使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視

本実験の全体的な目的は、分泌型レポータータンパク質を用いて、小胞体カルシウム調節不全を時系列でモニタリングすることです。これは、標的組織（具体的には肝臓）へのウイルスベクターを介した導入によって達成されます。GaiルシフェラーゼCircaレポーターを用いたこの例では、組織から放出されるCircaの量を測定するために血液などの生体液を採取し、その後、血漿サンプルにルシフェラーゼ基質を添加して発光を測定することで、ERカルシウムの枯渇を判定します。

結果は、血漿C campのレベル上昇によって示されるERカルシウム調節不全を示しています。ER恒常性は、少量の生物学的流体を繰り返しサンプリングすることで、長期間にわたってモニタリングすることが可能です。低アフィニティカルシウム染料や遺伝子符号化カルシウムインジケーターなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、低侵襲な処置を通じて、in vivoでERカルシウム恒常性を経時的にモニタリングできる点にあります。この技術には2つの治療的な活用経路があります。

一つ目は、ERカルシウム恒常性を正常な生理的状態に維持または回復させることができる薬剤をスクリーニングすることです。二つ目のアプローチは、ERカルシウムの枯渇に反応して分泌が行われる治療用AMPとなるように治療用タンパク質を修飾することです。これらの手法により、肝臓におけるERカルシウム調節異常に関する知見が得られる可能性があります。

本手法は、脳、心臓、筋肉、膵臓などの他の器官系にも適用可能です。テキストのプロトコルに従ってSprague Dawleyラットを麻酔し、眼軟膏を塗布した後、尾部を挟んで麻酔状態を確認します。肋骨のわずか下から腹部中央領域までを剃毛し、ベタジンと70% ethanolを交互に用いて手術部位を3回洗浄します。次に、ラットを滅菌された手術領域の上に仰向けに配置し、滅菌手術用ドレープで覆います。a v gluc sampをユーザーが最適化した濃度まで希釈します。

本ケースでは、1 mLあたり7.6×10⁹個のウイルスゲノムを用い、チューブを転倒混和して混合しました。次に、希釈したAAV 105 µLを滅菌ディッシュに分注し、30ゲージの針を用いてシリンジにウイルスを回収します。メスを用いて、注射のために肝臓を露出させる標的切開部位をマークします。

肋骨縁の下に、長さ約2〜3 cmの水平切開を入れます。鈍的に剥離し、結合組織を皮下組織から分離します。腹筋を切開し、肝臓の右内葉を露出させます。

次に、動物を外科顕微鏡下に置き、肝臓の右中葉が視野に入るように調整します。その後、シリンジを用いて、ウイルスの全量の3分の1を右中葉の実質内の3か所に注入します。注入後、全量が確実に投与されるよう、針を5〜10秒間組織内に留めておきます。腹壁の筋肉と切開部を縫合し、綿棒を使用してネオスポリンを塗布します。ラットを回復室に入れ、意識が回復し、直立姿勢を維持できるようになったことを確認してから、個別のホームケージに戻します。

注入後4〜7日目。採血チューブにラベルを貼り、あらかじめ重量を量って準備します。次に、各チューブに 1000 units/mL のヘパリンを 50 µL 加えます。

本文のプロトコルに従ってラットを麻酔した後、尾をピンチして鎮静状態を確認し、滅菌済みハサミを使用します。尾の先端から約1〜2 mmの箇所を切断します。止血しながら、ヘパリンをあらかじめ注入したチューブに100 µL以上の血液を滴下して回収します。

濡らした綿棒を使用して、尾にSTICパウダーを塗布します。採取の間には、エタノールパッドでハサミを拭き、ビーズ滅菌を行ってください。血液採取チューブは4 °Cで保存します。

以降のサンプルを採取する場合は、採取チューブを計量し、血液とヘパリンの比率が2:1になるようにヘパリン量を調整します。この操作により、各サンプル中のヘパリン量が標準化されます。チューブを2000 ×g、4 °Cで5分間遠心分離します。

プラズマ上清を新しいチューブに移し、ルシフェラーゼアッセイにおける陽性対照としてthaa garinを投与するため、4°Cで最大72時間、または長期保存の場合は-80°Cで保存します。エタノールで最終濃度2.5 mg/mLまで希釈します。その後、下腹部から1 mg/kgを腹腔内注射します。

上記の手順に従い、投与から24時間後に最初の血液サンプルを採取します。発光を測定するため、テキストプロトコルに従ってSelenezine作動基質を調製し、遮光した状態で室温で30分間インキュベートします。

その間に、すべてのサンプルを氷上で解凍し、生物発光のモニタリングが可能で基質インジェクターを備えたプレートリーダーを用いて、血漿10 µLを不透明壁プレートに移します。基質でラインをプライミングします。ウェルに基質100 µLを注入します。

中速で5秒間振盪し、in vitroサンプルの光放出を測定します。読み取りステップでは0.5秒間で光放出を積分し、in vivoサンプルの場合は、ERカルシウム恒常性を評価するための読み取りステップにおいて5秒間で積分します。Gluc SAR Camp法を用いることで、今回のケースのようなGluc Noagなどの構成的に分泌されるレポーターなどの複数のコントロールを含めることができます。

実験条件に応じて、GLUC SAR campとGluc noagの両方の細胞外レベルが上昇した場合は、曖昧な結果であると考えられます。しかし、Gluc noagに反応がなく、gluc SAR campの分泌のみが増加した場合は、小胞体（ER）カルシウム依存的なイベントであることを示唆します。新規のパラダイムにおいて、SAR camp放出に対するERカルシウムの寄与を確認するために、ERカルシウムストアの薬理学的モジュレーターを利用することができます。

例えば、ここで実証されているように、ERカルシウムを安定化させるINE受容体拮抗薬であるdantroleneは、thic argonに反応したSAR campの放出を抑制します。glucベースのSAR campを用いたin vitro研究では、処置による反応は時間経過に沿って評価するのが最適です。プレート内での対照群に対する相対的な反応の変化を追跡するため、基質の分解がraw値の変化につながる可能性のある複数のプレート間でraw数値を比較することは推奨されません。in vivo研究では、各個体を事前処置の対照として扱い、個体ごとに独立してデータを評価する必要があります。

これは、個体間におけるトランスジェンの導入および発現のばらつきを考慮するために必要です。このビデオを視聴することで、肝疾患のげっ歯類モデルにおいてERカルシウム調節を調査するためのsircam技術の活用方法について、十分な理解が得られるはずです。ウイルスベクターを取り扱う際は非常に危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具を着用するなどの予防策を常に講じてください。