモリの符号化の欠損、短期および長期記憶とラットにおける軽度の筋骨格系の変化を示しました。実際、我々は以前にTSHI + LPSの組み合わせは、オリゴデンドロサイトおよびニューロン喪失、軸索損傷、細胞の炎症や機能異常20を含む EOPの病態生理学的特徴を、再現することが実証されています。

<table><tbody><tr><td>生理食塩水、0.9%</td><td>シグマ</td><td>S8776</td><td></td></tr><tr><td>LPS 011B4</td><td>シグマ</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>エバンス ブルー ダイ</td><td>シグマ</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>手術用手袋</td><td>バイオゲル</td><td>40870</td><td></td></tr><tr><td>またはタオル</td><td>カーディナル ヘルス</td><td>287000-008</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>PDI アルコール準備パッド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>06-669-62</td><td></td></tr><tr><td>ミニアルコ充電式クリッパー</td><td>ケントサイエンティフィックコーポレーション</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン手術用スクラブ</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>アイ潤滑剤</td><td>リフレッシュ ラクリ ルーブ</td><td>00023-0312</td><td></td></tr><tr><td>鈍い鉗子</td><td>Roboz</td><td>RS-8100</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Roboz</td><td>RS-6808</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>Roboz</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td>F.S.T.</td><td>14002-16</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>ニードル</td><td></td><td>BD 305122</td><td>25G 5/8</td></tr><tr><td>ニードル</td><td>BD</td><td>305128</td><td>30G 1</td></tr><tr><td>コットンチップ アプリケーター</td> フィ<td>ッシャーブランド</td><td>23-400-114</td><td>スモール、6 インチ滅菌</td></tr><tr><td>コットンガーゼスポンジ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-362-178</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ケントサイエンティフィック・コーポレーション</td><td>INS600109</td><td>12.5 CM STR</td></tr><tr><td>ベッセルクリップケン</td><td>トサイエンティフィックコーポレーション</td><td>INS600120</td><td>30G 圧力</td></tr><tr><td>3-0 パーマ ハンド シルク縫合糸</td><td>Ethicon</td><td>1684G</td><td>黒編みこみ、3-0 (2 メートル法)、18 インチ、非吸収性、&nbsp;PS-1 24 mmの針、3/8円</td></tr><tr><td>のインスリンの注射器</td><td>BD</td><td>328438</td><td>0.3 cc 3 mm 31G</td></tr><tr><td>ペントバルビタール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブピバカイン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>のリチウム炭酸塩</td><td>Acrosの化学薬品</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>のSuperfrost Plus顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン</td><td>ライカ</td><td>3801521</td><td>サージパス ギル II ヘマトキシリン</td></tr><tr><td>エオシン</td><td>ライカ</td><td>3801601</td><td>サージパス エオシン</td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャーブランド</td><td>X3S-4</td><td>組織学グレード</td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィッシャーブランド</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-548-5P</td><td>フィッシャーファイネストプレミアムカバーグラス</td></tr></tbody></table>

ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

未熟児の脳症（EOP）が最高の事前並進目標に。早産に関連する異常、中枢神経系（CNS）に含まれる用語であり、早産に関連した脳損傷のための新しい治療戦略を発見、EOPの前臨床モデルは、同様のメカニズムが含まれている必要があります出生前のグローバル傷害のヒトで観察され、母体の胎盤胎児システムの複数のコンポーネントを含みます。理想的には、モデルが成熟した動物において機能欠損の類似のスペクトルを生成し、病態生理学の複数の側面を再現する必要があります。人間の全身胎盤灌流欠損、胎盤underperfusionおよび/または早期早産で病原体誘発性の炎症に関連する絨毛羊膜炎を模倣するために、我々は、羊膜内リポ多糖（LPS）と組み合わせ出生前過渡全身低酸素虚血（TSHI）のモデルを開発しました。妊娠のSprague Dawleyラットにおいて、TSHI子宮動脈閉塞oを介してnは胎生18日（E18）は、胎児における増加CNS損傷に関連した段階的な胎盤underperfusion欠陥を誘発します。羊膜内LPS注射と組み合わせると、胎盤の炎症が増加し、CNS損傷は、関連する白質、歩行や画像異常に配合されます。出生前TSHIとTSHI + LPS出生前侮辱は、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよび軸索の喪失を引き起こし、子宮内侮辱を反復するなど、EOPモデルの基準のいくつかを満たす、サブプレートの喪失、および非常に生まれた子供で観察されたものを模倣成体動物における機能欠損早産。また、このモデルは、発散損傷の種類によって誘発される炎症の切開を可能にします。

E18でTSHI + LPSの後、ヘマトキシリンおよびエオシン染色は有意な組織病 ​​理学的胎盤両方の異常（ 図1）、脳内（ 図2）を明らかにする。 E19とE21を調べ胎盤は脱落膜と迷路を通してマイクロ出血、および壊死を伴う肉眼的浮腫です。著しい炎症性浸潤及び血管分布の増加も観察されます。 P2に調べた脳を脳室のほか、シャムに比べて白質とサブプレートニューロンの損失を明らかにしました。以前、我々はTSHI + LPSは炎症を誘発し、持続性の白質および若年成人20の大幅な運動障害との併用軸索異常をもたらすことを報告しています。 TSHI + LPSも大幅に、図3（P15で皮質において、塩化カリウム共輸送2（KCC2）タンパク質の発現、γアミノ酪酸の開発の中心と塩化共輸送（GABA）ERGIC阻害を減少させます</強い&gt;、* P &lt;0.05）。これらのデータは、回路の成熟の重要な出生後の期間中のKCC2の減損発達アップレギュレーションと一致しており、これらの知見は、CA3海馬13で...

未熟児の脳症は、早産による損傷に関連する中枢神経系の異常を包含します。 この報告では、絨毛膜羊膜炎を模倣する子宮内一過性全身性低酸素虚血および羊水内リポ多糖投与(LPS)の臨床的に関連するラットモデルと、感染性刺激と胎盤の灌流不足がCNSの発症に及ぼす関連する影響について説明します。

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

この手術手順の全体的な目的は、ラットにおける胎盤不全および絨毛膜羊膜炎を再現するために、子宮内で一過性の全身性低酸素症、虚血、および羊水内炎症を誘導し、極低出生体重児に伴う脳損傷の再現可能なモデルを提供することです。この手法は、子宮内プロセスから生じる周産期脳損傷の病態生理に関する重要な疑問への回答を導き出し、標的治療戦略の開発を促進するのに役立ちます。この技術の主な利点は、感染と低酸素・虚血の両方による子宮内侵害を模倣した全身性損傷を誘導し、成熟したラットに機能的な神経学的欠損を生じさせることができる点にあります。このモデルは、炎症に関連する損傷機序を解析するのに特に適しています。低酸素、虚血、および感染刺激を個別に、あるいは複合的な損傷としてテストできるため、本手順の実演は当研究室の技術者であるLindsey Chanが行います。手順を開始する前に、小動物用バリカンを使用して、胚齢日の下腹部領域からすべての毛を除去します。18匹の妊娠ラットを長方形のパターンに沿って剃毛し、乳頭を傷つけたりカミソリ負けを起こしたりしないよう注意します。次に、滅菌綿棒を用い、ポビドンヨードと70% ethanolを交互に3回塗布して皮膚を洗浄します。皮膚が乾燥したら、足指のピンチテストで適切な麻酔深度を確認し、動物をドレープで覆います。次に、メスを用いて動物の腹部正中線に3 cmの切開を加え、続いてハサミで皮膚層を腹膜筋膜から鈍的剥離します。ピンセットと外科用ハサミを使用し、腹膜筋膜層を挙上させ、血管のない線状の肘部分を切開します。腹腔を露出させた後、切開部の外側に手術用ガーゼを配置し、滅菌生理食塩水でガーゼを湿らせます。次に、鈍端鉗子を用いて腹部に外圧をかけながら、子宮角を腹腔から慎重に取り出し、湿らせたガーゼの上に並べます。腸との絡まりや接触を避けるよう注意しながら、個々の羊膜嚢の間にある筋組織のみを使用して胎児を配置してください。次に、鈍的剥離を用いて、4本の子宮動脈を露出させ、単離します。動脈を単離する際は、母体側の血管を損傷しないよう注意してください。各血管に30ゲージのラット用動脈瘤クリップを装着します。クリップを装着する前に、周囲の組織が完全に除去されていることを確認することが重要です。クリップを装着する際は、鈍的鉗子で固定してから平行に配置してください。すべてのクリップを装着した後、完全な低酸素虚血を確実にするために、脈拍の停止を確認することが極めて重要です。近位および遠位の脈拍の停止と、個々の胎盤を含む子宮血管の暗色化を確認してください。その後、手術野全体をガーゼで覆い、組織を滅菌生理食塩水で洗浄します。60分後から1時間の間、10分ごとにガーゼを取り除き、再度洗浄を行います。子宮角と血管が十分に湿ったら、血管に外傷を与えず組織の完全性を維持するように注意しながら、鉗子を用いて各動脈瘤クリップを慎重に除去します。その後、角と術野を十分に洗浄します。最後に、羊膜嚢から脱落したガーゼの繊維を取り除くよう注意してください。胎児にLPSを投与するには、鈍性鉗子を使用して各羊膜嚢を固定し、個々の羊膜嚢の基部が見えるように回転させます。次に、8 mmの31ゲージ針を装着した0.3 mLの超極細インスリン用注射器にLPS溶液を充填し、各胎盤プレートの直前に100 µLの溶液を注入します。針を抜く際、羊膜嚢に直接圧迫を加え、液漏れを防ぎます。羊膜嚢の基部に31ゲージの超極細針を挿入することは、羊水を漏出させずにLPSを適切に投与するために極めて重要です。滅菌生理食塩水で子宮角を3回洗浄した後、鉗子を用いて子宮角を腹腔内に戻します。次に、3-0シルク縫合糸を用いて、嚢に縫い込まないように注意しながら、筋膜層の端を連続縫合で接合し、続いて別の3-0シルク縫合糸で皮膚を連続縫合して閉じます。次に、26ゲージの針を用いて皮下に傷口の周囲に0.125% bupivacaineを1 mL注入します。必要に応じてラットの水分をタオルで拭き取り、項部にbuprenorphineを0.1 mg/kg注入します。動物を清潔なホームケージに入れ、完全に回復するまで観察します。胚齢18日における一過性の全身性低酸素虚血およびLPS投与後、先に示した通り、ヘマトキシリン・エオジン染色により胎盤と脳の両方に重大な組織病理学的異常が認められます。実際に、胚齢19日および21日に検査した胎盤では、脱落膜および迷路層全体に微小出血と壊死を伴う肉眼的な変化が見られます。また、顕著な炎症性浸潤と血管新生の増加も観察されます。生後2日目の脳をさらに調べたところ、シャム群と比較して、脳室拡大ならびに白質およびサブプレートニューロンの消失が認められた。また、一過性全身性低酸素、虚血、およびLPSにより、生後15日目の皮質におけるGABA作動性抑制の発達に不可欠なクロライドコトランスポーターであるカリウム・クロライド共輸送体2タンパク質の発現が有意に低下した。これは、回路成熟の重要な出生後期間に観察される発達上のアップレギュレーションの障害と一致している。このビデオを視聴することで、妊娠ラットにおける本手術の実施方法、および子宮動脈閉塞による胎児期の一過性低酸素虚血と、リポポリサッカライド溶液の子宮内注入による子宮内炎症の誘発方法について、十分な理解を得ることができる。適切に実施できれば、この手法を習得した後、90分で完了させることが可能である。

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JoVE Journal

Medicine

医学

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出典:Jantzie, L. L., et.alです。ラットの羊水内リポ多糖による出生前低酸素虚血を使用した未熟児の脳症のモデリング。J. Vis. Exp.

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