Name: 使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視ガウルシフェラーゼSERCaMP (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ小胞体カルシウム恒常性のモニタリング法。ガウシアルシフェラーゼSERCaMPを用いて、肝臓組織でウイルスベクター導入後、血液サンプルのルミネッセンス測定によりカルシウム異常を検出します。最小侵襲で長期的な観察が可能です。

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この作業は、国立薬物乱用研究所の学内研究プログラムの支援を受けました。 この手法の開発に貢献してくださった Doug Howard、Chris Richie、Lowella Fortuno、Josh Hinkle に感謝します。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは 、インビトロを強調し、GLUC-SERCaMPの生体ユーティリティで、ERカルシウムの枯渇をモニターします。 SERCaMPを生成するタンパク質修飾は、他のレポータータンパク質12に一般に見えますが、我々は他のルシフェラーゼ18と比較して（200〜1,000倍以上）の強固な生物発光のためのガウシアルシフェラーゼを選択しました。私たちは、初代ラット皮質ニューロン、SH-SY5Y細胞、およびラットの肝臓（ 図3、図4）に配信GLUC-SERCaMPウイルスの100倍の用量範囲にわたって検出可能タプシガルギン誘発性GLUC-SERCaMPリリースを示しています。我々は以前GLUC-ASARTDLを発現する安定にトランスフェクト細胞株の生成を記載し、5×10 4の非標識細胞の集団のようにいくつかの20個の細胞が応答12を誘発しタプシガルギンを報告できることを実証しました。ここでは、安定な細胞株は、一貫して15継代、最もアナライザーに出T...

タンパク質の折り畳み、タンパク質分泌、脂質ホメオスタシス、および1の細胞内シグナル伝達を含む多くの細胞容量の小胞体（ER）機能。通常のER機能の中心は〜5000倍細胞質2-4に見られるもので、管腔のカルシウム濃度を維持しています。このエネルギー集約的なプロセスはsarco /小胞体カルシウムATPアーゼ（SERCA）、ERへのカルシウムイオンを移動させるポンプによって調整されます。 ERからのカルシウムの流出は、主としてリアノジン（のRyR）およびイノシトール三リン酸（IP3R）受容体によって媒介されます。多くのERプロセスは、カルシウムに依存しているので、店を中断すると、小胞体ストレスと最終的に細胞死につながることができます。 ERのカルシウム調節不全は、心筋症、糖尿病、アルツハイマー病、およびパーキンソン病を含む5において観察されています。これらの疾患の進行性の性質のために、それは因果再描写するために挑戦されています小胞体カルシウムストアの病因および変更の間lationship。多くの技術は、染料および遺伝的にコードされたカルシウム指標（GECIs）を含む、ERカルシウム動態の理解における大きな進歩のために許可されています。 Ca 2+と結合すると蛍光の増加低親和性のカルシウム色素は、カルシウム6の高濃度の細胞内コンパートメントを調べるために、細胞内にロードすることができます。このようD1ERと捕手としてGECIs、細胞内局在7-9のより正確な制御とカルシウムの変動の監視を可能にします。最近、GECIsの別のクラスは、カルシウム測定オルガネラ封入タンパク質指標（CEPIA）は10に記載されていると呼ばれます。遺伝学とエステル系カルシウム色素11（ERに標的化）遺伝的にコードされたカルボキシルエステラーゼを利用する小分子の化学的性質を標的エステラーゼされる色素充填（TED）を組み合わせた第三のアプローチ。 aforながらementionedアプローチは彼らが蛍光の急性測定によって、ERカルシウム動態に貴重な洞察を提供することができ、固有の長所と短所を持っています。これらは、しかしながら、多くの場合、疾患の進行を調査するために必要な縦断的研究のために最適ではありません。長時間にわたりカルシウム動態を監視するための方法を考案することを目的として、我々は、タンパク質（SERCaMPs）12を監視し 、分泌小胞体カルシウムを作成するために、タンパク質修飾を特定し、開発しました。 SERCaMPを繰り返し、ERカルシウムストアを調べるために低侵襲的アプローチを提供することによって、他の方法に関連したいくつかの制限を回避します。我々は以前に、カルボキシ末端ペプチドASARTDL（アラニン、セリン、アラニン、アルギニン、トレオニン - アスパラギン酸 - ロイシン）がER保持を促進するのに十分であることを実証しました。しかしながら、ERカルシウムの減少を引き起こす条件下で、ペプチド配列は、もはやER localizatioを保持することができませんnと、タンパク質が13分泌されます。 SERCaMP技術の基礎は、分泌タンパク質のカルボキシ末端の分泌は、このように、ERのカルシウム調節不全12の強固なレポーターを作成し、小胞体カルシウム枯渇によってトリガーされるように（例えば、 ガウシアルシフェラーゼ 、またはGLUC）にASARTDLの付属物です。トランスジェニック方法によるGLUC-SERCaMPの発現は、ERカルシウム恒常性の指標としてGLUC活性の変化について分析される細胞培養培地および血漿などの生体液を可能にします。この方法は 、インビトロおよびインビボの両方のERカルシウムストアの進行変化の縦断的研究のための用途を有します。以下のプロトコルは、ERカルシウム恒常性を研究するためにGLUCベースSERCaMPを使用するための一般的なアウトラインとして書かれているが、このプロトコルは、代替レポーターSERCaMPsためのガイドとして機能することができます。

<table><tbody><tr><td>1.5mlチューブフィ</td><td>ッシャー&nbsp;</td><td>02-682-550</td><td></td></tr><tr><td>10% NP-40 溶液&nbsp;</td><td>細胞内GLucアッセイ用</td><td>ピアス</td><td>28324</td></tr><tr><td>1mlルアーロックシリンジ</td><td>フィ</td><td>ッシャー14-823-30</td><td></td></tr><tr><td>200マイクロリットルフィルターチップ</td><td>レイニン</td><td>RT-L200F</td><td></td></tr><tr><td>3-0外科用縫合糸</td><td>フィッシャー</td><td>NC9598192</td><td></td></tr><tr><td>30G針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-821-13A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>接着マイクロプレートシーリングシート</td><td>サーモ</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>アルコール準備パッドフィ</td><td></td><td>ッシャー22-246-073</td><td></td></tr>麻酔<tr><td>オートフローシステム</td><td>E-Z麻酔</td><td>EZ-AF9000</td><td></td></tr>動物<tr><td>回復室</td><td>リヨン獣医</td><td>ICU-912-004B27</td><td></td></tr><tr><td>サプリメント</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ17504-044</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン溶液</td><td>フィッシャー</td><td>NC9386574</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>クロロックス</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>ウシ成長血清</td><td>サーモ</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr>セ<tr><td>レンテラジン、ネイティブ</td><td>レジステクノロジー</td><td>ズ1-361204-200</td><td></td></tr>綿<tr><td>チップアプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>カッティングニードル3/8サークル縫合WPI</td><td></td><td>501803</td><td></td></tr><tr><td>デジタル超音波洗浄剤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FS60D</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース、GlutaMAX、ピルビン酸</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>DNA mass ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10496-016</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase (recombinant protein)</td><td>Nanolight</td><td>321-100</td><td></td></tr><tr><td>Gaussia luciferase antibody (for WB, ICC, or IHC)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E8023S</td><td>1:2,000(WB)</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>CellPoint Scientific</td><td>DS-401</td><td></td></tr><tr><td>Glucアッセイプレート(96ウェル、不透明)</td><td>Fisher</td><td>07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution</td><td>Life Technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Allmedtech</td><td>63323-276-02</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>ButlerSchein</td><td>29404</td><td></td></tr><tr><td>Ketamine</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>Kwik Stop Styptic powder</td><td>Butler Schein</td><td>5867</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Σ</td><td>G8540</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロフュージ 22R 遠心分離機</td><td>ベクマン コルター</td><td>368831</td><td></td></tr><tr><td>ネオスポリン</td><td>フィッシャー</td><td>19-898-143</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Stereoscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ745T</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin Gel and PCR Cleanup</td><td>Machery-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet</td><td>Rainin</td><td>L-200XLS+</td><td></td></tr><tr><td>p24 Lenti-X rapid titer kit</td><td>Clontech</td><td>632200</td><td></td></tr><tr><td>PCR フィルムシール</td><td>フィ</td><td>ッシャーAB0558</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ15140-122</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>シグマ</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>リフレッシュチャコールフィルターキャニ</td><td>スターE-Z麻酔</td><td>EZ-258</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃、#10</td><td>ファインサイエンスツール株式会社</td><td>10010-00SD</td><td></td></tr><tr><td>ラット150-200グラム</td><td>チャールズリバー</td><td>ラット</td>ラット<td>は150-200gで注文しました。&nbsp;到着後5日間の手術</td></tr><tr><td>小動物の耳タグ</td><td>ナショナルバンドとタグco</td><td>1005-1</td><td></td></tr><tr><td>滅菌外科用ドレープ</td><td>Braintree Scientific</td><td>SP-MPS</td><td></td></tr><tr><td>Synergy 2 プレートリーダー</td><td>BioTek</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan ユニバーサル PCR マスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>Thapsigargin</td><td>Sigma</td><td>T9033</td><td>有害人間の健康</td></tr><tr><td>Virapowerレンチウイルス包装ミックス</td><td>ライフ</td><td>テクノロジーK4975-00Xfect</td><td></td></tr><tr><td>トランスフェクション試薬</td><td>Clontech</td><td>631318</td><td></td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バレー獣医</td><td>468RX</td><td></td></tr></tbody></table>

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼsercamp

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

小胞体（ER）は、細胞質のレベルよりも約5,000倍高い濃度で細胞内カルシウムの最高レベルを、含まれています。 ERカルシウムを厳格にコントロールは、タンパク質の折り畳み、修正や人身売買のために不可欠です。 ERカルシウムの摂動は、小胞体ストレス応答、三つ又のERストレス応答機構の活性化をもたらす、および種々の疾患で病因に寄与することができます。疾患の発症と進行の間に、ERカルシウムの変化を監視する能力は、実際にはまだ挑戦的、原理的には重要です。現在、このようなカルシウム依存性蛍光色素やタンパク質などERカルシウムを監視するための利用可能な方法は、細胞内の小胞体のカルシウム動態への洞察を提供してきたが、これらのツールは、in vivoでの研究のためにはあまり適していません。私たちの研究室では、 ガウシアルシフェラーゼのカルボキシ末端への変更は、に応じて、レポーターの分泌を与えることを実証しました小胞体カルシウム枯渇。 インビトロ及びインビボ用途においてルシフェラーゼベースの分泌ERカルシウム監視タンパク質（SERCaMP）を使用するための方法は、本明細書中に記載されています。このビデオでは、ERカルシウムの長手方向の監視のために肝臓の注射、GLUC-SERCaMP、血液収集および処理の薬理学的操作、およびアッセイパラメータを強調しています。

GLUC-SERCaMP方法は、細胞外液をサンプリングすることにより、ERカルシウム恒常性の評価が可能になります。いくつかのコントロールは、結果の解釈を強化するために実験計画に含めることができます。まず、（C末端ASARTDLまたは「GLUC-タグはありません」なし例えば GLUC）構成的に分泌されたレポーターの使用は分泌経路（グローバル細胞分泌）および導入遺伝子発現に関する実験治療の効果を評価するために使用することができます。例えば、GLUC-SERCaMPとGLUC-NOタグの両方の細胞外レベルの増大はあいまい結果と考えられます。また、GLUC-、タグの応答の対応欠如とGLUC-SERCaMP分泌の増加は、ERのカルシウム依存性イベント（ 図8）をサポートしています。溶解が必要とされるように、これは、単一の時点に制限されているが、ERカルシウムの枯渇に応答しGLUC-SERCaMPの分泌はさらに、細胞内GLUCを測定することによって評価することができます。 int型<html> racellular GLUC-SERCaMPは、それが徐々に分泌されるように、小胞体カルシウム枯渇に...

小胞体カルシウムの恒常性は、さまざまな病状で破壊されます。 分泌型小胞体カルシウムモニタリングタンパク質(SERCaMP)レポーターを使用して、小胞体カルシウム貯蔵の混乱を検出できます。 このプロトコルは、小胞体カルシウムの恒常性をin vitroおよびin vivoで調べるためのGaussia luciferase SERCaMPの使用について説明しています。

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視<em&gt;ガウ</em&gt;ルシフェラーゼSERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

本実験の全体的な目的は、分泌型レポータータンパク質を用いて、小胞体カルシウム調節不全を時系列でモニタリングすることです。これは、標的組織（具体的には肝臓）へのウイルスベクターを介した導入によって達成されます。GaiルシフェラーゼCircaレポーターを用いたこの例では、組織から放出されるCircaの量を測定するために血液などの生体液を採取し、その後、血漿サンプルにルシフェラーゼ基質を添加して発光を測定することで、ERカルシウムの枯渇を判定します。結果は、血漿C campのレベル上昇によって示されるERカルシウム調節不全を示しています。ER恒常性は、少量の生物学的流体を繰り返しサンプリングすることで、長期間にわたってモニタリングすることが可能です。低アフィニティカルシウム染料や遺伝子符号化カルシウムインジケーターなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、低侵襲な処置を通じて、in vivoでERカルシウム恒常性を経時的にモニタリングできる点にあります。この技術には2つの治療的な活用経路があります。一つ目は、ERカルシウム恒常性を正常な生理的状態に維持または回復させることができる薬剤をスクリーニングすることです。二つ目のアプローチは、ERカルシウムの枯渇に反応して分泌が行われる治療用AMPとなるように治療用タンパク質を修飾することです。これらの手法により、肝臓におけるERカルシウム調節異常に関する知見が得られる可能性があります。本手法は、脳、心臓、筋肉、膵臓などの他の器官系にも適用可能です。テキストのプロトコルに従ってSprague Dawleyラットを麻酔し、眼軟膏を塗布した後、尾部を挟んで麻酔状態を確認します。肋骨のわずか下から腹部中央領域までを剃毛し、ベタジンと70% ethanolを交互に用いて手術部位を3回洗浄します。次に、ラットを滅菌された手術領域の上に仰向けに配置し、滅菌手術用ドレープで覆います。a v gluc sampをユーザーが最適化した濃度まで希釈します。本ケースでは、1 mLあたり7.6×10⁹個のウイルスゲノムを用い、チューブを転倒混和して混合しました。次に、希釈したAAV 105 µLを滅菌ディッシュに分注し、30ゲージの針を用いてシリンジにウイルスを回収します。メスを用いて、注射のために肝臓を露出させる標的切開部位をマークします。肋骨縁の下に、長さ約2〜3 cmの水平切開を入れます。鈍的に剥離し、結合組織を皮下組織から分離します。腹筋を切開し、肝臓の右内葉を露出させます。次に、動物を外科顕微鏡下に置き、肝臓の右中葉が視野に入るように調整します。その後、シリンジを用いて、ウイルスの全量の3分の1を右中葉の実質内の3か所に注入します。注入後、全量が確実に投与されるよう、針を5〜10秒間組織内に留めておきます。腹壁の筋肉と切開部を縫合し、

monitoring-endoplasmic-reticulum-calcium-homeostasis-using-gaussia

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは、蛍光イメージングによるミトコンドリアのカルシウムフラックスのリアルタイム測定のための方法を説明します。方法は、選択的にミトコンドリアで発現する循環permutated YFPベースのデュアル励起レシオメトリックカルシウムセンサー（レシオメトリックpericam -...

遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

小胞体は、タンパク質の生合成とカルシウムの恒常性において重要な役割を果たしている。私たちは、私たちはCa2 +のリークチャネルの役割に対処し、それらの推定調節機構を特徴づけることを可能にする実験系を確立しています。このシステムは、siRNAを介した遺伝子サイレンシングと生細胞のCa2...

siRNAを介した遺伝子サイレンシングと組み合わせることで生細胞のカルシウムイメージングでは、CAを識別 2 + ER膜のリークチャネルとその調節機序

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

出典: Bannai, H., et al., Dissection of Local Ca2+ signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp.

アストロサイトにおけるコンパートメント特異的ダイナミクスのための自発的カルシウムイメージング

標的と-エステラーゼ誘導し染料ロード（TED）は、蛍光イメージングによる細胞内カルシウムストアのダイナミクスの解析をサポートしています。それは合成の低親和性のCaローカルマスキングを改善し、小胞体（ER）に換えカルボキシルエステラーゼの標的に対するメソッド拠点...

ターゲット-エステラーゼ誘起染料の読み込み（TED）とERカルシウムの直接イメージング

現在、ほとんどの利用可能なカルシウム指標は、培養平滑筋細胞の筋小胞体から放出されるカルシウムの間接的な測定値として、細胞質のカルシウム過渡現象を定量化するために使用されています。このプロトコルは、筋小胞体内腔内のカルシウムシグナルの直接測定を可能にする特定のFRETベースのインジケーターの使用を説明しています。...

FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

我々は、リアルタイム蛍光顕微鏡法を用いて、HEK293および骨格筋C2C12細胞の小胞/筋小胞体（ER / SR）における急速なカルシウム過渡状態をモニタリングするための、標的遺伝子操作されたカルシウムインジケータ（GECI）CatchER + in situ K d測定および較正のためのプロトコルについても議論する。...

目標とするCaを用いたER / SRカルシウム放出のモニタリング<sup&gt; 2+</sup&gt;センサーキャッチャー<sup&gt; +</sup

このプロトコルは、アブラムシなどの半翅目昆虫の摂食によって生成される植物のカルシウム信号の分析のための簡単な方法をについて説明します。シロイヌナズナを用いたGFP カルシウム センサー GCaMP3...

リアルタイム体内シロイヌナズナカルシウム信号の間に記録して蛍光バイオ センサーを用いた昆虫の餌

ここで Ca2 +イメージング ニューロンとグリア細胞内 Ca2 +シグナル細胞レベル下の解像度での解剖を可能にするためのプロトコルを提案する.このプロセスは、遺伝子にエンコードされた Ca2...

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

このプロトコルでは、ウイルスに感染したヒト腸オルガノイドでカルシウムイメージングを行うためのアプローチを説明し、分析へのアプローチを提供します。...

遺伝子コードされたカルシウムインジケーターを用いたウイルス感染ヒト腸オルガノイド単分子膜のライブカルシウムイメージング

私たちは、生細胞の小胞体-ミトコンドリア接触をモニターするためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイを確立しました。このアッセイを用いて、化学処理の条件下で、HEK293T細胞内のこれらのオルガネラ間カップリングのレベルを定量的に測定するプロトコールを記載します。...

生細胞における小胞体-ミトコンドリア接触を測定するためのスプリットルシフェラーゼ再構成アッセイ

学ぶ小胞体カルシウム恒常性のモニタリング法。ガウシアルシフェラーゼSERCaMPを用いて、肝臓組織でウイルスベクター導入後、血液サンプルのルミネッセンス測定によりカルシウム異常を検出します。最小侵襲で長期的な観察が可能です。

使用して小胞体カルシウムの恒常性の監視

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