ラットにおける羊膜内リポ多糖で出生前低酸素性虚血を使用した未熟児のモデル化脳症

この外科的処置の全体的な目標は、子宮内、一過性の全身性低酸素症、虚血、および羊水内炎症の誘発を介して、極度の早産に関連する脳損傷の再現可能なモデルを提供することです。この方法は、子宮内プロセスから生じる周産期脳損傷の病因に関する重要な質問に答えるのに役立ち、指向性治療戦略の開発を促進します。この技術の主な利点は、感染と低酸素症の両方による子宮内傷害を模倣する全身性損傷を誘発することであり、虚血は成熟ラットに機能的神経学的欠損を引き起こします。

このモデルは、炎症に関連する損傷のメカニズムを解剖するのに特に適しています。低酸素症、虚血、感染性刺激は個別に、または複合的な損傷としてテストできるため、手順を実証するのは、私たちの研究室の技術者であるリンゼイ・チャンです。手順を開始する前に、小動物のバリカンを使用して、胎児の日の下腹部からすべての毛を取り除きます。

長方形のパターンで18妊娠中のラット、乳首を傷つけたり、かみそりの発疹を生成したりしないように注意してください。次に、滅菌綿棒を使用して、ポビドンヨウ素と70%エタノールを交互に3回塗布して皮膚をこすります。皮膚が乾いたら、動物をつま先でつまんでドレープすることで、適切な麻酔の深さを確認します。

次に、メスを使用して動物の腹部に3センチの正中線切開を行い、続いてハサミで腹部筋膜から皮膚層を鈍く解剖します。鉗子と手術用ハサミを使用します。腹部筋膜層を持ち上げ、無血管の線形肘を切開します。

腹腔が露出している場合は、切開部の外側に外科用ガーゼを敷き、滅菌生理食塩水でガーゼを湿らせます。次に、鈍い鉗子と腹部への外圧を使用して、腹腔から子宮の角をそっと取り除き、湿らせたガーゼの上に角を配置します。腸に絡まったり接触したりしないように注意しながら、個々の羊水嚢の間の筋肉組織のみを使用して胎児を配置します。

次に、鈍的解剖を使用して、4つの子宮動脈を露出させて分離します。動脈が分離されているときは、母体の血管を傷つけないように注意してください。各血管に30ゲージのラット動脈瘤クリップを配置しますクリップを適用する前に、周囲のすべての組織が完全に透明であることを確認することが重要です。

クリップを配置するときは、鈍い鉗子でemを固定してから、平行に配置します。脈拍の停止を観察することは、すべてのクリップが配置されたときに完全な低酸素虚血を確保するために重要です。近位および遠位のパルスの停止と、個々の胎盤を含む子宮血管の黒ずみを確認します。

次に、術野全体をガーゼで覆い、滅菌生理食塩水で組織を洗浄します。60分後に1時間、10分ごとにガーゼをはがし、再び畑を灌漑します。子宮の角と血管が十分に湿ったら、鉗子を使用して各動脈瘤クリップを優しく取り外し、血管に外傷を引き起こさないように注意し、組織の完全性を維持します。

次に、角と畑を徹底的に灌漑します。最後にもう一度、羊水嚢からガーゼの浮遊糸を取り除くように注意してください。LPSで胎児を治療するには、鈍い鉗子を使用して各羊膜嚢を安定させ、回転させて、個々の羊膜嚢の基部が見えるようにします。

次に、LPS溶液を取り付けた8ミリメートル31ゲージの針を取り付けた超微細な0.3ミリリットルのインスリン注射器を1つロードし、各胎盤プレートのすぐ前方に100マイクロリットルの溶液を注入します。針を取り外すときは、羊水嚢に直接圧力をかけて、液体の漏れを防ぎます。羊水嚢の基部に極細の31ゲージ針を挿入することは、羊水が逃げることなく適切なLPS送達のために重要です。

滅菌生理食塩水で子宮角を3回洗浄した後、鉗子を使用して角を腹腔に戻します。次に、ランニングスリーオハイオシルク縫合糸を使用して、サックに縫合したり袋を縫ったりせずに筋筋膜層の端を近似し、続いて別のランニング3.0シルク縫合糸で皮膚を閉じます。次に、26ゲージの針を使用して皮下投与します。

創傷縁の周囲に0.125%ブピバカインを1ミリリットル注入します。必要に応じてラットをタオルで乾かし、首のうなじにブプレノルフィン1キログラムあたり0.1ミリグラムを注射します。完全に回復するまで、動物を清潔なホームケージに入れ、監視します。

胚18日目の一過性の全身性低酸素虚血とLPS投与に続いて、ちょうど示したように、hetとエオシンの染色は、胎盤と脳の両方で重大な組織病理学的異常を明らかにします。実際、胚の19日目と21日目に検査された胎盤は、脱落膜と迷路全体で微小出血と壊死を伴って大量に放出されます。重大な炎症性浸潤および血管性の増加も観察される。

出生後2日目に検査されたさらに脳は、偽の一過性全身性低酸素症、虚血およびLPSと比較して、心室性マガリー、ならびに白質およびサブプレートニューロンの損失を明らかにし、塩化カリウム共輸送体2タンパク質の発現を有意に減少させました、出生後15日目の皮質におけるGABA作動性阻害の発達の中心的な塩化物共輸送体、 これは、回路成熟の重要な出生後の期間中に観察される発達のアップレギュレーション障害と一致しています。このビデオを見た後、妊娠中のラットでこの手術を行う方法と、リポ多糖溶液の羊水内注射による子宮内炎症を伴う子宮動脈閉塞による出生前の一過性低酸素虚血を誘発する方法についてしっかりと理解しているはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば90分で完了できます。